全 文 ：·990· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第7期2008年7月
长柄链格孢对百两金皂苷的生物转化
隋玉辉1’2，刘岱琳H，邱峰2，陈虹1
(1．中国人民武装警察部队医学院生药教研室，天津300162；2．沈阳药科大学中药学院，辽宁沈阳110016)
朱砂根为紫金牛科紫金牛属植物朱砂根
ArdisiacrenataSims的根。性味苦辛、凉，具有清热
解毒、散瘀止痛的作用。用于治疗心胃气痛、风湿骨
痛、跌打损伤等症口]。现代药理研究发现朱砂根中的
三萜皂苷类化合物具有较强的抗癌活性，百两金皂
苷A和B是从朱砂根中分离得到的主要抗癌活性化
合物[2]，其化学结构已经通过理化方法结合光谱分
析得到了确认。本实验对百两金皂苷A和B进行微
生物转化研究，期望能够得到具有很强活性和高选
择性的抗癌化合物，同时为三萜皂苷类化合物微生
物转化研究奠定实验基础。
经菌种筛选得到长柄链格孢(3．2875)对百两金
皂苷A和B的C一3位的糖链有选择性的水解作用，
得到极性变小的去糖基转化产物，见图1。
化合物I 化合物II
化台物IⅡ 化合物Ⅳ
图1化合物l和I的生物转化途径
BiotransformationpathwayofcompoundsI andI
1实验材料
1．1 实验材料及试剂：菌种为长柄链格孢
AlternarialongipPs3．2875(购自中国科学院微生
物研究所)。培养基：A．斜面固体培养基：马铃薯汁
250mL、葡萄糖5g、琼脂7．5g；B．发酵培养基：马
铃薯汁300mL，葡萄糖6g。底物：化合物I和化合物
收稿日期：2007—09—12
基金项目：天津市应用基础研究面上项目(YFJMJC08300)
作者简介；隋玉辉(1980一)，女，硕上研究生，主要从事天然产物的生物转化与分离．Tel：(022)60578194E—mail：sytf99@163．com
*通讯作者刘岱琳Tel：(022)60578194E—mail：dailinlch@163．tom
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第7期2008年7月·991·
I由朱砂根中提取分离得到(本实验室自制)。
1-2实验仪器及试剂：ESI—MS质谱仪(LC—MSD—
Trap—SL，AgilentTech ologies)；超导核磁共振谱
仪(BruckAV一600)，溶剂为氘代吡啶；Waters600
高效液相色谱仪，色谱柱：C。。分析柱(250mm×4．6
mm，5tim)，C18制备柱(250mm×10mm，5tLm)，检
测器：AlhechELSD；N一1001型EYELA旋转蒸发
仪(上海爱郎仪器有限公司)；HZQ—QX全温振荡
器(哈尔滨东联电子技术有限公司)；无菌操作台(苏
州净化设备厂)，LHS一150SC恒温恒湿箱(上海一
恒科技有限公司)。
SephadexLH一20(北京金欧亚科技发展有限公
司)；大孑L树脂DiaionHP20(Tokyo，Kyushu)；ODS
(YMC—PackPro．)；D101大孑L树脂(天津农药总
厂)；氯仿、甲醇、乙醇、正丁醇均为天津市百世化工
有限公司产品；硫酸(天津市化学试剂六厂)；葡萄糖
(天津市文达稀贵试剂化工厂)，以上试剂均为分析
纯。色谱甲醇(天津市康科德科技有限公司)；反相板
(Merck)；薄层色谱硅胶G(60型)(中国青岛海洋化
工集团公司)；琼脂粉(联星生物)。
2实验方法
2．1底物的制备：朱砂根根茎，60％乙醇溶液回流提
取2次(第一次8倍量，第二次6倍量)，每次2h，合并
提取液，减压回收溶剂得乙醇提取浸膏。取浸膏的醇
溶水沉部分，进行D101大孔吸附树脂柱(137cm×
11cm)色谱分离，乙醇～水溶液梯度洗脱，TLC检测，
收集富含百两金皂苷的75～105份洗脱液，分别合
并，浓缩抽滤，得化合物百两金皂苷A和B。
2．2菌株的斜面培养：在无菌条件下，将长柄链格
孢接种于马铃薯琼脂斜面培养基上，28℃恒温培养
箱中培养7d。
2．3生物转化培养方法
2．3．1发酵培养：在无菌操作台上，用接菌环将斜
面培养菌株的孢子接种到液体培养基中，恒温摇床
