全 文 ：·药理与临床·
鱼藤素对人骨髓瘤细胞 RPMI28226 增殖和凋亡的影响
及对核受体共激活因子23 的调控作用
李 　睿 ,陈 　燕 3 ,舒文秀
(华中科技大学同济医学院协和医院血液病研究所 ,湖北 武汉 　430022)
摘　要 :目的 　观察鱼藤素对人多发性骨髓瘤细胞株 RPMI28226 细胞增殖和凋亡的影响及其对核受体共激活因
子23 (SRC23) 的调控作用 ,研究鱼藤素诱导凋亡作用与其调节 SRC23 的相互关系。方法 　采用 M TT 法检测细胞
增殖活性 ,Annexin2V FITC/ PI 双标法及 Hoechst 33258 染色法分析细胞凋亡的改变 , RT2PCR 法检测鱼藤素对
RPMI28226 细胞内 SRC23 基因表达的影响 ;免疫组化法检测鱼藤素对 RPMI28226 细胞 SRC23 蛋白的影响和分布
情况。结果 　鱼藤素能明显抑制 RPMI28226 细胞的增殖 ,其抑制作用呈时间、剂量依赖性 ,其作用 24 h 的 IC50为
(54155 ±0140) nmol/ L 。此外 ,鱼藤素具有较强的诱导 RPMI28226 细胞凋亡的效应 , 25 nmol/ L 即能诱导
(17104 ±0173) % 的 RPMI28226 细胞发生凋亡 ;当药物浓度达到 100 nmol/ L 时 ,总凋亡率达 (63157 ±1136) %。
在 RPMI28226 细胞中 SRC23 高表达 ,且主要分布于细胞核 ,经鱼藤素干预后 ,SRC23 的 mRNA 和蛋白表达水平明
显下降。结论 　鱼藤素能明显抑制 RPMI28226 细胞的增殖 ,并诱导其凋亡。而鱼藤素诱导的 SRC23 表达量的下
调可能参与了其诱导凋亡作用。
关键词 :鱼藤素 ; 多发性骨髓瘤 ; 凋亡 ; 核受体共激活因子23 (SRC23)
中图分类号 :R286191 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0721086205
Effect on proliferation and apoptosis in RPMI28226 human myeloma cells
and regulation on steroid receptor coactivator23 by deguel in
L I Rui , CH EN Yan , SHU Wen2xiu
( Institute of Hematology , Union Hospital , Tongji Medical College , Huazhong University
of Science and Technology , Wuhan 430022 , China)
Abstract : Objective 　To investigate t he effect s of deguelin on t he proliferation inhibition and apoptosis
induction in RPMI28226 cells i n vi t ro , as well as the regulation of steroid receptor coactivator23 ( SRC23)
to explore t he relationship between t hem. Methods 　The effect of deguelin on t he growt h of RPMI28226
cells was st udied by M T T assay. Apoptosis was detected t hrough Hoechst 33258 staining and Annexin2V
FITC/ PI double2labeled cytomet ry. R T2PCR Technology was applied to assessment of t he mRNA expres2
sion of SRC23 , whereas , SRC23 p rotein expression and localization were determined by using immunohisto2
chemist ry met hod. Results 　Deguelin p resented st riking p roliferation inhibition potency on RPMI28226
cells i n vi t ro and apoptosis induction activity in a time2 and dose2dependent manner . The IC50 value for 24
h was (54. 55 ±0. 40) nmol/ L , (17. 04 ±0. 73) % RPMI28226 cells went apoptotic when t reated wit h 25
nmol/ L deguelin for 24 h , with t he dose of deguelin increasing to 100 nmol/ L , (63. 57 ±1. 36) % cells were
apoptotic. Over2expression of SRC23 was found in RPMI28226 cells , whereas t he mRNA and protein ex2
pression levels of SRC23 were significantly downregulated in RPMI28226 cells induced by deguelin in a
dose2dependent manner . The disposition of SRC23 was sit uated mainly at t he nuclear , occasionally in t he
cytoplasm. Conclusion 　Deguelin exhibited potent p roliferation inhibition to the human myeloma cell line
RPMI28226 cells , f urt hermore , deguelin might induce RPMI28226 cells apopto sis in a dose2dependent man2
ner , which might correspond to the regulation of the expression of SRC23.
