全 文 ：野生、退化、复壮蜜环菌对天麻产量及天麻素量的影响
孙士青 3 ,马耀宏 ,孟庆军 ,张利群 ,杨 　艳 ,史建国 3
(山东省科学院生物研究所 ,山东 济南 　250014)
摘 　要 :目的 　通过复壮已退化的蜜环菌 ,恢复其促进天麻生长及天麻素积累的作用。方法 　将相同来源的蜜环
菌 A rrmil learia mel lea 野生菌种、该野生菌种连续无性繁殖退化的后代菌种以及退化后复壮的菌种接种到同一品
种的天麻 Gast rodia elata 上进行栽培试验 ,测定天麻的生物产量和天麻素质量分数。结果 　野生菌种组与退化菌
种组相比较、复壮菌种组与退化菌种组相比较在天麻产量、天麻素质量分数上有显著性差异 ( P < 0101) 。结论
采用诱导子实体方法可以使退化的蜜环菌复壮 ,其促进天麻生长、天麻素积累的作用也得以恢复。
关键词 :天麻 ; 天麻素 ; 蜜环菌 ; 退化 ; 复壮
中图分类号 :R28216 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821300203
Influences of wild , degradative , and rejuvenative Armillea ria mellea
on yield of Gast rodia elat a and content of gastrodin
SUN Shi2qing , MA Yao2hong , M EN G Qing2jun , ZHAN G Li2qun , YAN G Yan , SH I Jian2guo
( Institute of Biology , Shandong Academy of Sciences , Jinan 250014 , China)
Abstract : Objective 　By rejuvenation of degradative st rain , t he effect s of A rmi l leari a mel lea to
p romote t he growt h of Gast rodi a el at a and to accumulate t he gast rodin in G. el at a could be recovered.
Methods 　G. el at a was inoculated wit h same variety of G. el at a wit h A . mel lea of wild st rain , degradative
st rain for continuously asexual rep roduction and rejuvenative st rain , and t he yield of G. el at a and the con2
tent of gast rodin of G. el at a were determined. Results 　The significant differences ( P < 0101) between
wild st rain and degradative st rain , rejuvenative st rain and degradative st rain in t he yield of G. el at a and the
content of gast rodin were discovered ( P < 0101) . Conclusion 　Rejuvenation of degradative st rain of A .
mel lea was made by artificial inducement of f ruit body , and t he effect s of A . mel lea to p romote t he growt h
of G. el at a and to accumulate t he gast rodin in G. el at a could be recovered.
Key words : Gast rodi a el at a Bl. ; gast rodin ; A rmi l leari a mel lea (Vahl ex Fr . ) Earst ; degradation ; re2
juvenation
　　蜜环菌 A rmi l leari a mel lea ( Vahl ex Fr. )
Quel . 是天麻 Gast rodi a el at a Bl. 生长发育必不可
