全 文 ：文章编号(Article ID):1009 － 2137(2015)05 － 1336 － 05 ·论著·
土木香内酯对 ＲPMI － 8226 细胞的增殖抑制作用
及其相关机制研究
姚瑶，孙月月，夏丹丹，牛铭山，赵恺，李振宇，曾令宇，徐开林*
徐州医学院附属医院血液科，江苏徐州 221006
摘要 目的:探讨土木香内酯(alantolactone)对多发性骨髓瘤 ＲPMI-8226 细胞增殖、凋亡的影响，并分析其可能
的作用机制。方法:使用浓度为 1、2． 5、5、7． 5 及 10 μmol /L的土木香内酯处理 ＲPMI-8226 细胞 48 h，应用 CCK-8
检测细胞活力，并计算其半数抑制浓度(IC50)值;使用浓度为 2． 5，5 及 7． 5 μmol /L的土木香内酯处理 ＲPMI-8226
细胞 48 h后，应用 AnnexinV /PI双标记法分析细胞凋亡;Western blot方法检测呈切割的 caspase-3 及 EＲK信号通路
的变化;裸鼠荷瘤并给予土木香内酯以进一步验证其对多发性骨髓瘤细胞的促凋亡作用。结果:土木香内酯可抑
制 ＲPMI-8226 细胞活力，并呈现剂量依赖效应(r = － 0． 9784，P = 0． 0007) ;ＲPMI-8226 细胞 48 h 的 IC50为 4． 32 ±
0. 15 μmol /L;流式细胞术分析凋亡结果显示，随着土木香内酯浓度的增高，细胞早期凋亡率显著增加(r = 0． 9601，P
＜ 0． 05) ;Western blot结果显示，土木香内酯处理 ＲPMI-8226 细胞后，活化了 caspase-3，降低 EＲK磷酸化水平;体内
结果显示，给药组小鼠瘤体积明显小于对照组(P ＜ 0． 05) ;免疫组织化学检测结果显示，与对照组相比，实验组瘤内
细胞核增殖相关抗原 Ki67 及 p-EＲK的水平降低。结论:土木香内酯可有效地抑制多发性骨髓瘤 ＲPMI-8226 细胞
增殖并促进其凋亡，其机制可能是通过抑制 EＲK信号通路的活性，抑制裸鼠皮下多发性骨髓瘤的生长。
关键词 土木香内酯;多发性骨髓瘤;ＲPMI-8226 细胞;EＲK通路;细胞凋亡
中图分类号 Ｒ733． 3 文献标识码 A doi:10． 7534 / j． issn． 1009-2137． 2015． 05． 021
Effect of Alantolactone on Proliferation of ＲPMI-8226 Cells and Its
Possible Mechnism
YAO Yao，SUN Yue-Yue，XIA Dan-Dan，NIU Ming-Shan，ZHAO Kai，LI Zhen-Yu，ZENG Ling-Yu，
XU Kai-Lin*
Department of Hematology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221006，Jiangsu Province，China
* Corresponding Author:XU Kai-Lin，Professor，Senior Physician． E-mail:kailinxu_xzmc@126． com
Abstract Objective:To investigate the effect of alantolactone on perliferation and apoptosis of multiple myeloma
(MM)ＲPMI-8226 cells，and to explore its possible mechism in vitro and in vivo． Methods:The ＲPMI-8226 cells were
treated with alantolactone (1，2． 5，5，7． 5 and 10 μmol /L)for 48 h，cell viability was detected by CCK-8 assay and
the value of IC50 was calculated;The ＲPMI-8226 cells were treated with alantolactone (2． 5，5 and 7． 5 μmol /L)for 48
h，the apoptotic rate was detected by flow cytmetry with Annexin V /PI staining;the expression level of cleaved caspase-
3 and phosphorylation of EＲK were measured by Western blot;the nude mice was used to further confirm the
proapoptotic effect of alantolactone on MM cells in vivo． Ｒesults:The alantolactone inhibited ＲPMI-8226 cell viability
remarkably with a dose-dependent manner;the IC50 value of ＲPMI-8226 cells at 48 h was 4． 32 ± 0． 15 μmol /L;the
apoptotic rate increased observably with a dose-dependent manner;the levels of cleaved-caspase-3 increased and the
