全 文 ：根据试验结果 ,确定苯乙酮为本实验的内标物。
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红车轴草提取物中多环芳烃脱除工艺的研究
许　龙1 , 2 ,陈应庄1 ,曾建国1 , 2＊ ,罗　琪1
(1.湖南省中药提取工程研究中心 ,湖南 长沙　410331;2.湖南中医药大学 ,湖南 长沙　410007)
摘　要:目的　优选红车轴草提取物中多环芳烃(PAH s)脱除工艺。方法　以 PAH s 脱除率为指标 ,考察提取物粒
度 、脱除溶剂 、脱除方法对 PAH s脱除工艺的影响 。结果　最佳工艺为:红车轴草提取物超微粉碎至 300 目以上 ,
用六号溶剂超声提取 , 对 PAH s 的脱除率达到 98.0%以上 , PAHs 的残留量为 10.0 ng/g 以下。结论　超微粉碎-
六号溶剂-超声提取法脱除红车轴草提取物中 PAH s 脱除率高 ,工艺稳定 、可行。
关键词:红车轴草;多环芳烃;超微粉碎;超声提取
中图分类号:R284.2;R286.02　　　文献标识码:A　　　文章编号:0253-2670(2009)08-1235-04
Technique of removing polycyclic aromatic hydrocarbons from Tri f olium pratense extract
XU Long
1 , 2 , CHEN Ying-zhuang 1 , ZENG Jian-guo1 , 2 , LUO Qi1
(1.Hunan Eng ineering Research Center o f Chinese Materia Medica Ex trac t , Chang sha 410331 , China;
2. Hunan Univer sity o f T r aditional Chinese Medicine , Changsha 410007 , China)
Abstract:Objective　To optim ize the removal technique for ex t racting poly cyclic aromatic hydro car-
bons(PAHs)f rom Tri f ol ium pratense.Methods　The inf luence o f various factors , including the size ,
solvent , ex traction methods , and their ef fects on the removal efficiency , were investig ated.Results　The
best process fo r ex traction:the g round ex t ract of PA Hs w as over 300 meshes by ul tra-fine g rinding fi rst ly
and then the removal rate of PAHs w as above 98.0% and the to tal removal of PA Hs w as below 10.0 ng/
g by ul trasonic ex traction w ith solvent No.6.Conclusion　The removal rate o f PA Hs in T.pretense ex-
t ract by ult ra-fine grinding-ult rasonic e xt ract ion wi th solvent No.6 is much higher.The tit le pro cess is
stable and available.
Key words:Tri f olium pratense L.;polycyclic aromat ic hydrocarbons;ul t ramicro-pulverization;ul tra-
sonic ex traction
　　红车轴草 Tri folium pratense L.为豆科多年
生草本植物 ,主要含有鹰嘴豆芽素 A 、刺芒柄花素等
