全 文 ：丹参水提液的纯化工艺研究
吴大章1, 2 ,刘世琪1, 2* ,吴品江2 ,蒋巧梅2 ,朱 宁2
( 11 太极集团重庆涪陵制药厂有限公司研究所,重庆 408000; 21 成都中医药大学,四川 成都 610075)
摘 要:目的 优选丹参水提液纯化工艺。方法 以丹参提取液的浊度、鞣质以及有效成分的量为指标, 优选两种
絮凝澄清剂的用量和絮凝搅拌速度,筛选出较佳参数;对比研究醇水沉淀、絮凝结合乙醇沉淀、絮凝结合膜过滤 3
种纯化方法。结果 使用壳聚糖进行絮凝澄清处理后的丹参水提液上清液浊度低于用 ZTC1+ 1Ò型絮凝剂处理
后的浊度,并能够更好地减轻膜污染程度;壳聚糖结合膜过滤法对丹参水提液的有效成分保留率较高, 收膏率相对
较高,浊度和鞣质含量无显著差异。结论 壳聚糖作为丹参水提液絮凝澄剂效果优于 ZT C1+ 1Ò型絮凝剂,壳聚
糖结合膜过滤法纯化丹参水提液的综合评价指标优于其他两种方法。
关键词:丹参;纯化工艺;壳聚糖; ZTC1+ 1Ò絮凝剂;膜分离
中图分类号: R2841 2 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670(2009) 06 0889 04
Purifying process of water2extract solution of Danshen
WU Da2zhang1, 2 , LIU Shi2qi1, 2 , WU Pin2jiang2 , JIANG Qiao2mei2 , ZHU Ning2
( 11 Institute of Fuling Pharmaceutical Factory, T aiji Group, Chongqing 408000, China; 21 Chengdu Univer sity
of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China)
Abstr act: Objective To opt imize the pur ifying process of Danshen water ext ract solut ion1 Methods
Taking the turbidity, content of tannin, and act ive components in the Danshen water extract solut ion as
index, to opt imize the bet ter flocculant and its best flocculat stiring speed1 The purifying effects of alcohol2
water sedimentat ion, flocculation binding alcohol2water sedimentat ion, and flocculat ion binding membrane
filt rat ion wer e studied1 Resul ts The turbidity of the chitosan2t reated supernatant is lower than that of
ZTC1+ 1Ò2t reated ones, and this t reatment could mitigate the membrane fouling bet ter1 Chitosan binding
membrane filt ration had a better retent ion rate and higher yield of active components , and there was no
significant difference in the turbidity and the tannin content1 Conclusion Chitosan as the flocculant of the