少的共生菌 ,栽培天麻时如无蜜环菌菌材伴栽 ,天麻
块茎就会因得不到营养而无法生长并逐渐消亡。天
麻栽培所用的蜜环菌菌种经长期多次无性传代后都
会逐渐退化 ,如用已发生退化的菌种伴栽天麻则导
致天麻产量与天麻素质量分数急剧下降[1 ,2 ] 。为了
对退化的蜜环菌进行菌种复壮 ,也为了获得蜜环菌
单孢子和单倍体菌株用于鉴定蜜环菌的生物种系 ,
近年来成功进行了蜜环菌子实体的诱导[3 ]和蜜环菌
菌种复壮的研究[4 ] 。笔者将在天麻主产区采集到的
野生蜜环菌菌株、该野生蜜环菌连续无性繁殖三代
后的退化菌株以及退化后的复壮菌株分别接种到同
一品种的天麻上进行栽培试验 ,收获天麻后测定天
麻生物产量及其有效成分天麻素的量。
1 　材料
111 　蜜环菌的采集 :在我国主要天麻产区秦岭南
侧、大巴山北侧的 13 个市县进行。用植物解剖刀剖
取天麻菌材 (多为青杠树段)的周皮以及缠绕在上面
的蜜环菌菌索 ,置保湿袋中。
112 　培养基
11211 　液体培养基 :锯末 200 g 加水 100 mL 煮沸
20 min ,取滤液加入以下各物质 :葡萄糖 20 g ,蛋白
胨 5 g , KH2 PO4 1. 5 g ,MgSO4 ·7 H2 O 115 g。溶
解后加水至 1 000 mL ,常规灭菌。
11212 　固体培养基 :取锯末 300 g ,麸皮 100 g ,白
糖 40 g 加水至含水量 65 %～70 % ,装入广口瓶中
加棉塞后常规灭菌。
·0031· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
3 收稿日期 :2008210217　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :孙士青 (1957 —) ,男 ,上海人 ,硕士 ,副研究员。研究方向为蜜环菌、天麻生物学研究。
Tel : 82605742 (O) 　15853123750 (M) 　E2mail : sundaiman77 @yahoo. com. cn
11213 　诱导子实体培养基[3 ] :每升麦芽汁 (固形物
45 g/ L) 中加琼脂 15 g ,自然 p H ,采用 500 mL 三
角瓶 ,培养基装置 300 mL/ 瓶 ,两层棉布和一层牛皮
纸封口 ,121 ℃灭菌 30 min。
113 　供试天麻麻种与天麻素
11311 　天麻麻种为天麻初生球茎 (小白麻) ,由陕
西省宁强天麻研究所提供 ,属乌天麻 Gst rodi a el at a
Bl. f . gl auca S. Show 变型 ,为我国天麻产区的主
要栽培品种 (由山东中医药大学药用植物教研室石
俊英教授鉴定) 。
11312 　天麻素对照品 :由中国科学院昆明植物研究
所提供。质量分数大于 98 %。
114 　仪器及色谱条件[5 ] :日立 638 —50 高效液相
色谱仪 , 638 多波长检测器 (选用 270 nm , 0116
AU FS ,仪器自带数据处理机) 。色谱柱为 Zorbax
ODS (250 mm ×4. 6 mm) ,流动相 : 01025 mol/ L
KH2 PO42K2 H PO4 ∶CH3 O H = 97 ∶3 ,体积流量 :
1 mL/ min ,纸速 : 215 mm/ min ,天麻素峰保留时间
10130 min。
2 　方法与结果
211 　蜜环菌纯培养及分型 :将采到的菌索用自来水
冲净泥沙 ,置 011 % 升汞溶液中 ,表面消毒 25 min ,
取出后用无菌水冲去残余升汞液 ,用无菌剪刀剪成
115～2 cm 长的菌索小段 ,移入 PDA 平板培养基
上 ,22～25 ℃培养 3～5 d ,挑取萌发的菌丝转入
PDA 斜面培养基上 ,继续培养。
212 　连续无性繁殖乙型蜜环菌菌种的采集 :取上一
年收获天麻后的蜜环菌菌材 ,按 211 方法得下一代
无性繁殖蜜环菌纯培养 ,经 3 个生长季节连续传代
得退化蜜环菌菌种。
213 　菌种复壮 (诱导子实体) :挑取连续无性繁殖三
代已退化蜜环菌菌索尖端 ,按 211 方法得纯培养 ,将
纯培养菌丝接种在 11213 诱导子实体培养基上 ,
25 ℃暗培养 25 d 后转 18 ℃、相对湿度 90 % ,每天
12 h 散射光周期条件下培养至产生子实体。从子
实体上取单孢子按 211 方法得复壮蜜环菌纯培养。
214 　接种物的制备 :将蜜环菌纯系菌丝接种在 2 %
水琼脂平板培养基上 ,25 ℃培养 30～35 d。
215 　蜜环菌菌材制备
21511 　蜜环菌液体扩大培养 (二级种) :用 4 号灭菌
打孔器在接种物上打取直径 015 cm 的蜜环菌水琼