多种异黄酮类成分 ,刘晗等[ 1] 研究发现红车轴草在
鲜活状态下的异黄酮的量最高 ,并确定最佳采收期
为花蕾期至初花期 。红车轴草中异黄酮成分具有抗
肿瘤 、治疗骨质疏松和更年期综合症等作用[ 2 , 3] ,因
此被广泛用于保健食品中。近年来发现红车轴草提
取物中有微量多环芳烃(PAHs)存在 ,其来源可能
与红车轴草植物生长过程中的富集作用或在生产过
程中受到污染有关[ 4] 。PAHs具有强致癌性[ 5 , 6] ,严
重影响红车轴草提取物的质量 ,因此开展 PAHs脱
除工艺研究非常重要 。本实验考察了提取物粒度 、
提取溶剂和提取方法对 PAHs脱除的影响 ,并对其
中最优的超声提取法进行了研究 ,为 PAHs脱除工
·1235·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 8 期 2009年 8月
＊ 收稿日期:2009-03-09　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　基金项目:湖南省科技厅重大专项(2007FJ1005);湖南省科技计划重点项目(2008SK2009)作者简介:许　龙(1982—),男 ,湖南耒阳人 ,在读硕士 ,主要从事天然产物开发利用研究。
Tel:13808475843　E-mail:longxu23@yahoo.com.cn＊通讯作者　曾建国　Tel:(0731)84686478　E-mail:gink go@w orld-w ay.net
业化运用寻求最佳的工艺路线。
1　仪器与试剂
　　Waters 2695 高效液相色谱仪 , Waters Em-
powe r工作站 ,Waters 2475荧光检测器。
　　AB135—S分析天平(上海梅特勒-托利多仪器
有限公司);JAC —300 型超声波提取装置(济宁市
奥波超声电气有限公司);恒温水浴锅(常州国华电
器公司);JB/ T5520 —91电热恒温鼓风干燥箱(上海
跃进医疗机械厂);RE —52A 旋转蒸发仪(北京瑞邦
兴业科技有限公司);循环水多用真空泵(郑州杜甫
仪器厂);GS12—2电子恒速搅拌器(上海医械专机
厂);BFM —6A 试验型贝利微粉机(济南倍力粉技
术工程有限公司)。
　　PAHs 标样为 Supelco 公司生产 EPA610
PAHs混合标样 ,其中萘 、二氢苊各为 1 000 mg/L ,
苊 2 000 mg/ L ,芴 、荧蒽 、苯并(b)荧蒽 、二苯并(a ,
h)蒽 、苯并(g , h , i)苝各为 200 mg/ L ,菲 、蒽 、芘 、苯
并(a)蒽 、 、苯并(k)荧蒽 、苯并(a)芘 、茚并(1 , 2 ,
3-cd)芘各为 100 mg/L 。二氯甲烷 、丙酮 、环己烷 、
正庚烷 、乙腈等均为色谱纯;氢氧化钠 、六号溶剂(沸
程为62 ～ 85 ℃的石油馏分六碳烷烃混合物)为分析
纯 ,其余试剂为分析纯 。红车轴草提取物由湖南省
中药提取工程研究中心提供 , 含总异黄酮 20%、
40%、60%。
2　方法与结果
2.1　PAHs的分析方法建立
2.1.1　样品前处理:精确称取红车轴草提取物
10.0 g ,置具塞锥形瓶中 ,加入 15 倍 0.5%NaOH
溶液充分溶解 ,再加入等体积的环己烷萃取 ,静置分
层 ,下层溶液再加入等量环己烷萃取 ,重复操作 5
次 ,合并环己烷于旋转蒸发仪上回收溶剂至近干 ,用
乙腈洗脱并定容至 1 mL 量瓶中 ,摇匀 ,过膜 ,得滤
液 ,即为供试品溶液。
2.1.2　色谱条件:色谱柱为Hypersil ODS2(250 mm×
4.6 mm ,5μm)(大连依利特分析仪器有限公司);柱温
30 ℃;进样体积 5μL;体积流量:0.50 mL/min;流动相
为乙腈-水 ,梯度洗脱 ,0 ～ 30 min , 70%乙腈 , 30 ～ 50
min ,80%乙腈 , 50 ～ 65 min , 90%乙腈 , 95 min 以
后 ,95%乙腈;FLD检测器 ,激发波长和发射波长随
时间程序的变化见表 1。
2.1.3　标准曲线的绘制:分别精密量取各多环芳烃
对照品溶液 ,用甲醇稀释至质量浓度为 1000 、100 、
10 、1 ng/mL ,摇匀。经 0.45 μm 微孔滤膜滤过 ,取