Danshen water ext ract solut ion is superior to ZTC1+ 1Ò1 Chitosan binding membrane filt rat ion is more
effective than alcohol sedimentation and flocculation binding alcohol2water sedimentat ion in retaining the
act ive components and comprehensive evaluat ion index1
Key words: Sa lviae milt iorr hiz a Bunge; purifying process; chitosan; ZTC1+ 1Òflocculant;
membrane separation
丹参是唇形科植物丹参 Salvia mil tior rhiza
Bunge 的干燥根及根茎, 是中医临床常用的活血化
瘀药。丹参水溶性成分的药理作用广泛, 具有改善
微循环、抗血栓、促进组织恢复等多种活性[ 1] , 已用
于多种中成药制剂, 如口服液、颗粒剂、气雾剂、注射
液、注射用灭菌粉末等[ 2]。丹参口服液是由丹参单
味药经过水提取、分离、纯化而成,具有液体制剂的
服用方便、吸收快、作用迅速等优点。但丹参水提液
中含杂质较高,大都含有蛋白、脂肪、纤维、鞣质及胶
体物质。传统的水提醇沉除杂方法, 生产成本高,周
期长,絮凝澄清和膜分离技术结合应用可以部分地
解决这些问题[ 3]。本研究通过对比传统的乙醇沉淀
法、絮凝技术结合乙醇沉淀法以及絮凝澄清剂结合
膜技术,筛选出丹参水提液的合适的分离纯化工艺。
1 仪器与试药
D ) 8401型多功能搅拌器(广州天利仪器厂) ;
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* 收稿日期: 2008210224 基金项目:科技部科技型中小型企业技术创新基金( 07C26215100788)作者简介:吴大章( 1976 ) ) ,男,重庆人,成都中医药大学在读博士,主管药师,从事中药新剂型与新技术研究。
E2mail: wdz100@163. com
* 通讯作者 刘世琪 T el: ( 023) 72801079
Sartor ius BP211D 十万分之一电子天平; Agilent
1100系列高效液相色谱仪, 包括四元泵,柱温箱, 自
动进样器,二级管阵列检测器;岛津 UV ) 1700 紫
外分光光度计。
丹参药材购于重庆中药材市场,经成都中医药
大学卢先明教授鉴定与5中国药典6 2005 年版一部
正品相符。壳聚糖、硫酸肼、六次甲基四胺(成都长
征试剂公司) ; ZTC1+ 1Ò、Ó型絮凝剂(天津正天澄
清技术有限公司) ;没食子酸对照品、丹参酚酸 B对
照品、丹参素钠对照品、原儿茶醛对照品(中国药品
生物制品检定所, 批号分别为: 08319501、1115622
200302、1108552200507、1108102200205) ; 甲醇、乙
腈为色谱纯(美国 Fisher)。水为重蒸馏水;其余试
剂均为分析纯。
2 试验方法
21 1 丹参提取溶液的制备:取丹参 1 000 g,加 8倍
量水,浸泡 21 5 h后,煎煮 11 5 h, 滤过,滤渣再分别
以 6倍量水煎煮两次,每次 1 h, 滤过,合并滤液, 滤
液浓缩后定溶至 10 L, 备用。
21 2 丹酚酸 B、丹参素、原儿茶醛的测定[ 4]
21 21 1 色谱条件: Agilent 公司 Zorbax SB2C18
ODS色谱柱( 250 mm @41 6 mm, 5 Lm) ;流动相:乙
腈21%冰乙酸( 21 B 79) ;检测波长: 281 nm;体积流
量: 11 0 mL/ min。
21 21 2 对照品溶液的制备及线性关系考察:精密称
取原儿茶醛对照品 61 56 mg ,加甲醇至 100 mL(质量
浓度 6516 Lg/ mL)。精密称取丹酚酸 B对照品 41 07
mg,加甲醇至 25 mL(质量浓度 162 1 8 Lg/ mL)。精
密称取丹参素对照品 41 55 mg,加甲醇至 10 mL,相当