phosphorylation of EＲK decreased significantly;as compared to control，the volum of tumor was much smaller，the
expression levels of Ki67 and p-EＲK decreased． Conclusion:The alantolactone can efficiently inhibit the proliferation
and induce the apoptosis of multiple myeloma ＲPMI-8226 cells in vitro and in vivo through inhibiting the activation of
EＲK signal pathway．
Key words alantolactone;multiple myeloma;ＲPMI-8226 cell;signal pathway EＲK;apoptosis
J Exp Hematol 2015;23(5) :1336 － 1340
多发性骨髓瘤(MM)至今仍是不可治愈的血
液系统疾病，寻找新型抗骨髓瘤药物仍是一项艰巨
的任务。土木香内酯(alantolactone)是提取于土木
香根茎的活性物质［1］，具有抗炎、抗真菌、驱虫及抗
基金项目:国家自然科学青年基金(81302034)
* 通讯作者:徐开林，教授，主任医师． E-mail:kailinxu_xzmc@ 126．
com
2015 － 04 － 29 收稿;2015 － 06 － 10 接受
·6331· 中国实验血液学杂志 Journal of Experimental Hematology 2015;23(5) :1336 － 1340
肿瘤等作用［2 － 7］。为探讨土木香内酯对多发性骨髓
瘤细胞的作用，本研究以 ＲPMI-8226 为实验对象，
拟从体外及体内两方面观察其对骨髓瘤的抑制作用
并初步探讨其作用机制。
材料和方法
细胞及主要试剂
ＲPMI-8226 多发性骨髓瘤细胞购自 ATCC 细胞库。
土木香内酯购自上海晶纯生化科技股份有限公司。
ＲPMI 1640 培养液和胎牛血清均为美国 Gibco 公司
产品。AnnexinV /PI 凋亡试剂盒购自 ebioscience 美
国公司。EＲK、p-EＲK、Ki67、GAPDH、及 cleaved
caspase-3 抗体均为美国 Cell Signaling Technology 公
司产品。BALB /c裸鼠购自北京维通利华实验动物
技 术 有 限 公 司，裸 鼠 质 量 合 格 证 号 为
11400700061120。裸鼠饲养于徐州医学院动物中心
SPF级屏障内，饲养设施合格证号为 SCXK(苏)
2012-0007。
细胞培养
ＲPMI-8226 细胞在含 10%胎牛血清的 ＲPMI 1640 培
养液中，于 37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，
选用对数生长期细胞进行实验。
土木香内酯对骨髓瘤细胞活力的抑制及半数抑制率
(IC50)的 CCK8 法检测
取对数生长期的细胞，接种于 96 孔板中，每孔 2 ×
104 个细胞。土木香内酯设置 5 个不同浓度(分别
为 1、2． 5、5、7． 5 及 10 μmol /L) ，每个药物梯度设 3
个复孔。对照组加入相应体积的二甲亚砜 DMSO，
孵育 46 h后，加入 CCK8 每孔 10 μl，继续孵育 2 h。
然后在酶标仪波长 450 nm处测定吸光度，并计算出
其 IC50。
EＲK、p-EＲK及 cleaved caspase-3 等相关蛋白表达
的Western blot法检测
取土木香内酯 5 μmol /L 处理不同时间后的 ＲPMI-
8226 细胞，依照细胞量加入适量裂解液，震荡冰浴
10 min，离心后取上清测蛋白浓度待蛋白电泳检测。
配制 12% SDS-PAGE凝胶，上样电泳后将对应蛋白
半干转至 NC 膜，明胶封闭液封闭 2 h，一抗 4 ℃过
夜，二抗室温存 30 min，洗涤后于 ImageQuant LAS
4000 mini凝胶成像系统检测。
细胞凋亡的 AnnexinV /PI双染流式细胞术检测
分别取对数期细胞接种至 24 孔板中，每孔 2 × 105
个细胞，加入不同浓度的土木香内酯(2． 5、5 及 7． 5
μmol /L) ，处理 48 h后，收集细胞。应用预冷的 PBS
洗涤细胞 2 次，再用 1 × bingding buffer 缓冲液配制
成 1 × 106 /ml的细胞悬液。各取 100 μl加入 Falcon
试管中，先加入 AnnexinV染料 5 μl，避光 10 min，用
PBS 洗 1 次，再加入 PI染料 5 μl避光 15 min，1 h内
上流式细胞仪测定结果。
裸鼠荷瘤实验
12 只 BALB /c 裸鼠，分为实验组和对照组，每组 6
只，于裸鼠背部皮下接种 ＲPMI-8226 细胞(3 × 106
个细胞 /只)。接种后的动物放入 SPF 级动物室进
行饲养，建立裸鼠皮下瘤模型。待荷瘤生长可见，腹
腔注射给药，实验组 30 mg /kg 的土木香内酯，对照
组给药物溶剂。每 5 d测量荷瘤大小，给药 20 d后，
处死小鼠，取瘤制作石蜡切片，免疫组织化学检测
Ki67 及 p-EＲK水平。
统计学分析
采用 SPSS 13． 0 软件进行统计学分析，所有实验均
重复 3 次，结果以 珋x ± SD 表示。* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜
