全 文 ：二苯乙烯苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织细胞凋亡的影响
赵　玲1, 李春阳1, 张　丽1, 崔　巍2, 张　兰1, 李　林1Ξ
(11 首都医科大学宣武医院 药物研究室, 神经变性病教育部重点实验室, 北京　100053;
21 北京中医药大学东直门医院, 北京　100700)
摘　要: 目的　观察何首乌中提取的二苯乙烯苷对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型脑组织细胞凋亡及其凋亡调
节因子的影响, 阐明二苯乙烯苷抗缺血性脑损伤的作用机制。方法　采用插线法阻断大脑中动脉, 制备局灶性脑缺
血再灌注损伤大鼠模型。用流式细胞术 P I 单染法检测脑组织细胞凋亡百分率, 用流式细胞术间接荧光法检测细胞
凋亡调节因子 Bcl22 和Bax 蛋白的表达。结果　二苯乙烯苷应用于缺血再灌注损伤大鼠可明显降低脑组织细胞凋
亡百分率, 升高脑组织Bcl22 蛋白表达, 减少Bax 蛋白表达, 提升Bcl22öBax 比值。结论　二苯乙烯苷具有抑制大鼠
局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织细胞凋亡的作用, 其作用机制可能与升高抑制凋亡的 Bcl22 蛋白表达, 抑制诱导
凋亡的 Bax 蛋白表达, 降低二者比值有关。
关键词: 何首乌; 二苯乙烯苷; 局灶性脑缺血; 细胞凋亡
中图分类号: R 28611　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253- 2670 (2008) 03- 0394- 04
Effect of tetrahydroxy- st ilbene glucoside on cell apoptosis in foca l cerebra l ischem ia ra ts
ZHAO L ing1, L I Chun2yang1, ZHAN G L i1, CU IW ei2, ZHAN G L an1, L IL in1
(11D epartm ent of M ateria M edica, Xuan2w u Ho sp ita l of Cap ita lM edical U niversity, Key L abo rato ry fo r N eurodegenerative
D isease of M in istry of Education, Beijing 100053, Ch ina; 2. Dongzh im en Ho sp ita l, Beijing U niversity
of T radit ional Ch inese M edicine, Beijing 100700, Ch ina)
Abstract: Objective　To invest iga te the effect of tet rahydroxy2st ilbene gluco side (T SG) in the ex tract
of P oly g onum m u ltif lorum on cell apop to sis and its regu la t ive facto rs under the condit ion of focal cereb ra l
ischem ia in ra ts and to exp la in its m echan ism. M ethods　R at model of t ran sien t m iddle cereb ra l artery oc2
clu sion ( tM CAO ) w as u sed in the study. F luo rescen t sta in ing w ith flow cytom etry w as u sed to assay neu2
ron su rvival and apop to sis ra te; the exp ression of Bcl22 and Bax p ro tein s w as exam ined by flow cytom etry
at the sam e t im e. Results　Compared w ith sham group , the apop to t ic ra te of cereb ra l cells of model group
increased, Bcl22 p ro tein decreased, and Bax p ro tein increased sign if ican t ly, the ra t io of Bcl22öBax de2
creased. A fter g iven T SG fo r 7 d, the apop to t ic ra te of cereb ra l cells reduced sign if ican t ly, Bcl22 p ro tein
increased, and Bax p ro tein decreased sign if ican t ly, the ra t io of Bcl22öBax increased. Conclusion 　T SG
taken o ra lly cou ld inh ib it the cell apop to sis cau sed by focal cereb ra l ischem ia in ra ts, and it′s m echan ism
m ay be invo lved w ith increasing the exp ression of Bcl22 p ro tein w h ich can inh ib it cell apop to sis and de2
creasing the exp ression of Bax p ro tein w h ich can induce cell apop to sis and decrease the ra t io of Bcl22öBax.
