全 文 ：氮素同化上存在着一定差异。紫外吸收物主要是酚
类化合物如类黄酮、黄酮醇、花色素苷以及烯萜类化
合物等 ,其中类黄酮是最主要的组分。本研究结果显
示所有雌性栝楼植株的紫外吸收物的量均高于雄性
植株 ,且其间差异达显著性水平。与李国梁等 [11 ]对
杨梅、猕猴桃等树种中水溶性酚类物质的结果一致。
推测此现象的形成原因是与类黄酮合成有关的基因
在雌性栝楼植株内的表达水平高于雄性 ,从而使合
成紫外吸收物酶的活性增高。
3. 2　雌雄栝楼性别鉴定:对大多数雌雄异体的植物
而言 ,性别分化和性别表现较迟给植株性别的早期
鉴定带来很大困难 ,如何通过鉴定幼苗的雌雄性别
而决定取舍 ,有助于提高经济效益。国内外学者从不
同方面进行了探索 ,主要包括外部形态、生理生化差
异、同工酶图谱、特异蛋白、染色体组型、核酸的量等
方面 [12 ]。在本研究中 ,光合色素、紫外吸收物的量及
POD活性在雌雄植株间均呈显著性水平差异 ,但仅
紫外吸收物的量在所有栝楼雌株中均高于雄株 ,如
采用更多已知性别的植株作进一步验证 ,紫外吸收
物可作为鉴定栝楼植株性别的有效指标。 HPLC分
析结果显示在相同色谱条件下 ,雌雄植株样品的出
峰时间、出峰数目、峰高等均存在差异 ,说明雌雄植
株所含的化学物质组分及量存在较大差别。进一步
检测更多的样品 ,确定图谱差异与性别的相关性并
寻找最具代表性的性别相关峰 ,该方法亦有望成为
鉴定栝楼性别的有效途径。
致谢:本实验材料的收集工作得到浙江省农业
科学院萧山棉麻研究所金关荣高级实验师的大力
支持。
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青葙 SRAP体系的建立和优化①
郭庆华 ,郭美丽* ,薛　芊 ,冯　娜 ,张汉明
(第二军医大学药学院 生药学教研室 ,上海　 200433)
摘　要 :目的　探讨影响青葙 SRAP( sequence-rela ted am plified polymo rphism)扩增的各种因素 ,建立并优化青葙
SRAP反应体系 ,为分子水平鉴定青葙子及其伪品 ,探讨青葙不同种质间的亲缘关系奠定基础。方法　用 CTAB法
提取青葙 DAN,设计 Taq酶浓度 ( 0. 02、 0. 04、 0. 06 U /μL)、 dN TP浓度 ( 0. 10、 0. 20、 0. 30 mmol /L )、 Prime r浓度
( 0. 15、 0. 30、 0. 45μmo l /L ) 3水平 3因素试验和 Mg2+浓度 ( 0. 5、 1. 0、 1. 5、 2. 0、 2. 5、 3. 0、 3. 5、 4. 0 mmo l /L ) 8水平单
因素试验。在 25μL体系中加入模板 DN A 20 ng ,对体系进行优化 ,用琼脂糖进行检测。结果　建立了适合青葙的
SRAP体系 ,在 25μL体系中 , DNA为 20 ng , Taq酶浓度为 0. 04 U /μL, dN TP浓度为 0. 30 mmo l / L, Primer浓度
为 0. 30μmo l /L , Mg2+ 浓度为 2. 5 mmo l / L,优化后的体系目标条带增多 ,且比较稳定 ,重现性好 ,得到了较好的扩
增效果。结论　本研究建立的反应体系适合青葙 SRAP的研究。为从分子水平鉴定青葙子正品与伪品以及鉴定青
葙不同种质资源奠定了基础。
关键词: 青葙 ; SRAP;反应体系
中图分类号: R282. 7　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253- 2670( 2008) 02- 0263- 04
·263·中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 2期 2008年 2月
① 收稿日期: 2007-06-08作者简介:郭庆华 ( 1976- ) ,女 ,山东潍坊人 ,药师 ,在读硕士研究生。 　 E-mai l: lil y- gqh@ 126. com
* 通讯作者　郭美丽　 Tel: ( 021) 25074576　 E-mai l: mlg uo@ smmu. edu. cn
Establishment and optimization of sequence-related amplified polymorphism
system for Celosia argentea