28℃，160r／min振荡培养48h。
2．3．2转化培养：60mL液体培养基中加入预处理
的底物0．5mL(甲醇为溶剂，质量浓度100rag／
mL)，空白组中加入0．5mL甲醇对照，恒温摇床28
℃，160r／min，振摇培养72h。
2．4转化产物的萃取分离与纯化
2．4．1培养液萃取：将培养完全的培养液抽滤，滤
液用等量的正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，减压浓
缩干燥，得转化产物粗品。
2．4．2转化产物的分离纯化：30％乙醇溶解转化产
物粗品，上大孔树脂DiaionHP20开放柱进行分离，
依次用30％、50％、70％、95％乙醇溶液进行梯度洗
脱，分步收集洗脱液，TLC检测合并相同组分，再将
有转化产物的组分干法拌样，进行ODS开放柱色谱
分离，依次用30％、50％、60％、70％甲醇溶液梯度洗
脱，每个梯度洗5个保留体积，依次接流份，TLC检
测合并相同组分，最后再利用PHP[。C进行纯化得
转化产物Ⅲ和N。
2．5分析检测
2．5．1TLC检测：分别将化合物I和I对照品、化
合物I转化产物和化合物Ⅱ转化产物及不加底物的
空白对照样品点样于GF。。。硅胶板，氯仿一甲醇一水
(70；30：5)展开，挥干后喷10％硫酸溶液，105℃
加热显色。
2．5．2HPLC检测：将转化产物粗品用甲醇溶解后
滤过，HPLC分析。流动相条件为甲醇一水(1：1)溶
液，检测器为AlhechELSD。
2．6 底物和转化产物的抗肿瘤活性测试：采用
MTT法[3]。在96孔培养板的每一个孔中加入90弘L
生长良好的NCI—H460(人非小细胞肺癌)肿瘤细胞
(约含有1×104／孔)，24h后加入供试样品，每组平
行设4个复孔，同时设阳性对照、阴性对照和空白对
照，在37℃、5％CO。条件下共同培养48h。然后，每
孔加入10肚L的MTT溶液(5mg／mL)继续培养4
h。离心弃去培养液，染色的细胞用DMSO(10pL／
孔)溶解，待结晶完全溶解后，用酶标仪于570nm处
测吸光度A值，计算细胞增殖抑制率[细胞增殖抑制
率一(A空白一A样品)／A空白x100％]，并进一步测定了
抑制肿瘤细胞生长的IC。。值。
3 结果
3．1 TLC分析结果：底物即化合物I和Ⅱ的微生
物酶解反应有新的斑点产生，而不加微生物的空白
对照组均没有新的斑点，结果显示，两种主要转化产
物极性小于底物。说明化合物I和Ⅱ在转化过程中
发生了变化，有新的化合物产生。
3．2 HPLC分析结果：见图2。主要转化产物的极性
比底物小，推测可能是长柄链格孢水解底物的糖基
而产生新的化合物。
3．3转化产物的分离：将转化产物粗品进行Diaion
HP20和ODS开放柱分离，分别用不同体积分数乙
醇水溶液和甲醇水溶液进行梯度洗脱，再进一步用
制备HPLC分离，减压浓缩，真空干燥，得单体化合
物Ⅲ和N。
3．4结构鉴定
万方数据
·992· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第7期2008年7月
0 4 8 12 16 20
3
0 4 8 12 16 20
t／rain
1化合物l(-ff两金皂苷A)2一化台物I(百两金皂苷B)
3化合物Ⅲ(百两金皂苷A转化产物)
4化合物Ⅳ(百两金皂甘B转化产物)
1-compound【(ardisiacrispinA)
2-compoundI(ar isiacrispinB)
3-compound_(productsotardisiacri pinA)
4-compoundⅣ(productsofardisiacrlspinIj)
图2化合物I(A)和Ⅱ(B)转化后的高效液相图谱
Fig．2HPLCChromatogramofcompoundsI(A)
andⅡ(B)afterbiotransformation
化合物Ⅲ：白色粉末，[a]静一18．4。(Me0H，f
0．2)。Libermann—Burchard反应阳性，表明该化合
物为三萜皂苷类化合物。酸水解薄层色谱检出阿拉
伯糖、葡萄糖和木糖。ESI—MS(positive)给出m／z：
921[M+Na]+，其ESI—MS2中给出m／z：789[M+