0． 01，＊＊＊P ＜ 0． 001 显示有统计学意义。
结 果
土木香内酯对 ＲPMI-8226 细胞的增殖抑制作用
不同浓度土木香内酯处理 ＲPMI-8226 细胞 48h 后，
CCK-8 检测细胞活力显示，其对细胞增殖抑制作用
呈现出剂量依赖性(r = － 0． 9784，P = 0． 0007) (图
1)。通过 SPSS软件计算，土木香内酯对 ＲPMI-8226
细胞 48 h的 IC50为 4． 32 ± 0． 15 μmol /L。
Figure 1． Inhibitory effect of alantolactone on cell viability
of multiple myeloma cell line ＲPMI-8226． ＲPMI-8226 cells
were treated with alantolactone (1，2． 5，5，7． 5 or 10 μmol /
L)for 48 h or with DMSO as control． ＊＊P ＜ 0． 01，＊＊＊P ＜
0． 001，compared with DMSO group．
·7331·土木香内酯对 ＲPMI-8226 细胞的增殖抑制作用及其相关机制研究
土木香内酯对 ＲPMI-8226 细胞凋亡的影响
使用不同浓度土木香内酯(0、2． 5、5 和 7． 5 μmol /L)
处理 ＲPMI-8226 细胞 48 h，用 AnnexinV /PI 双染检
测土木香内酯对骨髓瘤细胞的凋亡作用。结果显
示，随着土木香内酯浓度的增加，骨髓瘤细胞早期凋
亡率随之升高(r = 0． 9601，P ＜ 0． 05) (表 1，图 2)。
Western blot 检测 cleaved-caspase-3 显示，土木香内
酯处理 ＲPMI-8226 后，活化了 caspase 3，诱发细胞凋
亡(表 2，图 3)。
Table 1． Apoptotic rate of ＲPMI-8266 cells treated with
alantolactone
Concentration of alantolactone
(μmol /L)
Apoptotic rate of ＲPMI-8266
(%)
0 4． 89 ± 1． 05
2． 5 10． 39 ± 1． 11
5． 0 53． 20 ± 4． 15
7． 5 89． 66 ± 7． 32
Figure 2． Apoptosis-inducing effect of alantolactone on
ＲPMI-8226 cells． ＲPMI-8226 cells were treated with alanto-
lactone (2． 5，5 or 7． 5 μmol /L )for 48 h or with DMSO as
control． The apoptotic rate was detected by flow cytometry
with AnnexinV /PI staining． A，B，C，D:Alantolactone 0，2．
5，5，7． 5 μmol /L．
土木香内酯对多发性骨髓瘤 ＲPMI-8226 细胞 EＲK
信号通路活化的抑制作用
用 5 μmol /L的土木香内酯处理 ＲPMI-8226 细胞 3、
6、12 和 24 h，然后用 Western blot方法检测 p-EＲK
Figure 3． Activation effect of alantolactone on caspase-3 of
ＲPMI-8226 cells． ＲPMI-8226 cells were treated with Alanto-
lactone 5 μmol /L for 3，6 or 12 h，with DMSO as control．
The expression level of cleaved caspase-3 was detected by
Western blot．
Table 2． Value of gray scale scanning on figure 3
DMSO
Time (h)
3 6 12
GAPDH 16069 ± 80 14743 ± 100 14743 ± 51 16212 ± 52
Caspase 3 304 ± 28 270 ± 26 730 ± 20 687 ± 30
的变化。结果显示，土木香内酯处理 ＲPMI-8226 细
胞后降低了 EＲK磷酸化的水平(图 4)。
Figure 4． Inhibitory effect of alantolactone on phosphoryla-
tion of EＲK． ＲPMI-8226 cells were treated with 5 μmol /L of
alantolactone for 3，6，12 or 24 h，then the expression levels
of p-EＲK or EＲK were measured by Western blot．
土木香内酯对荷瘤鼠肿瘤体积的影响
用体内实验进一步验证土木香内酯对 ＲPMI-8226
细胞的抗增殖促凋亡作用。土木香内酯 30 mg /kg
腹腔注射实验组及注射 DMSO 的对照组小鼠，每隔
5 d测量荷瘤大小。结果显示，实验组小鼠的荷瘤
增长速度及大小明显小于对照组(P ＜ 0． 05) (图
5)。
土木香内酯对裸鼠肿瘤细胞核增殖相关抗原 Ki67
表达量的影响
处死小鼠后，量瘤质量，并作制作石蜡切片，免疫组