GUO Qing-hua, GUO M ei-li, X UE Qian, FEN G Na, ZHANG Han-ming
( Depar tment of Pharmacogno sy , Schoo l o f Pha rmacy , Second M ilitar y Medical Univ ersity , Shanghai 200433, China)
Abstract: Objective　 To study the facto rs of influencing the ampli fication of sequence-rela ted ampli-
fied polymo rphism ( SRAP) system in Celosia argentea , and to develop and optimize the SRAP reaction
system , laying a foundation fo r identi fying spurious breed at mo lecula r lev el and researching genetic rela-
tionships betw een di fferent germplasms of C. argentea. Methods　 Cetyl-trimethyl-ammonium-bromide
( CT AB) method w as used to ex t ract the genomic DN A of C. argentea. The tests w ith th ree factors at
three lev els w ere designed, including Taq polymerase concentrations ( 0. 02, 0. 04, and 0. 06 U /μL) ,
dN TP concentra tions ( 0. 10, 0. 20, and 0. 30 mmo l /L) , and Primer concentra tions ( 0. 15, 0. 30, and 0. 45
μmo l /L) . Furthermore, eight tests w ere designed based on the sing le factor o f Mg2+ concentrations ( 0. 5,
1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0, 3. 5, and 4. 0 mmol /L) . DN A Template ( 20 ng ) w as added into 25μL SRAP re-
action system, which w as optimized. Aga ro se elect ropho resis w as used for detection. Results　 An effi-
cient SRAP reaction sy stem fo r C . argentea was developed. The optimum sy stem was as fo llow es: DN A
( 20 ng ) Taq po lymerase 0. 04 U /μL, dN TP 0. 30 mmol /L , Primer 0. 30μmo l /L , and M g2+ 2. 5 mmol /L.
The to tal v olume for reaction was 25μL. Ta rg et bands w ere stable wi th good reproducibility af ter opti-
miza tion and the amplification resul ts were sa ti sfacto ry. Conclusion　 The SRAP reaction sy stem in this
study is sui table fo r analysis of C . argentea , laying a foundation for identification of false from genuineness
a t the mo lecular lev el and genetic research among di fferent g ermplasms of C . argentea.
