全 文 ：银黄制剂的 HPLC2ELSD 指纹图谱研究
赵 　刚1 ,2 ,杜 　玮1 ,2 ,魏玉辉1 ,姚小军3 ,武新安1 3
(1. 兰州大学第一医院 药剂科 ,甘肃 兰州 　730000 ; 2.兰州大学药学院 ,甘肃 兰州 　730000 ;
3.兰州大学化学化工学院 ,甘肃 兰州 　730000)
摘 　要 :目的 　建立稳定可控的银黄制剂的 HPLC2EL SD 的指纹图谱 ,探讨主成分分析法和聚类分析法在中药制
剂指纹图谱中的应用。方法 　用梯度洗脱法对样品进行 HPLC2EL SD 测定 ,且采用聚类分析和主成分分析法对不
同厂家和批次的样品图谱进行化学模式识别研究。结果 　建立的银黄制剂指纹图谱表征了不同厂家和批次的制
剂之间的客观差异。结论 　聚类分析和主成分分析法能有效地应用于是银黄制剂的指纹图谱分析 ,为有效的控制
该制剂的质量提供评价依据。
关键词 :银黄制剂 ;指纹图谱 ;聚类分析法 ;主成分分析法 ;质量控制
中图分类号 :R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0721053204
HPLC2ELSD Fingerprints of Yinhuang preparations
ZHAO Gang1 ,2 , DU Wei1 ,2 , WEI Yu2hui1 , YAO Xiao2jun3 , WU Xin2an1
(11 Department of Pharmacy , the First Hospital of Lanzhou University , Lanzhou 730000 , China ; 21 College of Pharmacy ,
Lanzhou University , Lanzhou 730000 , China ; 31 College of Chemist ry and Chemical Enginnering ,
Lanzhou University , Lanzhou 730000 , China)
Abstract : Objective 　To evaluate t he quality of Yinhuang preparations effectively and develop a credi2
ble method for the quality cont rol of Chinese materia medica1 Methods 　Fingerp rint s of different Yinhuang
preparations were obtained by HPL C2EL SD met hod1 The technique of p rojection discriminate st udy based
on hierarchical cluster analysis and principal component analysis was applied to investigate t he experimen2
tal data1 Results 　The developed fingerp rint s showed that there were differences among the Yin2huang
preparation by different manufact urers1 Conclusion 　This method using the hierarchical cluster analysis and
principal component analysis could be effectively applied to the quality control of Chinese materia medica1
Key words : Yinhuang preparations ; fingerp rint s ; hierarchical cluster analysis ; p rincipal component
analysis ; quality cont rol
　　银黄制剂是将黄芩与金银花药材经提取、浓缩
和滤过等工艺制备而成 ,具有抗菌、清热解毒、消炎、
退热等功效 ,用于上呼吸道感染、急慢性扁桃体炎、
咽喉炎等症的治疗[1 ] 。现已有口服液、颗粒、片剂等
多种剂型应用于临床。目前文献报道多采用紫外分