·8331· 中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2015;23(5)
Figure 5． Inhibitory effect of alantolactone on subcutaneous
growth of myeloma cells． ＲPMI-8226 cells were injected
subcutaneously into nude mice with a density of 3 × 106 cells /
site． When tumors were palpable，mice (n = 6 /group)were
given alantolactone (30 mg /kg body weight)by intraperitoneal
injection in PBS containing 10% Tween 80 and 10% DMSO
daily for continuous 20 days． Tumor volumes were monitored
every 5 days． * P ＜ 0． 05，compared with control group．
织化学检测 Ki67 及 p-EＲK 的变化。实验组荷瘤的
质量明显小于对照组荷瘤(图 6)。免疫组织化学检
测结果显示，对照组中细胞核增殖相关抗原 Ki67 表
达量降低，同时 p-EＲK 的表达水平也明显降低(图
7)。
Figure 6． Inhibitory effect of alantolactone on subcutaneous
growth of myeloma cells． The weigh of tumors were meas-
ured． * P ＜ 0． 05，compared with control group．
Figure 7． Effect of alantolactone on expression levels of
Ki67 and p-EＲK． The tumors were excised from alantolactone
treatment or control mice，then the expression levels of Ki67
and p-EＲK were measured by immunohistochemical assay (o-
riginal magnification × 40)． Scare bars represent 20 μm．
讨 论
多发性骨髓瘤现有的治疗策略包括传统化疗，新型
抑制剂(蛋白酶体抑制剂硼替佐米，免疫调节剂来
那度胺等) ，以及自体干细胞移植。新型抑制剂的
应用，虽然提高了骨髓瘤患者的生存率，但是大部分
的患者仍然不可治愈［8 － 9］。因此寻找新型的抗多发
性骨髓瘤的药物迫在眉睫。
已有研究发现，土木香内酯具有多种抗肿瘤的
效果。本研究选择多发性骨髓瘤 ＲPMI-8226 细胞
作为研究对象，通过体外和体内两方面研究土木香
内酯对多发性骨髓瘤的抗肿瘤作用。首先应用
CCK-8 检测土木香内酯对 ＲPMI-8226 细胞的杀伤作
用，发现其可以显著的抑制骨髓瘤的细胞活性，48 h
IC50为 4． 32 ± 0． 15 μmol /L。此前，Mi 等
［10］报道人
正常干细胞株 L02 对土木香内酯较不敏感，其 IC50
约为 31． 34 μg /ml(133． 75 μmol /L)。由此可见，土
木香内酯对正常细胞杀伤力较低，而在较低的浓度
下对骨髓瘤细胞杀伤效果明显。进一步的流式细胞
术检测土木香内酯处理骨髓瘤细胞后发现，土木香
内酯通过诱导细胞凋亡发挥抗骨髓瘤的作用。
多发性骨髓瘤的发病机制复杂，大量的恶性浆
细胞瘤与骨髓微环境相互作用，骨髓基质细胞分泌
IL-6、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因
·9331·土木香内酯对 ＲPMI-8226 细胞的增殖抑制作用及其相关机制研究
子(IGF)及纤维母细胞生长因子(FGF)等生长因
子，异常激活 JAK /STAT3、Ｒas /MAPK 及 NF-κB 等
信号通路的异常活化，导致骨髓瘤细胞的过度增
殖［11 － 14］。本研究发现，土木香内酯通过抑制骨髓瘤
ＲPMI-8226 细胞内 EＲK磷酸化的水平，发挥抑制增
殖促进凋亡的作用。
为了进一步证实土木香内酯的抗多发性骨髓瘤
的效果，本研究建立裸鼠皮下荷瘤的模型检测土木
香内酯的体内活性。荷瘤体积，免疫组织化学检测
及 Western blot的结果均显示土木香内酯可以抑制
裸鼠皮下多发性骨髓瘤的生长。Ki67 免疫组织化
学检测结果显示，土木香内酯抑制骨髓瘤细胞皮下
荷瘤的增殖能力，p-EＲK 免疫组织化学检测结果进
一步证实土木香内酯通过抑制 EＲK 通路的活性发
挥抗骨髓瘤的活性。
尽管本研究已经证实土木香内酯可明显抑制多
发性骨髓瘤细胞 ＲPMI-8226 细胞增殖并促进凋亡，
但仍需探讨其抑制增殖的过程中牵涉到何种靶基
因，如细胞周期蛋白，抑癌基因 p53，p21 等;促进凋
亡的过程又是通过何种凋亡途径引起，以及 EＲK通
路下游靶蛋白是否受到影响均尚需进一步研究。
综上所述，本研究分别从体外及体内两个层面
证实了土木香内酯对多发性骨髓瘤 ＲPMI-8226 细
胞具有明显的抑制增殖和促凋亡的作用，并初步阐
明其通过抑制 EＲK 信号通路的活性来发挥作用。
本研究为土木香内酯今后在临床的应用提供了一定
的理论基础。
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