Key words: P oly g onum m u ltif lorum T hunb. ; tet rahydroxy2st ilbene gluco side (T SG) ; focal cereb ra l
ischem ia; apop to sis
　　 二 苯 乙 烯 苷 ( 2, 3, 5, 4′2tet rahydroxy2
st ilbene222O 2Β2D 2gluco side, T SG) 是从中药何首
乌中提取的有效成分, 国内外研究表明, T SG 具有
抗氧化、抗补体、扩张血管、抑制 Ca2+ 2A T P 酶活性
等神经保护作用[1, 2 ]。本室以往的研究表明, T SG 可
明显拮抗连二亚硫酸钠诱导的大鼠原代培养海马神
经细胞拟缺血性损伤模型细胞存活率下降及乳酸脱
氢酶漏出率增多[3 ]; T SG 可明显改善双侧颈总动脉
永久性结扎大鼠模型的学习记忆能力, 减轻海马神
经元损伤程度, 降低过氧化产物的量[4 ]。本实验
T SG 对脑缺血致细胞凋亡的影响入手, 分析 T SG
抗脑缺血损伤的作用机制, 为其应用于临床提供实
·493· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2007205225
基金项目: 国家重点基础研究发展计划“973”项目 (2003CB517104) ; 国家自然科学基金项目 (30500664) ; 北京市自然科学基金项目
( 7050001, 7063079) ; 首都医学发展基金项目 (首发 03 Ë 21, 200223002) ; 北京市科技新星计划项目 ( 2005A 53,
H 020821390190)
作者简介: 赵　玲 (1972—) , 女, 辽宁沈阳人, 助理研究员, 博士, 主要从事神经药理学及中药药理学研究工作。
E2m ail: zhao ling72@ho tm ail. com3 通讯作者　李　林　T el: (010) 83198886　Fax: (010) 83154745　E2m ail: lin li97@ho tm ail. com
验依据。
1　材料与方法
111　动物: SD 雄性成年大鼠, 体重 260～ 300 g,
SPF 级, 由北京维通利华实验动物有限公司提供,
许可证号: SCXK [京 ]1120020008。手术前夜禁食不
禁水。
112　试剂与仪器: T SG (质量分数为 70% , 其余主
要成分有 7% 的大黄素) 由本室自行研制提取工
艺, 委托中国医药研发中心加工。尼莫地平片, 由正
大青春宝药业有限公司生产。碘化吡啶 (P I) 购自
Sigm a 公司。小鼠Bcl22 抗体和小鼠 Bax 抗体 (一
抗)、F ITC 标记的抗小鼠 IgG (二抗) , 由美国 San ta
C ruz 公司提供。FA CS Calibu r 型流式细胞仪, 美国
BD 公司产品。
113　动物模型的建立及分组给药: SD 大鼠随机分
为 6 组: 假手术组, 模型组, T SG 30、60、120 m gökg
组, 尼莫地平组 (14 m gökg)。给药组 ig 给药 7 d 后
造模。全部模型制作在层流环境下进行, 室温保持在
23～ 25 ℃, 相对湿度 60%。SD 大鼠用 10% 水合氯
醛 ip 麻醉 (014 gökg) , 采用插线法阻断大脑中动脉
的方法造成局灶性脑缺血模型。方法参照L onga 介
绍并略作修改[5 ]。栓塞后 2 h 拔线实现再灌注, 再灌
注 24 h 后断头取脑, 进行流式细胞术检测。假手术
组大鼠除不插入尼龙线外, 其他操作与手术组相同。
114　脑组织单细胞悬液的制备: 各组大鼠水合氯醛
ip 麻醉后断头处死, 迅速取脑, 在冰上切割脑块 (在
视交叉前 2 mm 和乳头体后缘做两道平行冠状切
口, 然后将其从正中矢状切开) , 取缺血侧脑块 (视
交叉～ 乳头体) 200 m g, 用 011 mo löL PBS (pH 值
为 714) 110～ 210 mL 冲洗, 吸出 PBS, 置入机械匀
浆器中, 剪碎脑组织, 加入适量 PBS 液, 迅速制成
2×106ömL 的单细胞悬液。收集细胞悬液, 过 200
目细胞筛, PBS 洗2 次, 800 röm in 离心 5 m in, 终体
积分数 70% 预冷乙醇固定过夜。
115　流式细胞仪检测细胞凋亡率: 取单细胞悬液,
4 ℃ PBS 洗2 次, 1 000 röm in 离心 5 m in, 取沉淀,
调细胞浓度为 2×105ömL , 取细胞悬液 015 mL , 加
入 20 m göL RNA ase A , 37 ℃ 恒浴 30 m in, 再加入
50 m göL P I 和 013% T riton2X100 共同染色, 摇匀
后 4 ℃ 避光放置 60 m in, 经 300 目尼龙网滤过, 在