于丹参素的质量浓度为 01 455 mg/ mL。分别吸取原
儿茶醛、丹酚酸 B、丹参素对照品溶液各 2、6、10、14、
18、22 LL注入液相色谱仪,进样测定。以进样量为横
坐标,峰面积为纵坐标,得标准曲线。原儿茶醛:Y=
70163 X - 1139, r= 01 999 9;丹酚酸 B: Y= 171 53
X- 11 581, r= 01 999 9;丹参素:Y= 931 58 X - 21 42,
r= 01 999 8。表明原儿茶醛、丹酚酸 B、丹参素分别在
01065~ 1144 Lg, 01 33~ 31 58 Lg, 0191~ 101 01 Lg时,
峰面积与进样量线性关系良好。
21213 测定法:吸取各待测液经01 45 Lm微孔滤膜滤
过,取续滤液10 LL注入高效液相色谱仪测定,即得。
21 3 浊度的测定[ 5]
21 31 1 标准曲线的绘制:参照 GB 132002915浊度的
测定6中分分光光度法。将硫酸肼和六次甲基四胺反
应产生的浊度标准液稀释至不同质量浓度, 在 680
nm测定吸光度,以浊度单位NTU(nephelometric tur2
bidity units)为横坐标,吸光度为纵坐标,得标准曲线
方程Y= 11 29@10- 3 X- 31 83@10- 4 , r= 01 999 9。
21 31 2 样品测定: 取供试液于 680 nm 测定吸光
度,结果代入标准曲线方程计算浊度。
21 4 鞣质的测定
21 41 1 标准曲线的绘制:精密称取没食子酸对照品
501 30 mg置 100 mL棕色量瓶中,得 01 503 mg/ mL
没食子酸对照品溶液。参照5中国药典6 2005年版
一部附录ÚB鞣质的测定方法进行。以吸光度为纵
坐标, 质量浓度为横坐标, 得标准曲线方程 Y=
1341 627 4 X+ 01 008 6, r = 01 999 8, 表明鞣质在
11 06~ 101 6 Lg与吸光度有良好的线性关系。
21 41 2 样品测定:取待测液适量稀释 10倍, 滤过,
续滤液即为供试溶液。参照5中国药典6 2005年版
一部附录ÚB鞣质的测定方法操作,即得。
21 5 丹参提取液中各指标测定:按照以上各指标的
测定方法测定丹参提取液中各指标的量, 结果上清
液浊度为 2035 NTU , 丹酚酸 B质量浓度为 8101 3
Lg/ mL,丹参素质量浓度为 11 170 0 mg/ mL, 原儿
茶醛质量浓度为 1111 3 Lg/ mL, 鞣质质量浓度为
11 825 3mg/ mL,收膏率为 531 6%。
21 6 壳聚糖澄清效果的考察
21 61 1 壳聚糖的配制:取壳聚糖适量用1 %醋酸配
成 1%的壳聚糖胶体溶液。
21 61 2 壳聚糖用量对澄清效果的影响:分别取浓缩
药液6份, 每份 100 mL, 分别按0~ 21 0 g/ L(以壳聚
糖计) 的量加入 1% 壳聚糖胶体溶液, 并以 100
r/ min搅拌 10 min, 然后加水定容至 250 mL,摇匀。
常温静置 24 h后取上清液测定浊度、指标成分保留
率以及收膏率。结果见表 1。
指标成分保留率= 絮凝后成分的质量浓度/絮凝前成分
的质量浓度@100%
鞣质剩余率= 絮凝后鞣质的质量浓度/絮凝前鞣质的质
量浓度@100%
表 1 壳聚糖用量对絮凝效果的影响
Table 1 Effects of chitosan dosage on f locculation
壳聚糖用量/
( g# L- 1 )
干膏收
率/ %
保留率/ %
原儿茶醛 丹酚酸 B丹参素
浊度/
NTU
鞣质剩
余率/ %
01 0 531 0 100 100 100 1050 100
01 5 491 5 991 4 971 5 991 6 379 3819
11 0 481 3 101 951 0 1001 7 198 1712
11 5 471 6 1001 4 921 5 1011 5 93 1316
11 75 471 3 1001 2 921 2 1021 1 921 7 1318