Key words: Celosia argentea L. ; sequence-related amplified polymorphism ( SRAP) ; reaction system
　　序列相关扩增多态性 ( sequence-related ampli-
fied polymorphism, SRAP)是由 Li和 Quiro s发展
的一种新型分子标记技术 [1 ]。 该标记通过独特的引
物 设计对开放式阅读框 ( open reading flames,
O RFs)进行扩增 ,因个体不同以及物种的内含子、启
动子与间隔区长度不等而产生多态性。与常用的分
子标记 AFLP、 RFLP、 ISSR、 SSR和 RAPD比较 ,
SRAP具有其他分子标记所不具有的优点。 AFLP
操作步骤繁琐 ,不易对每一步骤进行优化 ,虽然借助
于 AFLP试剂盒可取得比较好的效果 ,但研究费用
高 ; RFLP实验过程复杂 ,不易实现自动化 ,对 DNA
的需要量大 ; RAPD重复性低 ,产率低。 SRAP标记
将 AFLP和 RAPD两者的优点相结合 ,具有简便、
稳定、产率高、便于克隆目标片段等特点 ,适用于基
因定位、基因克隆、生物多样性研究、遗传图谱构建、
cDN A指纹图谱构建、预测杂种优势、比较基因组学
等诸多研究方面 [1～ 5 ]。目前 , SRAP标记已经在马铃
薯、水稻、苹果、柑橘类果树、樱桃、梅子、油菜、大蒜、
莴苣、芹菜 [ 1]、棉花 [6 ]、辣椒 [7 ]等植物中研究应用。
青葙子为苋科一年生草本植物青葙 Celosia ar-
gentea L. 的干燥成熟种子 ,始载于《神农本草经》 ,
疗唇口青 ,列为下品 ,具有清肝、明目、退翳之功
效 [8 ]。青葙子具有保肝 [9 ]、抗肿瘤 [10 ]、抗糖尿病 [ 11]等
作用 ,并且对化学性肝损伤具有较好的防治作用。青
葙子在我国分布广泛 ,同属植物鸡冠花子 Celosia
cristata L. 和苋属多种植物的干燥成熟种子与青葙
子在性状上均非常相似 ,种子细小且难以区分 ,并且
由于各地用药习惯的影响而误收误用 ,造成了目前
青葙子药材品种混乱 ,质量低劣等问题。所以快速特
异性的鉴别品种间的差异对于青葙子及伪品的区分
具有很重要的意义。本研究采用 SRAP新型分子标
记技术 ,建立并优化了青葙子 SRAP技术分析体
系 ,为从分子水平鉴定青葙子正品与伪品以及鉴定
青葙子不同种质资源提供参考。
1　材料和方法
1. 1　实验材料:青葙子采集于福建福州 ,将青葙子
的种子种在软塑料钵中 ,放在昼夜 30℃的恒温培养
箱内生长约 10 d,取其幼苗嫩叶。
1. 2　试剂: 所需 PCR试剂: dN T P Mix ture、 10×
PCR buffer、 Taq酶及无菌超纯水均购自天根生化
科技有限公司 , DN A Marker DL 2000购自博光公
司 ,琼脂糖购自上海生工生物工程有限公司。引物由
上海生工生物公司合成。
1. 3　主要仪器: PCR仪 ( Biometra公司 ) ,高速离心
·264· 中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 2期 2008年 2月
机 ( Eppendorf公司 ) , ELI TE300型电泳仪、 GES型
电泳槽、 Dolphin-DOC凝胶成像系统均为美国 Weal-
tec公司产品 , PL3002型电子天平 ( Met t ler To ledo
公司 ) , QL- 901涡旋器 (海门市其林贝尔仪器制造
有限公司 ) , P270型摇床 (中国科学院武汉科学仪器
厂 ) , DK- S12型电热恒温水浴锅 (上海华连医疗器
械有限公司 ) ,紫外分光光度计 ( Thermo公司 )。
1. 4　方法
1. 4. 1　 DNA的提取: 取 1. 0 g叶片在液氮中研磨
成粉末 ,青葙叶片基因组 DN A提取参照 CTAB
法 [12 ]。
1. 4. 2　 DNA浓度与质量测定: 用 Thermo紫外分
光光度计测定样品 DNA浓度与纯度质量 ,测定吸
光度值在 1. 75～ 1. 90; 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测
DNA质量: 5μL DNA样品+ 2μL溴酚蓝上样缓冲