FA CS Calibu r 型流式细胞仪上检测 (激发光波长
488 nm ) , 应用 cell Q uest 多功能软件获取细胞数
10 000 个, 再以M odit L T 分析软件分析细胞周期,
并拟合计数细胞凋亡。
116　流式细胞仪检测Bcl22、Bax 蛋白表达: 取 4 ℃
保存的单细胞悬液 110 mL , 用 PBS 液冲洗细胞, 加
入Bcl22 抗体 (1∶500) , Bax 抗体 (1∶300) , 反应
20 m in, PBS 冲洗 2 次, 加二抗 (1∶100) , 避光反应
20 m in, 再以 PBS 洗涤 2 次, 300 目尼龙网滤过后,
上流式细胞仪检测, 应用 cell Q uest 多功能软件获
取细胞数 10 000 个, 检测 F ITC 标记的抗小鼠 IgG
的面积。流式细胞仪激发光源为 15 mW 氩离子激
光, 波长 488 nm , 用 cell Q uest 软件系统收集细胞
并分析处理数据, 以同型对照确定阴性及阳性区域,
然后复制到所对应样品的测定图上, 分析其阳性细
胞百分率, 减去非特异对照值。
117　统计学分析: 各组数据均以 x ±s 表示, 采用
SPSS 软 件 的 单 因 素 方 差 分 析 ( O ne2w ay
ANOVA ) , 进行多组间比较。
2　结果
211　T SG 对缺血侧脑组织细胞凋亡率的影响: 流
式细胞术细胞周期定量分析表明, 凋亡细胞内的小
分子 DNA 丢失, 因此在 DNA 含量分布直方图上
出现一个“亚G1 峰”, 峰的大小即代表凋亡细胞的多
少。假手术组细胞凋亡率低, 基本没有出现亚 G1凋
亡峰, G0öG1期细胞比例为 (80149±5189) % ; G2öM
期为 (1125±1108) % ; S 期为 (18126±5187) % ; 模
型组大鼠在DNA 直方图的 G0öG1期前出现明显的
亚二倍体凋亡峰, 细胞凋亡率较假手术组明显增加,
G0öG1期细胞比例为 (93179±1133) % , 较假手术组
明显升高; G2öM 期为 (1139±0183) % , 与假手术
组无明显区别; S 期为 (4183±1182) % , 较假手术
组明显降低, 提示模型组缺血侧脑组织大部分细胞
处于静止期。与模型组相比, T SG 组亚二倍体凋亡
峰所占比例明显减小, 细胞凋亡率明显降低, 细胞周
期未见明显异常, 提示 T SG 对模型大鼠的细胞周
期无明显影响。结果见表1。
212　T SG 对缺血侧脑组织细胞凋亡调节因子的影
响: 结果见表2。大鼠缺血 2 h、再灌注 24 h 后, 缺血
侧脑组织表现为 Bcl22 蛋白表达减少, Bax 蛋白表
达增多,Bcl22öBax 的值明显降低; T SG 各组同模型
组相比较, 能升高脑组织Bcl22 蛋白表达, 减少Bax
蛋白表达, 升高Bcl22öBax 的值。
3　讨论
　　研究发现脑缺血时, 缺血中心区的细胞很快死
亡, 而周围区尤其是半暗带的一些神经细胞呈现为
凋亡的形态学变化, 如不能及时给予有效的治疗, 缺
血周围区凋亡细胞亦趋于死亡。可见抑制细胞由凋
·593·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
表 1　TSG 对缺血侧脑组织细胞凋亡率的影响
Table 1　Effect of TSG on apoptotic rate in
cerebra l tissue of ischem ic side
组别 剂量ö(m g·kg- 1) 动物数ö只 凋亡率ö%
假手术 - 5 0114± 0116
模型 - 5 20126±11107# #
T SG 30 4 7183± 51553 3
60 4 6117± 31993 3
120 6 5156± 41913 3
尼莫地平 14 4 5192± 31313 3
　　与假手术组比较: # # P < 0101; 　与模型组比较: 3 3 P < 0101
　　# # P < 0101 vs Sham group; 　3 3 P < 0101 vs model group
表 2　TSG 对缺血侧脑组织 Bcl-2 和 Bax 蛋白表达的影响
Table 2　Effect of TSG on expression of Bcl-2 and Bax
in cerebra l tissue of ischem ic side
组别
剂量ö
(m g·kg- 1)
动物数ö
只
Bcl22 蛋白 Bax 蛋白 Bcl22öBax
假手术 - 5 143197±40100 155105± 32106 0197±0133
模型 - 5 48106±17167# # 367158±102112# # 0113±0105# #
TSG 30 4 75106±26150 218156±831823 3 0137±0118