21 0 471 4 1011 5 921 3 1021 3 92 1317
结果表明,随壳聚糖用量的增加,絮凝后上清液
#890# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
浊度和鞣质显著下降, 指标成分丹参素和原儿茶醛
质量浓度基本不变或略有上升,与文献报道一致[ 6]。
丹酚酸 B质量浓度略有下降,最低约为未处理时的
92% ;收膏率保持在 48%左右, 略低于未处理时的
53%。用量 21 0 g/ L 时, 上清液浊度和鞣质与 11 5
g/ L 时基本相同,所以壳聚糖最佳用量为 11 5 g/ L。
21 61 3 搅拌速度对壳聚糖絮凝效果的影响:以 11 5
g/ L 的壳聚糖用量, 分别在不同搅拌速度对丹参提
取液进行絮凝澄清操作, 其余操作同 21 61 2,结果见
表 2。
表 2 搅拌速度对壳聚糖絮凝效果的影响
Table 2 Effect of stirr ing speed on chitosan flocculation
搅拌速度 干膏收率/ %
保留率/%
原儿茶醛 丹酚酸 B 丹参素
浊度/
NTU
鞣质剩
余率/ %
50 481 5 991 2 901 3 9812 95 15
100 471 7 1001 4 921 5 9916 921 6 131 9
150 471 4 101 931 0 10017 911 8 131 2
200 491 6 1001 4 921 7 10115 93 141 6
21 7 ZTC1+ 1Ò型絮凝剂絮凝效果的考察
21 71 1 ZTC1+ 1Ò型絮凝剂的配制:取 A 组分适
量, 用水配成 1%黏胶液;取 B组分适量,用1%乙酸
配成 1%黏胶液, 并使其充分溶胀 24 h,备用。
21 71 2 ZTC1+ 1Ò型絮凝剂用量对絮凝效果的影
响:分别取浓缩药液 6份,每份 100 mL,分别按 0~
11 6 g/ L(以 ZTC絮凝剂计)的量先加入 B组分胶体
溶液,以 100 r/ min搅拌 5 min,加入相同量 A 组分
胶体溶液,再慢速搅拌 5 min( 100 r/ min)。加水定
容至 250 mL,摇匀,常温静置24 h,取上清液测定浊
度、指标成分保留率以及收膏率。结果见表 3。
表 3 ZTC1+ 1Ò型絮凝剂用量对絮凝效果的影响
Table 3 Effects of ZTC1+ 1Ò dosage on f locculation
ZTC1+ 1Ò
用量( g/ L)
干膏收
率/ %
保留率/ %
原儿茶醛 丹酚酸 B丹参素
浊度/
NTU
鞣质剩
余率/ %
010 531 0 100 100 100 1020 100
014 521 9 1011 4 971 5 1001 6 309 361 9
018 511 8 1011 6 951 0 1001 9 98 181 2
112 521 6 1021 4 891 5 1011 5 94 141 5
114 521 3 1011 8 871 2 1011 1 931 7 141 4
116 521 7 1011 3 871 3 1011 5 931 8 141 6
研究表明, ZTC1+ 1Ò型絮凝剂随用量增加, 丹
参素和原儿茶醛质量浓度基本不变;上清液浊度及
鞣质的量均显著下降, 丹酚酸 B质量浓度随用量增
加略有下降, 最低约为未处理时的 87% ;上清液固
形物的量约为 53%左右,与未处理时基本相同。用
量 11 6 g/ L时, 鞣质的量最低,浊度与 11 2 g/ L用量
差别很小, 从减少用量角度考虑, 以 11 2 g/ L 为
ZTC1+ 1Ò型絮凝剂每组分最佳用量。
21 71 3 搅拌速度对 ZTC1+ 1Ò型絮凝剂絮凝效果
的影响:以每组分 11 2 g/ L 的用量,分别在不同搅拌
速度对丹参提取液进行絮凝澄清操作, 其余操作同
21 71 2, 结果见表 4。
表 4 搅拌速度对 ZTC1+ 1Ò型絮凝效果的影响
Table 4 Effect of stirr ing speed on ZTC1+ 1Ò f locculation