Key words : deguelin ; multiple myeloma ; apoptosis ; steroid receptor coactivator23 (SRC23)
·6801· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
3 收稿日期 :2008212209　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30472267)
作者简介 :李　睿 (1978 —) ,女 ,云南省昆明市人 ,住院医师 ,在读博士 ,研究方向为恶性血液病。
Tel : (027) 85726009 　E2mail : lirui2514 @163. com3 通讯作者　陈　燕　Tel : (027) 85726009 　Fax : (027) 85726916 　E2mail : yanchen @public. wh. hb. cn
　　鱼藤素是从植物鱼藤中提取的一种新型有效的
抗癌药物 ,在非洲、南美以及中国曾作为一种杀虫剂
而广泛使用[1 ] 。近年来国内外研究表明鱼藤素有明
显地抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
核受体共激活因子23 ( steroid receptor coactivator2
3 , SRC23) 属于 P160 类固醇激素受体共活化因子
家族 ,其不仅作用于核受体 ,也作用于其他转录因
子 ,从而调控一系列细胞过程 ,包括细胞生长、分化
以及迁移等[2 ] 。近来研究发现 SRC23 在许多肿瘤
的发生和发展中起着关键作用 ,但 SRC23 在恶性血
液病中的研究甚是少见。本研究通过观察鱼藤素对
人多发性骨髓瘤细胞株 RPMI28226 细胞增殖和凋
亡的影响及对 SRC23 的调控作用 ,探讨两者的相互
关系 ,为鱼藤素的临床应用提供新的理论基础。
1 　材料与方法
111 　药物与试剂 : 鱼藤素 ( deguelin ,分子式为
C23 H22 O6 ,相对分子质量为 39414 ,购自 Sigma 公
司 ,质量分数 98 %) ,用二甲基亚砜 (DMSO) 稀释
成 1 mmol/ L ,等量分装 , - 20 ℃保存 ,临用前用
RPMI 1640 培养液稀释。M T T、DMSO、碘化丙锭
( PI) 、Hoechst 33258 荧光染液均为 Sigma 公司产
品 ;Annexin2V FITC/ PI 试剂盒购自深圳晶美生物
工程有限公司 ; RNA 抽提试剂 Trizol 和 RPMI
1640 培养基由 Gibco BRL 公司提供 ; 胎牛血清
( FCS) 购自杭州四季青生物工程材料有限公司。
R T2PCR 试剂盒购自 Fermentas 公司 ,引物由上海英
骏生物技术有限公司合成。小鼠抗人单克隆抗体
SRC23 购自美国 Cell Signaling 公司 ,SP 免疫组化试
剂盒和 DAB 显色试剂盒购自北京中山试剂公司。
112 　细胞培养 : 人多发性骨髓瘤细胞株 RPMI2
8226 细胞由华中科技大学同济医学院免疫教研室
提供。RPMI28226 细胞使用含 10 % 灭活胎牛血
清、青霉素 100 U/ mL 、链霉素 100μg/ mL 的 RP2
MI 1640 培养液 ,37 ℃、5 % CO2 、水饱和湿度条件
下培养。每 1～2 d 换液传代 1 次 ,取细胞活性大于
98 % 的对数生长期细胞 ,细胞悬液终浓度为 1 ×
106 / mL ,分别与不同浓度 (25～100 nmol/ L ) 的鱼
藤素共同培养 24 h 后检测指标。
113 　M T T 法检测细胞增殖 :将处于对数生长期的
RPMI28226 细胞 (2 ×105 / mL) 接种于 96 孔板 ,每
孔体积 200μL ,经不同浓度鱼藤素处理 24～72 h