续滤液进样 5 μL 。在上述色谱条件下进行分析 ,记
录色谱图 。以峰面积为纵坐标 ,质量浓度为横坐标 ,
绘制标准曲线 ,拟合回归方程 ,见表 2。结果表明多
环芳烃在 1 ～ 1 000 ng/mL 线性良好 。
表 1　FLD检测波长的时间程序
Table 1　Time program of FLD detection wavelength
时间/min 激发波长/ nm 发射波长/ nm
0.00 225 315
19.0 250 360
21.0 260 420
24.0 435 358
27.0 270 380
32.0 286 400
1-萘　2-芴+苊　3-菲　4-蒽　5-荧蒽　6-芘　7-苯并(a)蒽+ 　8-
苯并(b)荧蒽　9-苯并(k)荧蒽　10-苯并(a)芘　11-二苯并(a 、h)蒽
　12-苯并(g 、h 、i)苝+茚并(1 、2 、3-cd)芘
图 1　多环芳烃对照品(A)和红车轴草提取物(B)的色谱图
Fig.1　Chromatograms of PAHs reference substances(A)
and T.pratense extract(B)
表 2　多环芳烃的标准曲线方程
Table 2　Standard curve equations of PAHs
化合物 回归方程 相关系数 r
萘 Y =48 269 X+2×106 0.999 9
苊+芴 Y =938 728 X+204 166 0.999 5
菲 Y =350 840 X-2×106 0.999 8
蒽 Y =222 169 X-1×106 0.999 8
荧蒽 Y =132 714 X-1×106 0.999 7
芘 Y =877 135 X-4×106 0.999 8
苯并(a)蒽+ Y =566 125 X-6×106 0.999 7
苯并(b)荧蒽 Y =112 633 X-1×106 0.999 8
苯并(k)荧蒽 Y =685 436 X-4×106 0.999 8
苯并(a)芘 Y =1×106 X-7×106 0.999 7
二苯并(a , h)蒽 Y =2×106 X-1×107 0.999 7
苯并(g , h , i)苝+茚并 Y =246 578 X-4×106 0.999 7
　(1 , 2 , 3-cd)芘
2.1.4　空白试验:该研究由于是痕量分析 ,为避免
试剂对实验造成影响 , 所有试剂做空白试验 。取
100 mL 各种溶剂 ,分别旋蒸浓缩到 1 mL ,进行检测
分析 。
2.1.5　样品测定:取提取物样品 ,按 2.1.1 项下操
作 ,在上述色谱条件下进行 HPLC 分析 ,按外标一
点法计算 12种 PAHs的量 ,并计算 12种 PAHs脱
除率[脱除率=(原样品中 PAHs的质量分数 -脱
除后产品中 PAHs 的质量分数)/原样品中 PAHs
的质量分数×100%] 。
·1236· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 8 期 2009年 8月
2.2　红车轴草提取物中总异黄酮的测定:依照《中
华人民共和国外经贸行业标准(红车轴草提取物)
WM/ T6-2004》检测方法 ,总异黄酮以刺芒柄花苷 、
印度黄檀苷 、刺芒柄花素 、鹰嘴豆芽素 A 的量之和
计算。
2.3　不同粒径对脱除效果的影响:称取同一批次红
车轴草提取物 5份 ,每份 100 g ,分别粉碎制成 80 、
120 、200目和超微粉碎制成 300 、400目不同粒径的
样品。分别取不同粒径样品各 30 g 置于圆底烧瓶
内 ,加入 8倍量六号溶剂 ,搅拌回流提取 1.0 h ,放冷
滤过 ,沉淀进入下次提取 ,重复操作 3次 ,沉淀真空
干燥后得供试样。不同粒度对提取物 PAHs 脱出
率影响的实验结果见表 3 。
表 3　提取物粒度对脱除率的影响
Table 3　Ef fect of extract diameter on removal rate
目数 粒度/μm PAH s/(ng· g
-1)
脱除前 脱除后 脱除率/ %
80　 178　 465.0 51.8 88.8
120　 124　 465.0 40.3 91.3