60 4 84154±21116 180169±221543 3 0146±0117
120 6 118115±431173 3 189181±731483 3 0172±01423 3
尼莫地平 14 4 135142±381873 3 198129±471073 3 0170±01203 3
　　与假手术组比较: # # P < 0101; 　与模型组比较: 3 3 P < 0101
　　# # P < 0101 vs Sham group; 　3 3 P < 0101 vs model group
亡向坏死转变, 缺血周围区向梗死中心区发展是治
疗脑缺血的关键, 其中, 抑制细胞凋亡可能是脑缺血
机制研究的重要环节。以此为靶点, 进行抗脑缺血药
物的研究, 也将成为新的关注热点。
研究已经证明, 在发生缺血性脑卒中时造成神
经元死亡的方式主要为坏死与凋亡两种, 而在整个
病程中梗死组织的病理生理变化是由两种方式混合
而成的[6 ]。动物实验已发现缺血性脑损害的早期就
出现凋亡细胞, 以皮质、海马、纹状体等部位为主,
24 h 最明显, 并持续几天或几周[7 ]。L i 等[8 ]用大脑
中动脉闭塞模型研究发现闭塞 10～ 20 m in, 纹状体
及视前区的凋亡细胞数为 10～ 20 个, 闭塞 30～ 80
m in 凋亡细胞数量增加 30～ 60 个, 并扩展到大脑皮
质, 选择性神经元闭塞 90～ 120 m in 时凋亡细胞达
70～ 200 个, 形成凋亡细胞群。
本实验表明, 大鼠脑缺血 2 h 再灌注 24 h 后,
缺血侧脑组织出现明显的亚二倍体凋亡峰, 细胞凋
亡率明显增加, T SG 能明显降低缺血侧脑组织细胞
凋亡率, 表明 T SG 有一定的抑制脑缺血损伤诱导
的神经细胞凋亡的作用。
脑缺血是诱导基因表达的最强烈刺激之一, 脑
缺血后大约有80 余种基因被诱导表达, 参与细胞凋
亡的调控。Bcl22 家族蛋白是凋亡的重要调控因子,
在脑缺血后细胞凋亡中发挥重要作用, 其中,Bcl22
可抑制细胞凋亡, 研究表明,Bcl22 mRNA 的表达与
脑缺血的严重程度有关[9 ]。短暂性阻断大鼠大脑中
动脉 (M CAO ) 20 m in 后, 豆状核区 Bcl22 的表达
明显升高, 3 d 后达峰值, 持续至 7 d, 并且能诱导脑
组织对随后 60 m in 的缺血性脑损伤产生耐受; 全脑
缺血后, Bcl22 蛋白在 CA 3区表达升高, 而在 CA 1区
无表达, 这也是 CA 1区神经元易受损的原因之一。
另有研究表明,Bcl22 在M CAO 大鼠脑内的过度表
达可以促进神经发生和新生神经元的存活、分化成
GABA 能神经元和胆碱能神经元, 并抑制新生神经
元的凋亡, 与缺血后脑组织的修复密切相关[10 ]。目
前认为,Bcl22 的这种变化可能是神经细胞自我保护
机制之一, 以防止或减少脑缺血再灌注后细胞凋亡
的发生。Bax 是一种促进细胞凋亡的蛋白。研究表
明, Bax mRNA 的诱导表达在短暂性脑缺血后 6 h
开始逐渐增加, 在 24 h 达峰值, 7 d 下降到基础水
平。另有研究证实[11 ] , 大脑中动脉短暂性缺血 2 h,
再灌 24 h 后梗死周围区 Bax 蛋白免疫活性增高。
全脑缺血后 Bax mRNA 与蛋白质主要表达于 CA 1
区且发生在迟发性细胞凋亡前, 而在 CA 3区无表
达。CA 1区Bax 的选择性表达表明: Bax 可通过独立
机制或与Bcl22 基因家族其他成员形成杂二聚体机
制, 参与调控脑缺血时 CA 1区神经元的凋亡。本实
验表明, 大鼠脑缺血 2 h 再灌注 24 h 后, 缺血侧脑
组织 Bcl22 蛋白表达减少, Bax 蛋白表达增多, Bcl2
2öBax 的比值明显降低; T SG 能明显升高缺血侧脑
组织Bcl22 蛋白表达, 减少Bax 蛋白表达。提升Bcl2
2öBax 的值。本研究结果提示, 何首乌中提取的
T SG 可以通过上调Bcl22 蛋白表达、下调Bax 蛋白
表达, 抑制缺血因素诱导的神经细胞凋亡, 从而具有
治疗脑缺血性损伤的前景。
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白芨超微粉对大鼠实验性胃溃疡的影响
刘　莹1, 崔炯莫1, 李洪斌2, 王艳萍2, 汤　真2, 于海瑶2, 吴艳云2Ξ
(11 延边大学, 吉林 延吉　133000; 21 中国人民解放军第 208 医院, 吉林 长春　130062)
摘　要: 目的　通过大鼠胃溃疡实验比较白芨普通粉 (80、200 目) 和超微粉的药效学区别及白芨经超微粉碎后可
降低的用药剂量。方法　采用大鼠无水乙醇和醋酸致胃黏膜损伤型胃溃疡模型, 测定溃疡面积, 计算溃疡抑制率;
取溃疡部组织切片, 做 H E 染色, 从病理学角度进一步观察病理情况。结果　白芨粉可明显降低大鼠的溃疡面积,