后 ,加入 5 mg/ mL M T T 20μL ,37 ℃继续孵育 4
h ,小心吸去孔内培养上清液 ,每孔加入 150 μL
DMSO ,振荡 10 min ,使结晶充分溶解后于 Bio2Rad
M450 酶标仪测定 492 nm 波长处的吸光度 ( A )
值 ,每个实验重复 3 次。计算细胞增殖抑制率及
IC50值。
增殖抑制率 = (1 - 实验组 A 值/ 对照组 A 值) ×100 %
114 　Annexin2V FITC/ PI 双标法流式细胞术检测
细胞凋亡 :收集不同浓度鱼藤素处理后的 RPMI2
8226 细胞及空白对照组细胞 ,用 4 ℃预冷的 PBS
洗涤 2 次 ,然后以 1 ×106 / mL 的细胞密度重悬于
100μL 的 1 ×结合缓冲液中 ,加入 5μL Annexin2V
FITC 和 10μL PI 染液 ,轻轻混匀 ,避光室温反应
15 min ,再加入 300μL 的 1 ×结合缓冲液 ,于 1 h
内上机检测。
115 　Hoechst 33258 染色 :收集各组的 RPMI28226
细胞 ,PBS 洗 1 次 ,加 015 mL 甲醇2冰醋酸 (3 ∶1)
室温固定 20 min ,离心去除固定液 ,PBS 洗 1 次 ,将
细胞涂到预先经多聚赖氨酸处理的玻片上 ,置于空
气中干燥 ;用含有 012 % Triton X2100 的 PBS 处理
5 min ,PBS 洗 1 次 ;滴加 Hoechest 33258 染液 (10
μg/ L) 37 ℃避光染色 20 min ,弃去染色液 ,用蒸馏
水洗 3 次 ,甘油封片。于荧光显微镜下观察 ,并照相
保存。
116 　R T2PCR 检测 SRC23 mRNA 表达 : Trizol 法
提取细胞总 RNA ,按说明书合成 cDNA。R T 反应
液组成 : dd H20 8 μL , 5 ×R T buffer 4 μL , dN TP
(10 mmol/ L) 2μL ,Oligo (d T) 1μL , RNase 抑制
剂 1μL , RNA 样品 3μL , Rever Tra Ace (500 U/
μL) 1 μL 。按以下条件进行 R T 反应 : 42 ℃、20
min ,99 ℃、5 min ,4 ℃、5 min , - 20 ℃保存。以细
胞 cDNA 的第一链为模板 ,做 25μL 的 PCR。PCR
反应液组成 : 10 ×buffer 2. 5 μL , MgCl2 2 μL ,
dN TP (10 mmol/ L) 1μL , cDNA 2μL , dd H20 15
μL ,引物 1 (10 p mol/μL) 1μL ,引物 2 (10 p mol/
μL) 1μL , Taq 酶 015μL ;混匀后 ,短暂离心 ,进行
PCR 反应。SRC23 的 PCR 扩增条件为 : 94 ℃、5
min ,94 ℃、30 s ,60 ℃、1 min ,后 2 步共循环 10 次 ,
94 ℃、30 s ,58 ℃、40 s ,72 ℃、1 min ,循环 30 次 ,
72 ℃延伸 7 min ,4 ℃保存。PCR 产物的电泳分
析 :取 5μL 产物经 115 % 琼脂糖凝胶电泳 ,紫外线
照相进行扫描分析 ,以 SRC23/β2actin 进行 SRC23
基因表达水平的半定量分析。SRC23 引物序列 :上
游引物为 52T GT T TCCGTCTCGA T TCACCA23 ;
下 游 引 物 为 52GA T TA GGA GAAAACT T G2
GA TCC23 ;扩增产物为 392 bp 。β2actin 引物序列 :
上游引物为 52CT GTCCCT GTA T GCCTCT G23 ;下
·7801·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
游引物为 52A T GTCACGCACGA T T TCC23 ;扩增