200　 74　 465.0 27.0 94.1
300　 48　 465.0 16.2 96.5
400　 38　 465.0 15.3 96.7
　　由于红车轴草提取物中指标成分异黄酮类的质
量分数越高 ,越难溶于水 、乙醇 、醋酸乙酯等溶剂 ,而
PAHs吸附于提取物颗粒的表面及浅表面 ,因此选
择将供试样充分粉碎 ,以扩大其表面积 ,有利于溶剂
从表层 、浅表层脱去 PAHs 。表 3结果显示 ,将提取
物粉碎得越细 ,PAHs的脱除效果越好 ,但提取物粒
度并不与 PAHs脱除率成正比关系 ,这与吸附于浅
表面的 PAHs 不能被完全脱除有关[ 7] 。从工业化
生产角度出发 ,以选用 300目左右为宜。
2.4　不同溶剂对 PAHs 脱除效果的影响:脱除溶
剂的选择必须具备对 PAHs的溶解性好 ,而对红车
轴草提取物中指标成分溶解性差的条件 ,同时确保
脱除过程不产生有害溶剂残留 ,因此选择环己烷 、六
号溶剂 、正己烷和正庚烷作为脱除溶剂 。称取未经
刻意粉碎但均通过 80目筛的红车轴草提取物 30 g
置于圆底烧瓶内 ,加入 8倍量溶剂 ,搅拌回流提取
1.0 h ,放冷滤过 , 沉淀进入下次提取 ,重复操作 3
次 ,沉淀真空干燥后得供试样。考察环己烷 、六号溶
剂 、正己烷 、正庚烷对脱除率的影响 ,结果见表 4。
可以看出 ,4种溶剂对 PAHs均有较好的脱除能力 。
2.5　不同脱除 PAHs 工艺方法的比较:将回流提
取 、超声波提取 、萃取 、活性碳吸附脱除工艺的脱除
效果进行比较 ,确定不同脱除方法对 PAHs脱除的
优劣 ,结果见表 5 。可以看出 ,回流提取脱除率最
低 ,而超声提取 、溶剂萃取和活性炭吸附脱除率高 ,
脱除供试样中 PAHs的量均低于 10.0 ng/g 。
2.6　脱除工艺对红车轴草提取物中总异黄酮的影
响:取经超微粉碎的 300目红车轴草提取物 ,分别采
用回流 、超声 、萃取 、活性碳吸附 4种工艺中最佳条
件脱除 PAHs ,将原样品及经工艺处理得到的供试
品进行指标成分的测定 ,结果见表 6。
表 4　不同溶剂对脱除率的影响
Table 4　Ef fect of dif ferent solvents on removal rate
提取剂 PAH s/(ng· g
-1)
脱除前 脱除后 脱除率/ %
环己烷　 465.0 58.4 87.4
六号溶剂 465.0 51.8 88.8
正己烷　 465.0 62.5 86.5
正庚烷　 465.0 55.2 88.1
表 5　4 种脱除 PAHs方法的比较
Table 5　Comparison of four methods to remove PAHs
脱除方法 PAH s/(ng· g
-1)
脱除前 脱除后 脱除率/ %
回流提取　 465.0 13.4 97.1
超声提取　 465.0 9.1 98.0
萃取　　　 465.0 4.9 99.0
活性炭吸附 465.0 7.5 98.3
表 6　脱除 PAHs前后总异黄酮的比较
Table 6　Comparison of total flavonols contents
before and after removing PAHs
脱除方法 总异黄酮/ %脱除前 脱除后 收率/ %
回流提取　 41.3 40.8 97.8
超声提取　 41.3 40.1 97.2
萃取　　　 41.3 34.5 96.6
活性炭吸附 41.3 32.7 95.4
　　可以看出 , 经萃取法和活性炭吸附法脱除
PAHs得到的样品 ,其指标成分的量下降很大 ,原因
可能为指标成分长时间处在碱性条件下不稳定造
成;经回流提取法和超声提取法除 PAHs得到的样
品 ,其总异黄酮的量和收率均很高 ,表明脱除过程对
指标成分影响很小 ,但由于回流提取对 PAHs脱除
率较超声低 ,因此选择超声提取法来脱除 PAHs 。
2.7　超声提取工艺对 PAH s脱除效果的研究:考
察不同频率 、溶剂用量 、提取次数和提取时间的影
响 ,确定最佳超声提取工艺。
2.7.1　不同超声频率的考察:称取红车轴草提取物
30 g 置于锥形瓶内 ,加入 8倍量六号溶剂 ,在一定频
率下超声波提取 1.0 h ,放冷滤过 ,沉淀进入下次提