搅拌速度 干膏收率/ %
保留率/ %
原儿茶醛 丹酚酸 B 丹参素
浊度/
NTU
鞣质剩
余率/ %
50 521 5 10112 881 3 981 2 95 151 0
100 521 4 10015 891 5 1011 7 931 6 141 3
150 521 7 101 891 0 1011 0 911 8 141 2
200 531 2 10013 871 7 1001 5 961 5 141 6
从表 2, 4可以看出, 不同的搅拌速度对两种絮
凝剂的影响效果相似, 搅拌速度在 100~ 150 r/ min
絮凝效果较佳。搅拌速度太低, 在絮凝剂加入的瞬
间在溶液中形成局部沉淀从而包裹有效成分,使有
效成分的量降低, 搅拌速度太高使已产生的絮体被
打碎重新分散从而沉淀生成不明显, 降低了絮凝效
果。因此选择搅拌速度为 100~ 150 r/ min。
21 8 两种絮凝剂最佳絮凝条件下的絮凝效果比较:
壳聚糖最佳絮凝条件为用量 11 5 g/ L, 絮凝搅拌速
度在 100~ 150 r/ min; ZTC1+ 1Ò型絮凝剂最佳絮
凝条件为每组分用量 11 2 g/ L, 絮凝搅拌速度在
100~ 150 r / min。分别用两种絮凝剂的最佳絮凝
条件进行 3次重复试验,结果见表 5。
表 5 两种絮凝剂最佳工艺的效果比较( n= 3)
Table 5 Compar ison of optimum processes
between ZTC1+ 1Òand chitosan ( n= 3)
絮凝剂
上清液浊
度/ NTU
丹酚酸B/
( mg# mL - 1)
丹参素/
( mg # mL- 1 )
原儿茶/
( mg# mL- 1)
鞣质/
(mg # mL- 1)
收膏率
/%
壳聚糖 92 01 324 01 458 01 0445 01 25 521 4
ZTC1+ 1Ò 95 01 305 01 462 01 0449 01 36 531 3
结果表明,经两工艺处理后,指标成分无明显差
别,但壳聚糖处理后的丹参提取液,浊度和鞣质质量
浓度均较低,且壳聚糖用量少于 ZTC1+ 1絮凝剂,
操作更为简单。因此, 选取壳聚糖絮凝作为丹参提
取液微滤处理的前处理工艺较好。
21 9 絮凝对膜通量的影响:分别将丹参提取液、壳
聚糖及 ZTC1+ 1Ò型絮凝剂絮凝处理后的上清液
进行膜过滤操作, 观测膜通量,结果见图 1。
经壳聚糖絮凝处理的上清液膜通量最大,初始膜
通量为1 398 L/ (m2 # h) ,稳定膜通量在 280 L/ (m2 #
h)左右; ZTC1+ 1Ò型絮凝剂絮凝处理后的上清液
初始通量 1 176 L/ ( m2 # h) , 稳定膜通量约为 180
L/ (m2 # h) ;未处理的丹参提取液初始膜通量仅有
550 L/ (m2 # h) ,约 10 min 后由于膜通量过小, 膜分
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图 1 絮凝效果对膜通量的影响
Fig1 1 Effects of flocculation on membrane flux
离无法继续进行。以上结果说明絮凝处理后可以较
好地减轻膜污染, 且壳聚糖处理后的效果优于
ZTC1+ 1Ò型絮凝剂。
21 10 纯化工艺对比研究:分别取浓缩药液 3份, 每
份 1 000 mL, 分为Ñ、Ò、Ó。Ñ为原工艺, 纯化方
法为:供试液浓缩至 100 mL, 加乙醇使含醇量达
60% ,静置 24 h, 滤过, 滤液减压浓缩至稠膏状, 加
水稀释至 100 mL,冷藏24 h, 滤过;滤液再加乙醇使
含醇量达 80%,静置 24 h,滤过,滤液减压浓缩至稠
膏状,加水稀释至 100 mL, 冷藏 24 h, 滤过;滤液定
容至 100 mL。Ò为絮凝结合乙醇沉淀法:加 11 5 g/ L
(以壳聚糖计)的量加入 1%壳聚糖胶体溶液, 并以
100 r/ min搅拌10 min,常温静置 24 h,滤过,滤液浓