产物为 218 bp 。
117 　免疫组化法检测 SRC23 蛋白水平 :用不同浓
度的鱼藤素处理 RPMI28226 细胞 24 h 后 ,丙酮固
定 ,正常血清封闭后分别加入 SRC23 抗体 ( 1 ∶
50) ,随后加入生物素山羊抗小鼠抗体及 SABC 液 ,
经 DAB 显色 ,以 PBS 代替一抗作为阴性对照。阳
性结果判定标准 :光学显微镜下 , SRC23 蛋白表达
阳性细胞的胞浆和胞核内呈现特异性棕褐色。计算
阳性表达率 (阳性表达率 = 500 个细胞内阳性细胞
数/ 500 ×100 %) 。
118 　统计学方法 :应用统计学软件 SPSS 1310 进
行统计学分析 ,数据以 x ±s 表示 ,组间比较采用 t
检验。
2 　结果
211 　鱼藤素对 RPMI28226 细胞增殖的影响 :分别
以 5、10、20、40、80、160 nmol/ L 鱼藤素作用 RPMI2
8226 细胞后 ,各处理组细胞的增殖活性明显低于空
白对照组。随着药物作用时间和作用浓度的逐渐增
加 ,鱼藤素对 RPMI28226 细胞的增殖抑制作用逐渐
增强 ,其作用 24 h 的 IC50 值为 ( 54155 ±0140)
nmol/ L ,随着药物作用时间的延长 ,其 IC50 值也逐
渐减小 ,作用 48、72 h 的 IC50 值分别为 (39105 ±
0132) 和 (20138 ±0125) nmol/ L ,见图 1。
212 　鱼藤素对 RPMI28 2 2 6细胞凋亡的影响 : 图 1 　鱼藤素对 RPMI28226 细胞增殖抑制作用 ( n = 3)Fig. 1 　Inhibition of deguelin on proliferationin RPMI28226 cells ( n = 3)Annexin2V FITC/ PI 双标法检测鱼藤素对 RPMI28226 细胞凋亡的影响 ,其中早期凋亡细胞指 Annex2in2V FITC 标记阳性 ,而 PI 标记阴性的细胞群 ;晚期凋亡细胞指的是 Anexin2V FITC 与 PI 均标记阳性的细胞群。如图 2 和表 1 所示 ,随着鱼藤素作用浓度的增加 ,越来越多的 RPMI28226 细胞发生凋亡。213 　Hoechst 33258 染色检测鱼藤素对 RPMI28226 细胞凋亡形态的改变 : 从图 3 中 ,发现 50nmol/ L 鱼藤素作用 RPMI28226 细胞 24 h 后 ,出现了典型的细胞凋亡形态改变 ,如染色质浓缩、边缘化 ,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等。而未经鱼藤素处理细胞可见完整的细胞膜和有序折叠的染色质。
图 2 　鱼藤素对 RPMI28226 细胞凋亡的影响
Fig. 2 　Effect of deguelin on apoptosis of RPMI28226 cells
表 1 　鱼藤素对 RPMI28226 细胞凋亡率的影响 ( x ±s , n = 3)
Table 1 　Effect of deguelin on apoptosis rate
of RPMI28226 cells ( x ±s , n = 3)
组别 C/ (nmol ·L - 1 ) 早期凋亡率/ % 晚期凋亡率/ % 总凋亡率/ %
对照 　 - 3131 ±0102 0198 ±0101 4129 ±0103
鱼藤素 25 15116 ±0162 3 3 1188 ±0111 3 3 17104 ±0173 3 3
50 25120 ±0196 3 3 9108 ±0131 3 3 34128 ±1127 3 3
100 48151 ±0153 3 3 15106 ±0183 3 3 63157 ±1136 3 3