光光度法[2 ] 、毛细管电泳法[3 ] 、薄层扫描法[4 ] 和
H PL C 法[5 ,6 ]等方法测定银黄制剂中的绿原酸和黄
芩苷作为质量控制标准。但是由于金银花和黄芩富
含黄酮类和皂苷类等多种化学成分[7～10 ] ,仅测定其
中两种成分不能全面客观地反映其内在的质量标
准。中药指纹图谱技术包含信息量大 ,是表征中药
复杂成分与其内在质量关系的有效手段[11～13 ] 。为
了全面控制其质量 ,本实验建立了银黄制剂的
HPL C2EL SD 指纹图谱 ,对银黄制剂中有效成分进
行全面综合分析 ,并利用聚类分析和主成分分析法
对图谱进行化学模式识别 ,无需对化学成分进行定
量 ,即可准确、有效地对中药制剂进行质量评价 ,为
更好地控制中药制剂提供了简单可靠的分析方法。
1 　仪器与试药
　　岛津 L C —20A T 二元梯度泵 ,SPD —M20A 二
极管阵列检测器 ,D GU —20A 在线脱气系统 ,SIL —
20A 自动进样系统 , CTO —20A 柱温箱 ,L C solu2
tion 色谱工作站 (日本岛津公司) ,Alltech —2000 ES
蒸发光散射检测器 ( Alltech ,美国) ,N3000 色谱工
·3501·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
3 收稿日期 :2008211216　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :赵　刚 (1981 —) ,男 ,陕西西安人 ,硕士 ,从事中药制剂质量控制和体内药物分析研究 ,在该领域已发表论文 6 篇。
Tel :13572257499 　E2mail :weidu82 @1631com3 通讯作者　武新安
作站 (浙江大学) , XW K—Ⅲ无油空气泵 (天津市华
生分析仪器厂) 。SHZ —Ⅲ型循环水真空泵 (上海亚
荣生化仪器厂) ,高速离心机 (深圳国华仪器厂) 。
　　绿原酸、黄芩苷对照品 (中国药品生物制品检定
所) ;乙腈为色谱纯 ,其他试剂均为国产分析纯 ,去离
子水。
　　银黄口服液分别购自陕西白鹿药业有限公司
(A ,批号 060152、060327、060716、060834 ,No11～4) 、
山西太行药业股份有限公司 (B , 批号 050503、
060102B、060304A、060601 ,No15～8) 、湖北太子药业
(C ,批号 051103、060503、06060060802 ,No19～12) ;银
黄颗粒购自西安交大药业有限公司 (D ,批号 051101、
060202、060203、060403、060906 ,No113～17) 。
2 　方法和结果
211 　色谱分析条件
21111 　HPL C 条件 : Cosmosil2C18 (150 mm ×416
mm ,5μm) ;流动相 :1 %醋酸 (A) 和乙腈 (B) 二元梯
度系统 ,采用梯度洗脱 , 0～10 min ,10 %～18 % B ,
10～15 min , ,18 % B ,15～26 min ,18 %～28 % B ,
26～30 min ,28 % B ,30～40 min ,28 %～60 % B ,
40～65 min ,60 %～100 % B ,65～80 min ,100 % B。
检测波长 :276 nm ;柱温 :40 ℃;体积流量 :018 mL/ min ;
进样量 :10μL。
21112 　EL SD 条件 :漂移管温度 : 90 ℃,载气 ( N2 )
流量 :215 L/ min。
212 　对照品溶液的制备 :精密称取绿原酸对照品
112 mg ,黄芩苷对照品 115 mg ,置于 10 mL 量瓶 ,
加甲醇溶解并稀释至刻度 ,制得对照品溶液。
213 　供试品溶液的制备 :精密吸取银黄口服液 2
mL ,置于 10 mL 量瓶内 ,加纯水稀释至刻度 ,混匀
放置 2 min ,用 0145μm 微孔滤膜滤过 ,即得。精密
称取银黄颗粒 2 g ,研细置于 10 mL 量瓶内 ,加纯水
稀释至刻度 ,混匀 ,室温放置 30 min 后超声 20 min ,
用 0145μm 微孔滤膜滤过 ,即得。
214 　稳定性试验 :取同一批供试品 ,制备供试品溶
液 ,分别于 0、2、4、8、24 h 进样 10μL。测得结果表