脂块 ,接入盛有液体培养基 100 mL 的摇瓶中 ,
25 ℃震荡培养 7 d。
21512 　蜜环菌固体扩大培养 (三级种) :将培养好
的蜜环菌液体培养物转入固体培养基上 ,25 ℃培
养 30 d。
21513 　蜜环菌菌材制备 :选长短适宜、直径 315～
4 cm 的苹果树木段 ,每隔 7 cm 砍鱼鳞口一个 ,深达
木质部 ,将木段堆放后使充分吸水。将培养好的蜜
环菌三级种 500 g 塞入已经处理过的鱼鳞口中 ,塞
紧压实后排放在盆中加辅料 (锯末2砂 3 ∶1) 掩埋 ,
浇水保湿。
216 　天麻栽种与管理
21611 　选种 :选择无损伤、无病虫害、大小均匀的天
麻初生球茎 (小白麻)作麻种。
21612 　栽植 :在直径 45 cm、高 25 cm 的大瓦盆中
下种麻 50 g ,先将辅料扒开 ,将麻种顺序平放在菌
棒之间 ,种麻间距 7～8 cm ,再覆辅料 5～7 cm ,浇
水保湿 ,每个菌号接种 3 盆天麻。
21613 　生长期管理 :控制温度 22～25 ℃,湿度在
40 %～50 % ,浇水要勤浇少浇 ,保持料面湿润 ,8 个
月后收获天麻。
217 　天麻素测定
21711 　天麻样品的炮制 :按《中国药典》2005 年版
天麻炮制项下的要求进行 ,收获天麻后用毛刷刷去
泥沙 ,称取鲜质量。将接有不同菌号蜜环菌的天麻
分别置沸水浴上蒸至透心 ,转 70 ℃烘箱中烘干 ,称
质量后用植物粉碎机粉碎、过筛 ,收集 18～22 目
颗粒。
21712 　标准曲线的绘制 :称取 105 ℃干燥至恒重
的天麻素对照品 510 mg ,置 10 mL 量瓶中 ,加入甲
醇溶解定容 ,按进样量对峰面积作图 ,得回归方程
Y = 0. 832 X + 4 , r = 01999 2。线性范围为011～
5 mg/ mL 。
21713 　样品液制备与测定 :称取处理好的天麻颗粒
11000 0 g 到入滤纸筒内 ,置索氏提取器中 ,加入甲
醇 (分析纯) 150 mL ,浸渍过夜 ,于 80 ℃水浴回流
提取 6 h ,回收大部分甲醇后转移至 10 mL 量瓶中 ,
以甲醇定容 ,摇匀过滤 ,即得样品液。进样量 10
μL ,以峰面积计算质量分数 ,并进行方差分析 ,结果
见表 1。
3 　讨论
　　将同一来源的蜜环菌野生菌种、连续无性繁殖
三代退化的菌种以及退化后复壮的菌种接种在同一
品种的天麻上进行栽培试验 ,对收获天麻的产量与
天麻素的质量分数进行测定 ,并对数据进行方差分
析 ,显示天麻生物产量 (干质量) 、天麻素的质量分
数 :野生菌种与退化菌种处理组之间差异极显著
·1031·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
表 1 　野生、退化、复壮蜜环菌对同一天麻生物产量、
天麻素量的影响
Table 1 　Effect of wild , degradative , and rejuvenative A. mel2
lea on yield of G. elata and content of gastrodin
菌号 鲜质量/ g 干质量/ g 天麻素/ %
野生菌种 　A121 444185 290153 01443 8 3
　　　　　A122 452137 301112 (297151 ±6105) 3 3 1 01432 4 (01437 6 ±01005 7) 3 3 1
　　　　　A123 450152 300189 01437 6
退化菌种 　A221 212104 110164 01155 8
　　　　　A222 224138 103127 (107141 ±3177) 01167 2 (01162 0 ±01005 8)
　　　　　A223 219156 108133 01163 0
复壮菌种 　A321 438142 287126 01431 2
　　　　　A322 445155 292132 (290114 ±2160) 3 3 2 01438 2 (01436 7 ±01004 9) 3 3 2
　　　　　A323 440131 291185 01440 7
　　3 3 次测定结果的均值 ; 3 3 1野生菌种组与退化菌种组之间比
较差异极显著 ( P < 01 01) ; 3 3 2复壮菌种组与退化菌种组之间比较
差异极显著 ( P < 0101)
　　3 mean of t hree analyses ; 3 3 1 significant difference between
wild and degradative st rains ( P < 0101) ; 3 3 2 significant differences