　　与对照组比较 : 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs cont rol group 214 　R T2PCR 方法检测鱼藤素对 RPMI28226 细胞SRC23 的 mRNA 调控作用 :结果观察到在未经鱼藤素处理的 RPMI28226 细胞中 SRC23 的 mRNA呈高表达 ,经不同浓度的鱼藤素作用 24 h 后 ,细胞内 SRC23 的基因表达水平呈浓度依赖性下调。低浓度的鱼藤素 (25 nmol/ L) 对 SRC23 的 mRNA 表达影响不大 ( P > 0105) ;随着鱼藤素作用浓度的进一步增加 ,SRC23 的 mRNA 表达水平呈递减趋势 ,
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50、100 nmol/ L 鱼藤素作用后 ,SRC23 mRNA 表达
水平和对照组相比差异非常显著 ( P < 0101) ,见图
4 和表 2。
表 2 　鱼藤素 对 RPMI28226 细胞 SRC23 mRNA
表达的影响 ( x ±s , n = 3)
Table 2 　Effect of deguelin on mRNA expression of SRC23
in RPMI28226 cells ( x ±s , n = 3)
组别 C/ (nmol ·L - 1) SRC23/β2actin
对照　 　0 01 91 ±0106
鱼藤素 25 01 88 ±0104
50 01 65 ±0102 3 3
100 01 39 ±0103 3 3
　　与对照组比较 : 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs cont rol group
215 　免疫组化方法检测鱼藤素对 RPMI28226 细胞
SRC23 的蛋白表达的调控作用和分布情况 :光镜
下 ,可见 SRC23 在 RPMI28226 细胞中高表达 ,而且
主要分布于细胞核内 ,少量可见胞浆表达 ,对照组积
分吸光度值高达 156185 ±2140 ,经 50 nmol/ L 的鱼
藤素作用 24 h 后 ,SRC23 的蛋白表达明显减少 ,积
分吸光度值降至 56116 ±1175 ( P < 0101) ,见图 5。
3 　讨论
　　研究表明鱼藤素可以显著抑制结肠癌细胞系
H T229 的生长 ,可以诱导人的前恶性和恶性支气管
上皮细胞凋亡 ,而对人正常的细胞没有杀伤作
图 5 　鱼藤素对 RPMI28226 细胞 SRC23 蛋白表达的影响
Fig. 5 　Effect of deguelin on protein expression
of SRC23 in RPMI28226 cells
用[3 ,4 ] ,是一种安全有效 ,可以长期连续使用的抗癌
药物。最近的研究表明 ,鱼藤素对多种白血病细胞
的生长也有明显的抑制作用 ,但对人多发性骨髓瘤
细胞株 RPMI28226 细胞的作用机制尚未见报道。
本实验以体外培养的 RPMI28226 细胞作为研究对
象 ,观察了鱼藤素对 RPMI28226 细胞的生长抑制和
诱导凋亡作用 ,并探讨其可能的分子机制。
本研究结果发现鱼藤素能明显抑制 RPMI2
8226 细胞的增殖 ,该抑制作用与药物作用时间和药
物作用浓度呈正相关。多项实验结果表明鱼藤素对
RPMI28226 细胞具有较强的诱导凋亡作用 ,低浓度
的鱼藤素 (25 nmol/ L) 即能诱导 RPMI28226 细胞
发生凋亡 ;当药物浓度达以 50 nmol/ L 时 ,凋亡率
明显增加 ,并逐渐出现染色质浓缩、边缘化 ,核膜裂
解、染色质分割成块状和凋亡小体等凋亡形态的改
变。研究发现 ,鱼藤素抗凋亡作用可能与其抑制
PI3 K/ Akt 及 N F2κB 信号通路有关[5 ,6 ] 。另外 ,前
期研究还发现鱼藤素通过调控核孔蛋白和核磷蛋白
从而诱导细胞凋亡[ 7 ,8 ] 。
SRC23 又称为 NCOA3、P/ CIP、RAC3、ACTR