明 ,各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的
RSD 均小于 711 % ,可见供试品在 24 h 内稳定良好。
215 　精密度试验 :取同一批供试品溶液 ,连续进样
5 次。测得结果表明 ,各共有指纹峰的相对保留时
间和相对峰面积的 RSD %均小于 711 %。
216 　重现性试验 :取同一批供试品 6 份 ,制备供试品
溶液 ,分别进样。测定结果表明 ,各共有指纹峰的相
对保留时间和相对峰面积的 RSD %均小于 711 %。
217 　指纹图谱的测定 :分别精密吸取对照品溶液和
银黄制剂的供试品溶液各 10μL ,按上述色谱条件
进样分析 ,记录色谱图 ,见图 1。结果表明 ,12 批不
同厂家和批号银黄口服液 DAD 图谱共有 15 个共
有峰 , EL SD 图谱共有 18 个共有峰 ; 5 批银黄颗粒
DAD 图谱共有 12 个共有峰 , EL SD 图谱共有 13 个
共有峰。其中绿原酸、黄芩苷的出峰时间分别为
8178 min 和 37156 min。以 No11 的 H PL C2EL SD
指纹图谱作为示范图谱 ,见图 2。
218 　相似度测定 :采用中药色谱图分析和数据管理
·4501· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
系统 ,对 17 批银黄制剂进行相似度评价 ,结果见表 1。
表 1 　银黄制剂指纹图谱相似度结果
Table 1 　Similarity of Yinhuang preparations f ingerprints
批号 相关系数法 夹角余弦法 批号 相关系数法 夹角余弦法
1 01951 241 01 996 444 10 01 984 697 01 873 564
2 01986 156 01 972 289 11 01 857 150 01 991 934
3 01971 622 01 972 289 12 01 992 983 01 954 231
4 01996 9179 01 992 835 13 01 949 123 01 954 166
5 01992 147 01 994 500 14 01 992 843 01 992 166
6 01994 233 01 950 541 15 01 985 730 01 984 204
7 01945 749 01 992 637 16 01 989 870 01 988 347
8 01992 737 01 967 175 17 01 989 806 01 988 298
9 01963 459 01 986 230
219 　对 H PL C2EL SD 指纹图谱的聚类分析和主成
分分析
21911 　DAD 指纹图谱的聚类分析和主成分分析 :
本研究选用 17 批不同批次和厂家的银黄制剂样本 ,
建立了 DAD 指纹图谱 ,记录保留时间和用归一法
计算各个峰的相对峰面积。对色谱峰的保留时间和
峰面积采用聚类分析和主成分分析法进行化学模式
识别。17 个不同批次和厂家的银黄制剂聚类分析
图见图 3。由聚类分析结果可以看出 ,17 个不同批
次和厂家的样品大致可以聚为 3 类 (α、β和γ) 。样
品 13～17 号聚为α类 ,它们都为银黄颗粒且来源于
同一厂家 ;样品 1～6 和 8～10、12 号先聚为一类后 ,
再与 7 号共同聚为β类 ,这说明样品 1～6 和 8～10、
12 号具有相似的生产工艺 ,而 7 号所代表的批次产
品质量不稳定。11 号单独聚为γ类 ,11 号虽然与
9～10、12 号为同一厂家生产 ,但是同一厂家不同批
次的产品点也有不同的分布 ,这反映了不同批次产
品的原材料和 (或)生产工艺等环节的差异所造成的
质量差异。
图 3 　银黄制剂的 DAD 指纹图谱的聚类分析图
Fig13 　Cluster dendrogram constructed DAD
f ingerprints of Yinhuang preparation
　　对色谱数据进行主成分分析 ,取特征值较大的
两个主成分 (方差贡献率为 62124 %) 的得分向量作
图 ,结果见图 4。可知 ,相同厂家的银黄制剂样品分
布都相对集中 ,17 个不同批次和厂家的样品可明显
地分为 4 类 ,样品 1～4、13～17 分布比较紧凑 ,表明