Na一132]+和627[M+Na一132—162]+；同样，
ESI—MS(negative)给出m／z：879[M—H]一，其ESI—
MS2中给出m／z：765[M—H一132]和603[M—
H一132—162]Ⅲ。ESIMS的结果结合1HNMR、
13c—NMR确定分子式为C；6H，。O，再将ESI—MS提
供的信息结合酸水解薄层的结果，说明结构中存在
一个阿拉伯糖、一个葡萄糖和一个木糖。1H—NMR
(300MHz，inPyridine—d。)中，高场显示了6个角甲
基氢信号[d0．85(3H，S，Me一25)，0，98(3H，S，Me一
24)，0．99(3H，s，Me一29)，1．27(3H，S，Me一23)，1．28
(3H，S，Me一26)，1．54(3H，S，Me一27)]，6个角甲基
氢信号是三萜皂苷类化合物的特征信号；低场区出
现了3个糖的端基质子信号[占5．04(1H，d，了=7．6
Hz，Glc一1)，4．89(1H，d，J；6．48Hz，Xy[一1)，4．65
(1H，d，J=6．96Hz，Ara一1)]以及1个醛氢信号
占9．60(s)。化合物Ⅲ的”C—NMR(150Hz，in
Pyridine—d。)谱数据见表1，其中共显示了46条谱
线，低场区有艿207．5的羰基碳信号；在占100～110
处有3个端基碳信号(艿105．5，107．7，108．1)。以上
数据与文献报道Ⅲ的西克拉明皂苷元A一3,a-o一[pD一
木吡喃糖基一(1--2)一pD一葡萄吡喃糖基一(1—4)一a一
￡．阿拉伯毗哺糖苷]的核磁数据相同。
表1化台物III和Iv的”C—NMR数据
Table1”C—NMRSpectradataofcompoundsiIandⅣ
化合物I＼『：白色粉末，[a]謦一12．2。(Me0H，c
0．2)。Libermann—Burchard反应阳性，表明该化合
物为三萜皂苷类化合物。酸水解薄层色谱检出阿拉
伯糖、葡萄糖和鼠李糖。ESI—MS(positive)给出m／z：
935[M+Na]+，其ESIMS2给出m／z：789[M+
Na一146]+和627[M+Na一146—162]+；同样，
ESI—MS(negative)给出m／z：911[M--HI一，其ESI—
MS2中给出了m／z：765[M—H一146]一和603[M～
H一146—162]一。ESI—MS的结果结合1H—NMR、
”C—NMR确定分子式为C；，H，。0，再将ESI—MS的
数据结合酸水解薄层的结果，说明结构中存在一个
阿拉伯糖、一个葡萄糖和一个鼠李糖。1H—NMR(300
MHz，inPyridine—d。)中，高场显示了6个角甲基氢
信号[d0．83(3H，S，Me一25)，0．94(3H，S，Me一24)，
1．00(3H．s。Me29)。1．20(3H，S，Me一23)，1．28
万方数据
中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第7期2008年7,El·993·
(3H，S，Me一26)，1．54(3H，S，Me一27)]以及鼠李糖6
位的甲基信号[占1．66(3H，d，，一5．61Hz，Rham一
6)]，6个角甲基氢信号是三萜皂苷类化合物的特征
信号；低场区出现了3个糖的端基质子信号[艿6．26
(1H，S，Rham一1)，5．15(1H，d，J一7．1z，Glc 1)，
4．74(1H，d，，一6．0Hz，Ara一1)]以及1个醛氢信号
p9．61(s)]。化合物IV的”C—NMR(150MHz，in
Pyridine—d。)谱中共显示了47条谱线，低场区有
d207．5的羰基碳信号；在艿100～110处有3个端基
碳信号(艿102．0，105．2，107．1)。将化合物N的
13C—NMR数据与文献报道[4]的西克拉明皂苷元A一
3pO-[a—L一鼠李吡哺糖基一(1—2)一pD一葡萄吡喃糖
基一(1—4)-a—L一阿拉伯吡喃糖苷]的核磁数据相对
照基本一致。
通过结构鉴定确定，两种主要转化产物分别为西
克拉明皂苷元A一3p0一pD一木吡喃糖基一(1—2)一pD一
葡萄吡喃糖基一(1—4)一oc—L一阿拉伯吡哺糖苷和西克