取 ,重复操作 3次 ,考察不同频率对脱除率的影响 ,见
·1237·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 8 期 2009年 8月
图 2。结果表明 ,当超声频率为 60 kHz时脱除率达
98%以上 ,继续增加超声频率其脱除率变化不明显。
超声提取频率/ kH z
图 2　超声频率对脱除率的影响
Fig.2　Effect of ultrasonic frequency on removal rate
2.7.2　不同提取溶剂用量的考察:称取红车轴草提
取物 30 g 置于锥形瓶内 ,加入一定量六号溶剂 ,在频
率为 60 kHz条件下 ,超声提取 1.0 h ,放冷滤过 ,沉淀
进入下次提取 ,重复操作 3次 ,考察溶剂不同的用量
对脱除率的影响 ,结果见表 7。结果表明 ,当每次用 8
倍量六号溶剂提取时 ,脱除率高而溶剂用量适度。
表 7　不同溶剂用量对脱除率的影响
Table 7　Effect of different solvent amounts on removal rate
提取剂用量
(倍量×次数)
PAH s/(ng· g -1)
脱除前 　脱除后 脱除率/ %
5×3 465.0 17.1 96.3
6×3 465.0 12.2 97.3
8×3 465.0 9.1 98.0
10×3 465.0 7.2 98.4
15×3 465.0 6.3 98.6
2.7.3　不同超声提取次数的考察:称取红车轴草提
取物 30 g 置于锥形瓶内 ,加入 8倍量六号溶剂 ,在
频率为 60 kHz下 ,超声提取 1.0 h ,放冷滤过 ,沉淀
进入下次提取 ,重复操作不同次数 ,考察不同次数对
脱除率的影响 ,结果见表 8。结果表明 ,随着提取次
数增加到 3次 ,样品中 PAHs的量基本稳定 ,此后
提取次数的增加变化不显著 。
表 8　不同提取次数对脱除率的影响
Table 8　Effect of different times of extracting
on removal rate
提取次数 PAH s/(ng· g
-1)
脱除前 　脱除后 脱除率/ %
1 465.0 35.0 92.4
2 465.0 14.6 96.8
3 465.0 9.1 98.0
4 465.0 7.0 98.5
2.7.4　最佳工艺参数:超声提取工艺的最佳条件为
用 8倍量六号溶剂 ,在超声频率为 60 kHz条件下 ,
重复操作 3次 。
2.8　重叠图谱比较:通过对红车轴草提取物在脱除
PAHs前后样品的 HPLC 图谱比较 ,判断脱除工艺
是否对样品的成分产生影响。取经超微粉碎的300
目红车轴草提取物 ,采用提取工艺中最佳条件脱除
PAHs ,将原料和超声工艺制得产品的供试品进行
HPLC图谱比较 ,脱除 PAHs前后样品图谱见图 3。
结果表明有效成分重叠图谱中图谱峰能很好的吻
合 ,说明 PAHs脱除过程对提取物化学成分未造成
明显的破坏或损失 ,脱除工艺稳定 、可控 。
t/min
1-鹰嘴豆芽素 B　2-鹰嘴豆芽素 A
1-abioch anin B　2-abiochanin A
图 3　超声工艺脱除前后样品色谱图
Fig.3　Chromatograms of samples before and after
removing PAHs by ultrasonic technique
3　结论
　　超微粉碎-六号溶剂-超声波提取法适合红车轴
草提取物中 PAHs的脱除 ,工艺稳定 、可控 ,适用于
工业生产 。因痕量分析实验对分析仪器要求高等原
因 ,脱除工艺未做正交试验确定最佳的提取条件 ,本
研究确定的最佳工艺条件为:将提取物超微粉碎至
300目以上 ,用 8 倍量六号溶剂 ,在超声波频率 60
kHz条件下 ,超声提取 3次 。该工艺对红车轴草提
取物中 PAHs可以达到很好的脱除效果(对 PAHs的
脱除率达 98.0%以上),其残留量(小于10.0 ng/g)符
合产品要求。
　　致谢:感谢大连化学物理研究所梁鑫淼研究员
课题组为本实验提供的仪器设备和给予大量的指导
帮助 。
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