液 ,加样于含溴化乙锭 ( EB)凝胶上 ,于 4 V /cm电压
下电泳 0. 5 h后 ,紫外灯下观察、拍照。
1. 4. 3　 SRAP反应体系的优化: PCR反应程序采
用 Li[1 ]应用于蔬菜上的反应程度: 94℃预变性 5
min,反应前 5个循环在 94℃、 1 min, 35℃、 1 min,
72℃、 2 min条件下运行 ;随后的 30个循环复性温
度提高到 50℃ ,最后 72℃延伸 5 min。反应体积 25
μL,设计 Taq酶、 dN TP、引物浓度的 3因素 3水平
实验 (表 1) ,和 Mg2+ 浓度 8水平单因素试验 ,在 25
μL体系中加入模板 DNA 20 ng ,用 Me2 ( TGA
GTC CAA ACC GGA GC )和 Em3 ( GAC TGC
GT A CGA ATT GAC)引物组合进行 PCR扩增以
确定最佳反应体系 ,扩增产物用 1. 6%的琼脂糖凝
胶检测。
2　结果与分析
DNA浓度对青葙 SRAP扩增影响不是很大 ,
为了节省 DNA和方便取样 ,本研究使用在 25μL
体系中加入模板 DNA 20 ng。根据扩增主带的稳定
性和均匀程度以及经济性原则 ,选定第 11泳道为最
佳组合: dN TP的浓度为 0. 30 mmol /L,引物的浓度
为 0. 30μmol /L,酶的用量为 0. 04 U /μL(图 1)。扩
增产物经琼脂糖电泳检测表明 , M g2+ 浓度为 2. 5
mmol /L时 ,条带清晰 ,无弥散现象 ,而且特异性高 ;
同时反应体系具有较好稳定性和可重复性 ,因此确
定 Mg2+ 浓度为 2. 5 mmo l /L最佳 (图 2)。利用优化
后的反应体系能够有效地对青葙基因组进行 SRAP
扩增 ,该反应体系实用性强。
　　 Taq酶、 dN T P、 Mg2+ 及引物浓度均影响 PCR
扩增的结果。Taq DNA聚合酶是 PCR反应中不可
表 1　Taq酶、 dNTP和引物浓度的 3因素 3水平试验
Table 1　 Three factor-test of three concentrations
of Taq polymerase, dNTP , and primer
编号 Taq酶 /
( U· μL- 1 )
dN TP /
( mm ol· L- 1)
引物浓度 /
(μmol· L- 1)
1 0. 02 0. 20 0. 30
2 0. 02 0. 20 0. 45
3 0. 02 0. 20 0. 15
4 0. 02 0. 10 0. 15
5 0. 02 0. 10 0. 30
6 0. 02 0. 10 0. 45
7 0. 02 0. 30 0. 45
8 0. 02 0. 30 0. 15
9 0. 02 0. 30 0. 30
10 0. 04 0. 30 0. 45
11 0. 04 0. 30 0. 30
12 0. 04 0. 30 0. 15
13 0. 04 0. 20 0. 15
14 0. 04 0. 20 0. 30
15 0. 04 0. 20 0. 45
16 0. 04 0. 10 0. 15
17 0. 04 0. 10 0. 45
18 0. 04 0. 10 0. 30
19 0. 06 0. 10 0. 45
20 0. 06 0. 10 0. 15
21 0. 06 0. 10 0. 30
22 0. 06 0. 30 0. 45
23 0. 06 0. 30 0. 15
24 0. 06 0. 20 0. 15
25 0. 06 0. 20 0. 45
26 0. 06 0. 20 0. 30
27 0. 06 0. 30 0. 30
编号 1～ 27为与表 1对应的琼脂糖泳道编号
No. 1- 27, corresponding to 1- 27 agaros e
elect roph oresi s lanes in Table 1
图 1　Taq酶、 dNTP、引物 3因素对 SRAP
扩增结果的影响
Fig. 1　 Influence of Taq polymerase, dNTP , and primer
on SRAP amplif ication results
缺少的 ,浓度过高可引起非特异性扩增 ,浓度过低则
合成产物量减少 ,试验当中 Taq DNA聚合酶为
0. 04 U /μL时效果较好。 Mg2+为 Taq DNA聚合酶