且超微粉疗效优于普通粉。结论　超微粉碎后有助于提高白芨的药效, 减少用药剂量, 有利于剂型现代化。
关键词: 超微粉; 白芨; 胃溃疡模型
中图分类号: R 28611　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253- 2670 (2008) 03- 0397- 04
Effect of ultra-f ine powder of B letilla s tr ia ta on exper im en ta l ga str ic ulcer in ra ts
L IU Y ing1, CU I J iong2mo 1, L I Hong2b in2, W AN G Yan2p ing2,
TAN G Zhen2, YU H ai2yao 2, W U Yan2yun2
(11Co llege of Pharm acy, Yanbian U niversity, Yan ji 133000, Ch ina;
2. N o. 208 Ho sp ita l of PLA , Changchun 130062, Ch ina)
Abstract: Objective　To compare the pharm acodynam ics of common B letilla stria ta pow der (80 and
200 m eshes) w ith u lt ra2f ine pow der of B . stria ta on experim en ta l gast ric u lcer in ra ts and to clarify how
m uch the do se of B . stria ta w as decreased after superf ine comm inu t ion. M ethods　T he models of gastric
u lcer w ere set up by anhydrou s alcoho l and acet ic acid to m easu re the gastric u lcer area and coun t ou t the
inh ib ito ry ra te; T he t issue slice of gastric u lcer cica trix w as go t far H E sta in ing. Based on the view po in t of
patho logy the mo rb id sta te w as ob served. Results　B . stria ta pow der cou ld decrease the gastric u lcer area
sign if ican t ly, and the group s of u lt ra2f ine pow der w ere advan taged to the o thers. Conclusion　A fter su2
perf ine comm inu t ion, the po tency of B . stria ta can be imp roved w ith its do se reducing. It is good fo r mo2
dern iza t ion of m ak ing do sage fo rm s.
Key words: u lt ra2f ine pow der; B letilla stria ta (T hunb. ) R eichb. f. ; gast ric u lcer model
　 　 白 芨 为 兰 科 植 物 白 芨 B letilla stria ta
(T hunb. ) R eichb. f. 的干燥块茎。传统医学认为白
芨具有收敛止血、消肿生肌的功能。用于咳血吐血、
外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂、肺结核咳血、溃疡病
出血的治疗。现代研究表明白芨治疗消化性溃疡及
出血具有较好的疗效。中药经超微粉碎后可提高其
生物利用度、增加有效成分的溶出度等, 并且在达到
相同药效的情况下可减小药物的用药剂量。本实验
研究白芨经超微粉碎后对大鼠无水乙醇和醋酸致胃
黏膜损伤型胃溃疡模型的疗效及白芨经超微粉碎后
·793·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2007205228
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30672672)
作者简介: 刘　莹 (1982—) , 女, 吉林省九台市人, 延边大学药学院在读硕士, 从事缓释制剂的研究。
T el: (0431) 86988187　E2m ail: liuying. 0916@ 163. com