缩至 100 mL,加乙醇使醇含量达 80%,静置 24 h, 滤
过,滤液减压浓缩至稠膏状,加水稀释至 100 mL,冷
藏 24 h, 滤过, 滤液定容至 100 mL。Ó为絮凝结合
膜过滤法:样品加 11 5 g/ L(以壳聚糖计)的量加入
1%壳聚糖胶体溶液, 并以 100 r/ min 搅拌 10 min,
常温静置 24 h,滤过, 滤液通过粗滤膜滤过,滤液浓
缩至 80 mL通过精滤膜滤过,滤液定容至 100 mL。
分别取Ñ、Ò、Ó工艺处理液测定浊度、指标成分保
留率以及收膏率。结果见表 6。
表 6 纯化工艺对比研究结果表
Table 6 Comparison of pur ifying process
浓缩药液 干膏收率/ %
保留率/%
原儿茶醛 丹酚酸 B 丹参素
浊度/
NTU
鞣质剩
余率/ %
Ñ 221 5 811 2 681 2 8012 29 101 5
Ò 271 7 831 6 751 3 8113 311 7 111 2
Ó 301 2 921 1 791 6 8915 321 5 111 6
结果表明, 原工艺处理的水提液能够很好的降
低干膏收率、增加澄明度、鞣质的量能够显著降低,
但是有效成分的损失严重,生产工序较多,生产工时
较长,乙醇用量大, 生产成本很高;絮凝结合乙醇沉
淀法在有效成分损失较少,降低乙醇用量,但干膏收
率和澄明度以及鞣质的量比原工艺稍差;絮凝结合
膜过滤法能够很好的保持有效成分, 整个工艺不用
乙醇,能够较大的降低生产成本, 但收膏率相对较
高、浊度、鞣质的量与前两种工艺无显著性差异。因
此,结合有效成分的保留率、生产成本等综合考虑,
丹参水提液的纯化工艺采用絮凝结合膜过滤法, 即
丹参提取液用加 11 5 g/ L壳聚糖处理后通过两次膜
滤过。
3 讨论
吸附澄清法是指在中药的提取液中加入絮凝剂
(澄清剂) ,通过/电中和0和/吸附架桥0作用,将体系
中的悬浮物及胶体粒子除去,使体系的澄明度得以
提高,减少服用剂量[ 5]壳聚糖和 ZTC澄清剂, 其作
用机制是利用电荷和大分子的架桥作用, 去除溶液
中的鞣质、蛋白质、树胶等杂质, 得到稳定、澄清的
溶液。
本实验研究结果显示, 絮凝温度在室温时最佳,
如果温度过高可使絮凝作用过快, 部分细小微粒还
未来得及发生絮凝反应,无法沉降下来,在较低温度
时,上清液澄明度都较低。各种絮凝剂澄清都有最
佳的 pH 值范围。壳聚糖的最佳絮凝 pH 值范围为
酸性,酸性环境下有利于壳聚糖长链分子的伸展,同
时发挥吸附架桥和电中和作用。但在实验中,当调
整 pH 值小于 4时丹参提取液会发生浑浊并产生沉
淀,故絮凝 pH 值不宜小于 4。
本实验结果显示,絮凝技术和膜技术结合的这种
处理方法与醇沉工艺和絮凝技术结合乙醇沉淀技术
比较,丹参几个主要有效成分的保留率较高,其他指
标能够同时达到丹参口服液的要求,在该制剂除杂工
艺中具有一定的适宜性,但絮凝技术结合膜技术处理
对丹参口服液药效的影响有待于进一步研究。
研究结果表明, 澄清剂结合膜过滤法较水醇法
简化了工艺,缩短了生产周期, 降低了生产成本, 故
在中药制剂中值得推广这一新技术。
参考文献:
[ 1] 张 婷,王超云,田京伟,等1 丹参素对脑损伤的保护作用[ J]1
中草药, 2005, 36( 7) : 1041210431
[ 2] 陈 峰,李泽友, 刘明生1 丹参制剂的研究进展 [ J ]1 中国药
房, 2006, 17( 21) , 1675216771
[ 3] 丁启圣 1 新型实用过滤技术 [ M ]1 北京: 冶金工业出版社,
20001
[ 4] 李向军,刘敏彦,赵兴茹,等1 丹参水溶性成分提取工艺研究
[ J]1 中国中医药信息杂志, 2005, 12( 12) : 491
[ 5] 水质浊度的测定( GB 13200 ) 91) [ S]1 19911
[ 6] 陈 昕1 壳聚糖作为中药水提取液中絮凝澄清剂的研究 [ J]1
中医药研究, 2002, 18(6) : 442451
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