between rejuvenative and degradative st rains ( P < 0101)
( P < 0101) ;复壮菌种与退化菌种处理组间差异极
显著 ( P < 0101) ;野生菌种与复壮菌种处理组间无
显著性差异 ,在栽培试验中复壮的蜜环菌与野生的
第一代蜜环菌菌材上的菌索 ( rhizomorp h) 颜色红
亮、粗壮 ,生长态势旺盛 ;而无性繁殖第二代蜜环菌
菌索色泽、生长态势均次于第一代菌索 ;第三代菌索
则更差 ,这一现象符合微生物生长代谢的一般规律 ,
表明栽培天麻的产量与质量不仅取决于麻种的质
量 ,而且与菌种的无性繁殖代数密切相关 ,蜜环菌连
续无性繁殖代数越高其质量越差 ,药农所谓“菌棒只
能用一年的说法”是有科学依据的。
目前实验室条件下采用诱导子实体方法能够使
由于连续无性繁殖退化的蜜环菌菌种复壮 ,其促进
天麻生长及天麻素积累的生物学效能相应得到恢
复。但在天麻实际生产过程中药农需在每个栽培季
节开始前 ,采集优良的野生蜜环菌菌种扩大培养作
为当年的天麻栽培用菌种 ,而对于前一年收获天麻
后剩余的蜜环菌菌材由于缺乏大生产条件下诱发子
实体的适宜方法大多废弃造成浪费 ,今后应加强大
生产条件下栽培天麻后剩余蜜环菌菌材诱导产生子
实体的研究。一旦突破即可形成栽培天麻后剩余蜜
环菌菌材成为美味食用菌榛蘑 (即蜜环菌子实体)的
栽培料 ,实现植物、微生物资源最大限度的利用。
参考文献 :
[1 ] 　王秋颖 , 郭顺星 , 关凤斌1 不同来源蜜环菌对天麻产量影响
的研究 [J ]1 中草药 , 2001 , 32 (9) : 83928411
[2 ] 　孙士青 , 史建国 , 李雪梅 , 等1 连续无性繁殖蜜环菌对天麻
生物产量及天麻素含量的影响 [J ]1 山东科学 , 2008 , 21
(4) : 102121
[3 ] 　程显好 , 郭顺星 1 蜜环菌子实体的诱导和发生条件 [J ]1 菌
物学报 , 2006 , 25 (2) : 30223071
[4 ] 　王淑芬 , 杨金玲 , 朱 　平 ,等1 蜜环菌菌种的复壮研究 [J ]1
中国中药杂志 , 2008 , 33 (2) : 12121231
[5 ] 　谢笑天 , 郑　萍 , 李海燕 , 等1 反相 HPLC 法测定天麻中药
材中天麻素含量 [J ]1 云南化工 , 2004 , 31 (4) : 232251
刺五加叶柄的体细胞胚胎发生研究
邢朝斌1 ,劳凤云2 ,田春迎1 ,王建石1 3
(11 华北煤炭医学院 生物科学系 ,河北 唐山 　063000 ; 21 华北煤炭医学院 药学系 ,河北 唐山 　063000)
摘 　要 :目的 　以来源广泛、原植物药用成分量可测定的刺五加叶柄为外植体 ,研究刺五加体细胞胚胎发生情况 ,
为实现药用成分高产刺五加的快速繁殖奠定基础。方法 　以 3 年生植株萌发 15 d 以内的刺五加复叶叶柄为外植
体 ,考察 2 ,42D 和 BA 对刺五加体细胞胚胎发生的影响。结果 　28 d 培养后 ,2 ,42D 115 mg/ L + BA 110 mg/ L 处
理的叶柄外植体中 7114 % 直接产生或经由愈伤组织间接产生了 815 个体胚。两种产生方式均可在诱导培养基中
进行 ,但间接发生比例较少。转入相同或降低 2 ,42D 质量浓度的培养基后 ,体胚渐次发育成熟。同时新的体胚也
在逐渐产生 ,经由间接途径产生的体胚所占比例也随之上升。结论 　刺五加可以通过萌发 15 d 以内的复叶叶柄
外植体实现体细胞胚胎发生 ,体胚诱导率取决于 2 ,42D 和 BA 的质量浓度。
关键词 :刺五加 ; 叶柄 ; 体细胞胚胎 ; 2 ,42D ; BA
中图分类号 :R28211 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821302204
·2031· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
3 收稿日期 :2008210209　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30701086)
作者简介 :邢朝斌 (1975 —) ,男 ,河北省定州市人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事药用植物细胞工程方面的研究。
Tel : (0315) 3726238 　E2mail : xingzhaobin @yahoo. com. cn