两个厂家的产品质量稳定性较好。7 号和 11 号由于
原料和 (或)生产工艺等因素 ,与各自厂家的其他批次
样品分布较远 ,这和上述的聚类分析结果一致。说明
前两个主成分基本保留了原始样品的大部分信息。
聚类分析和主成分分析能对样品进行有效分类。
PC1
图 4 　DAD 指纹图谱的主成分 PC1 和 PC2 的分析图
Fig14 　Plot of PC1 and PC2 of samples in DAD f ingerprint
21912 　EL SD 指纹图谱的聚类分析和主成分分析
法 :本研究选用 17 批不同批次和厂家的银黄制剂样
本 ,同时建立了 EL SD 指纹图谱 ,对色谱峰的保留时
间和峰面积 ,采用聚类分析和主成分分析法进行化
学模式识别。17 个不同批次和厂家的银黄制剂地
聚类分析图见图 5。结果表明样品 1～17 可明显分
为两类 (α和β) 。样品 13～17 均为同厂家银黄颗
粒 ,具有相同的生产工艺 ,样品 11 号为银黄口服液 ,
它与银黄颗粒共聚为α类 ,说明 11 号的生产原料可
能与银黄颗粒的原料为同一来源地。样品 1～10 、
12 均为不同批次和厂家的银黄口服液 ,具有相同的
生产工艺 ,聚为β类。
图 5 　银黄制剂 ELSD 指纹图谱的聚类分析图
Fig15 　Cluster dendrogram constructed ELSD
f ingerprints of Yinhuang preparation
　　对 EL SD 色谱数据进行主成分分析 ,取特征值
较大的两个主成分 (方差贡献率为 62171 %) 的得分
向量作图 ,结果见图 6。可见 ,样品 1～4、5～8、9～
12、13～17 分别各自聚为一类 ,各批产品完全按照
厂家来源和生产工艺的不同呈现出不同的质量特
征 ,明显的分为 4 个区间 ,这说明 4 个厂家的产品可
以得到很好的区分。同一厂家不同批次的产品点也
有不同的集中趋势。样品 13～17 在图中分布比较
紧凑 ,表明该厂家的产品质量稳定性较好。
·5501·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
PC1
图 6 　ELSD 指纹图谱的主成分 PC1 和 PC2 的分析图
Fig16 　Plot of PC1 and PC2 of samples
in ELSD f ingerprint
3 　讨论
　　实验以尽可能获得较多的色谱图峰为原则 ,设
计样品的提取方法。分别选取水、甲醇和乙醇为提
取溶媒 ,并对提取物的图谱进行分析。当采用水作
提取溶媒时供试液指纹图谱响应峰最多 ,且样品各
峰分离良好 ,可能是由于银黄制剂中主要含水溶性
成份。并比较了超声提取法、热回流提取法及索式
提取法 ,发现超声提取 30 min 所得样品指纹图谱各
峰响应值较高 ,且方法简便易行。因此 ,本实验选择
水作提取溶媒 ,超声提取 30 min。
　　为了获得分离度好、灵敏性高以及检测峰尽可
能多的色谱图 ,对色谱条件及参数进行了选择及优
化 ,其中包括流动相的组成、检测波长、柱温以及运
行时间。由于制剂中成分复杂 ,采用乙腈和水组成
的流动相进行梯度洗脱时 ,得不到较理想的色谱图。
因而对流动相及配比组成进行了优化 ,选用乙腈和
1 % 醋酸系统梯度洗脱 ,运行时间为 60 min 即可获
得较多的色谱峰。
　　采用二极管阵列检测器对样品进行了全波长扫
描 ,结果在 254 nm 处各色谱峰均有较好的紫外吸
收 ,色谱信息最为丰富。因此 ,选择该波长作为检测
波长。实验比较了 25、30 和 40 ℃3 个不同的柱温 ,
发现随柱温上升各色谱峰保留时间略有提前 ,在
保证色谱峰分离度和节约时间的原则下 ,最终选择
40 ℃为指纹图谱检测柱温。蒸发光散射检测器的
有关参数根据流动相的构成及配比而设置。
　　本实验首次建立银黄制剂的 HPL C2EL SD 指
纹图谱 ,并基于色谱图整体面貌的共性特征 ,运用系
统聚类分析和主成分分析相结合的方法 ,对不同厂
家和批次银黄制剂的质量进行了评价。结果表明 ,
DAD 和 EL SD 指纹图谱的化学模式识别结果有一
定的差异 ,且能相互弥补单一色谱在质量评价中的
局限性 ,为考察和控制该制剂的质量提供了有效的
方法 ,同时也为评价其他中药制剂提供了一种思路。
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