的激活剂 ,扩增体系中不同 Mg2+ 浓度对青葙子
SRAP的影响见图 2,当 Mg2+ 浓度为 0. 5～ 2. 0
mmol /L时 ,条带较少且不清晰 ,说明 Mg2+ 浓度过
低对 Taq DNA聚合酶的活化不够 ,影响扩增效果。
当 Mg2+浓度增加到 2. 5 mmo l /L时 ,所有条带基本
·265·中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 2期 2008年 2月
1～ 8　 Mg2+浓度分别为: 0. 5、 1. 0、 1. 5、 2. 0、
2. 5、 3. 0、 3. 5、 4. 0 mmol /L
1- 8　 Mg2+ concent rat ion: 0. 5, 1. 0, 1. 5, 2. 0,
2. 5, 3. 0, 3. 5, and 4. 0 mmol /L, respectiv ely
图 2　Mg2+ 浓度对 SRAP扩增结果的影响
Fig. 2　 Inf luence of Mg2+ on SRAP
amplif icat ion results
可见 ,条带的明亮度明显增加 ,且条带清晰。 随着
Mg2+ 浓度的进一步提高 ,条带明亮度增加 ,但弱带
不能分辨 ,条带数显著减少 ,说明 Mg2+ 浓度过高会
抑制 Taq DNA聚合酶的活性 ,并增加错配率。因此
2. 5 mmol /L Mg
2+ 是进行青葙 SRAP扩增的最适
浓度。 dN TP是 PCR反应的原料 ,浓度过低会降低
PCR产物的产量 ,同时 , dN TP能与 Mg2+ 结合 ,浓
度过高将使游离的 Mg2+ 浓度降低 ,因此试验中选
择 dN TP浓度为 0. 30 mmol /L。引物的浓度为 0. 30
μmo l /L,浓度过低时扩增的带较少 ,浓度过高 ,会引
起错配和非特异性扩增 ,且会增加引物之间形成二
聚体的机会。
3　讨论
SRAP扩增体系中 ,各因素间互相影响 ,所以 ,
必须搞清各因素间的互作效应 ,才能建立最优化的
反应体系。本实验优化了适应青葙的反应体系 ,结果
表明 , SRAP标记实验操作过程简单 ,扩增条带清
晰 ,结果稳定 ,是一种兼有 RFLP、 RAPD、 SSR和
AFLP标记的优点 ,同时又克服了它们的一些缺点
的新型 DNA分子标记。研究发现 , SRAP对青葙
DNA浓度的要求不高 ,有一个较宽的浓度适宜范
围 ,但浓度太低时无扩增带 ,太高时特异性条带又很
难出现。在 25μL体系中 , 20～ 80 ng DN A均能扩
增出完整的条带 ,针对这一特点 ,在本试验中加入模
板 DNA 20 ng。但基因组 DNA质量好、纯度高是保
证扩增效果佳、重复性好的先决条件。实验中还发现
不同厂家的 Taq酶对青葙 SRAP扩增影响较大 ,本
实验采用天根公司的 Taq酶 ,取得较好的扩增效
果。 PCR反应程序按照 Li和 Quiros [1 ]的反应程序
对青葙 DNA进行扩增 ,扩增产物稳定性好 ,产率
高 ,谱带清晰。 最终 ,本实验通过优化比较得出了适
合青葙的反应体系 ,即: dN TP浓度为 0. 30 mmol /
L、引物浓度为 0. 30μmo l /L、酶的用量为 0. 04 U /
μL、 Mg2+ 浓度为 2. 5 mmo l /L时最佳 ,经过聚丙烯
酰胺凝胶电泳检测发现小片段条带明显增多 ,且条
带比较稳定 ,重复性好。从而获得了适合青葙这一物
种基因组的 SRAP扩增体系。
青葙子为《中国药典》收载品种 ,是常用的清肝
明目中药 ,但是由于青葙子与其同属植物鸡冠花的
种子和同科植物反枝苋 Amaranthus retrof lexus L.
的种子在形态上难以鉴别以及各地用药习惯的差
异 ,造成了目前药材市场上青葙子品种混乱 ,掺伪现
象严重 ,药材的品质参差不齐等问题。 因此 ,快速特
异性地鉴别青葙子药材对于确保青葙子药材的质量
具有重要意义。本研究将 SRAP新型分子标记技术
引入青葙子分子鉴定研究 ,通过优化比较得出了适
应青葙这一物种的 SRAP反应体系 ,为从分子水平
鉴定青葙子正品与伪品以及探讨青葙不同种质资源
的亲缘关系提供参考。
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·266· 中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 2期 2008年 2月