和 TRAM1 ,属于 P160 类固醇激素受体共活化因
子家族 ,此家族还包括 SRC21 和 SRC22 ( TIF2/
GRIP1) 。SRC23 不仅作用于核受体如雌激素受体
( ER) 、孕激素受体 ( PR) 和甲状腺激素受体 ,也作
用于其他转录因子 ,包括转录因子 A P21、核因子2κB
(N F2κB) 、信号转导子和转录激活子 ( STA T) 及转
录因子 E2F1[9 ] 。故 SRC 的浓度和活性的变化明显
影响许多基因表达水平 ,从而调控一系列细胞过程 ,
包括细胞增殖、分化和迁移等。近来发现 SRC23 基
因在多种恶性肿瘤细胞如乳腺癌、前列腺癌、胰腺
癌、胃癌和肝癌等实体瘤中过量表达 ,而在对应的正
常组织、良性肿瘤或增殖性病变中 , SRC23 呈不表
达或弱表达。因此 , Henke 等[ 10 ] 认为 SRC23 可以
作为肿瘤诊断的检测指标之一。此外 ,大量研究还
显示 ,肿瘤细胞内 SRC23 的高表达 ,都与肿瘤的转
·9801·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
移和复发有密切关系[ 11 ,12 ] 。近来的研究也发现
SRC23 在白血病细胞系 K562 中呈现高表达 ,并且
与细胞耐药性相关 ,诱导 SRC23 表达下调后可能促
进白血病细胞的凋亡[13 ] 。在转基因小鼠中 , SRC23
基因高表达明显促进肿瘤发生[14 ] ,而在基因敲除小
鼠模型中 , SRC23 缺乏抑制小鼠肿瘤形成[15 ] 。因
此 ,有报道认为 SRC23 可以成为新的化疗靶点。本
实验的初步结果显示 ,在 RPMI28226 细胞中 SRC23
呈高表达 ,经不同浓度的鱼藤素处理后 ,其蛋白和基
因表达水平均以浓度依赖性方式逐渐递减。而且发
现在 RPMI28226 细胞中 , SRC23 主要位于细胞核
内 ,经鱼藤素干预后 ,SRC23 的表达明显减弱 ,其细
胞定位没有明显改变。然而 ,鱼藤素是如何影响
SRC23 表达 ,它又改变了哪些重要蛋白或基因仍不
清楚 ,有待进一步的研究去发现。
综上所述 ,本实验表明鱼藤素作为一种高效低
毒的抗肿瘤活性成分 ,具有显著抑制肿瘤细胞增殖、
诱导细胞凋亡的作用 ,而该作用可能与其抑制
SRC23 的表达有关 ,因此有望成为一种新型的高效
的抗肿瘤药物。
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利用稻瘟霉模型筛选粗疣合叶苔内生真菌中的活性菌株
郭 　蕾1 ,吴锦忠2 ,许强芝3 ,韩 　婷1 ,秦路平1 3
(11 第二军医大学药学院 生药教研室 ,上海 　200433 ; 21 福建中医学院 中西医结合研究院 ,福建 福州 　350003 ;
31 第二军医大学 生物化学与分子生物学教研室 ,上海 　200433)
摘　要 :目的 　利用稻瘟霉模型快速筛选粗疣合叶苔内生真菌中具有生物活性的菌株 ,并对活性菌株 T11 进行鉴
定。方法 　首次对粗疣合叶苔内生真菌进行了分离 ,通过观察内生真菌醋酸乙酯提取物引起稻瘟霉分生孢子或菌
·0901· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
3 收稿日期 :2008211219　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :福建省自然科学基金资助项目 (2008J0097)
作者简介 :郭　蕾 (1984 —) ,女 ,硕士研究生 ,研究方向为内生真菌活性代谢产物。
Tel : (021) 81871311 　E2mail : guoleialice28 @163. com3 通讯作者　秦路平　Tel/ Fax : (021) 25070394 　E2mail : qinsmmu @126. com