拉明皂苷元A一3pO—a一工一鼠李吡哺糖基一(1—2)一pD一
葡萄吡喃糖基一(1—4)一a—L一阿拉伯吡喃糖苷。
3．5活性结果：底物化合物I、Ⅱ和转化产物化合
物Ⅲ、IV针对肿瘤细胞NCI—H460的IC。。分别为
23．58、12．10、4．51、8．31弘mol／L。结果显示C一3位
末端去糖基后的转化产物对NCI—H460也具有很强
的抑制作用，活性稍强于转化前的底物。
4讨论
本实验首次发现了长柄链格孢(3．2875)对三萜
皂苷C一3位糖链末端的葡萄糖有选择性的水解作
用，为三萜皂苷去糖基衍生物的制备提供了依据，也
为扩宽该菌株的应用范围提供了依据。
通过薄层色谱、液相色谱和结构鉴定结果可看
出，微生物长柄链格孢(3．2875)能将化合物I和Ⅱ
C一3位末端的葡萄糖水解掉，转化为剩3个糖链的皂
苷，即西克拉明皂苷元A一3pO—pD一木吡喃糖基一
(1—2)一pD一葡萄吡喃糖基一(1—4)-a—L一阿拉伯吡喃
糖苷和西克拉明皂苷元A一3pO—a屯一鼠李吡喃糖基
(1—2)一pD一葡萄吡喃糖基一(1—4)一a—L一阿拉伯吡喃
糖苷。
利用MTT法测定底物和转化产物抑制NCI—
H460肿瘤细胞生长的IC。。值，比较转化产物和底物
的抗肿瘤活性，结果显示转化产物对于NCI—H460
的生长抑制作用强于底物，转化产物的抗肿瘤活性
仍需要大量的试验工作加以确认。
参考文献：
[1]江苏新医学院．中药大辞典[M3．上海：上海科学技术出版
社，2005．
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survival：applicationtOproliferationandcytotoxicityassa
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[4]LavaudC，MassiotG，BarreraJ B，eta1．Triterpenoid
saponinsfromMyrsinepellucida[J]．Phytochemistry，1994。
37：1671—1677．
红外光谱分析技术提高班通知
红外光谱分析技术在药物、天然产物、食品等领域的化合物的鉴定、未知化合物的结构分析、化合物的定量分析过程中起着非常
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汪冬梅高级工程师：在国家电化学和光谱研究分析中心长期从事红外、拉曼方面的试验和仪器操作，并利用红外进行过
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E—mail：training@instrument．eom．cn培训中心网址：http：／／training．instrument．corn．ca
万方数据
长柄链格孢对百两金皂苷的生物转化
作者： 隋玉辉， 刘岱琳， 邱峰， 陈虹
作者单位： 隋玉辉(中国人民武装警察部队医学院,生药教研室,天津,300162;沈阳药科大学中药学院,辽
宁,沈阳,110016)， 刘岱琳,陈虹(中国人民武装警察部队医学院,生药教研室,天津,300162)
， 邱峰(沈阳药科大学中药学院,辽宁,沈阳,110016)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(7)
被引用次数： 1次

参考文献(4条)
1.江苏新医学院 中药大辞典 2005
2.边宝林;王素芬;杨健 朱砂根及同属植物中三萜总皂甙及制备方法 2000
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4.Lavaud C;Massiot G;Barrera J B Triterpenoid saponins from Myrsine pellucida[外文期刊] 1994

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引证文献(1条)
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