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[成分分析 ]
HPLC测定红车轴草中大豆苷元 、染料木素 、芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A
的含量
马　强 1 , 　周玉新 2 , 　雷海民3 , 　王长海 1
(1.大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系 ,辽宁 大连 116024;2.北京美德森医药技术开发有限
公司 ,北京 100029;3.北京中医药大学中药学院 ,北京 100102)
关键词:红车轴草;大豆苷元;染料木素;芒柄花素;鹰嘴豆芽素 A;HPLC
摘要:目的:建立测定红车轴草中大豆苷元 、染料木素 、芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A含量的高效液相色谱方法。方法:K ro-
m asil C18色谱柱(250 mm ×4. 6 mm , 5 μm), 流动相:乙腈-0. 1 H3PO4(40∶60), 流速:1. 0 mL m in- 1 , 检测波长:254
nm , 柱温:25 ℃。结果:大豆苷元 、染料木素 、芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A的线性范围分别为 0. 0662 ～ 0. 6620 μg, 0. 0978 ～
0. 9780 μg, 0. 0866～ 0. 8660 μg和 0. 0992 ～ 0. 9920 μg。该方法回收率大豆苷元为 98. 9 (RSD =0. 46 ), 染料木素为
98. 8 (RSD =1. 21 ),芒柄花素为 98. 8 (RSD =0. 71 ), 鹰嘴豆芽素 A为 97. 5 (RSD =1. 33 )。结论:该法简便 、
快速 、准确。
中图分类号:R927. 2　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2005)10-1193-03
Determ ination of daidze in, genistein, form ononetin and biochan inA inTrifolium
pra tense L. by HPLC
MA Q iang
1 , 　ZHOU Yu-x in2 , 　LEIH ai-m in3 , 　WANG Chang-hai1
(1. Depa rtm en t ofB ioscience and B iotechnology, Schoo lofE nvironmen ta land B io log ica lS cience and Techno logy, D a lianUn iversity of Technology, Da lian
116024 , Ch ina;2. B eijing MedSun Pharm aceut ica lTechno logy D evelopm ent Co. , Ltd, B eijing 100029 , Ch ina;3. Co llege o f Ch inese Ma teriaM ed ica,
BeijingU niversi ty of Trad itiona lCh ineseM ed icine, B eijing 100102 , China)
KEYWORDS:Trifolium pra tense L. ;daidzein;gen iste in;formonone tin;b iochan in A;HPLC
收稿日期:2004-10-20
作者简介:马　强(1979～ ),男 ,硕士.主要从事仪器分析及天然产物活性成分的研究 , E-m ail:m aqiang1129@ yah oo. com. cn.
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第 27卷　第 10期
中 成 药
Chine se T raditiona l PatentM ed icine
Octobe r 2005
Vo.l 27　No. 10
ABSTRACT:AIM:To establish anHPLC m ethod for the determ ination of daidze in, geniste in, fo rmononetin and
biochan in A in Trifolium pra tense L. METHODS:A K romasilC18 co lumnw as used w ith themobile phase o f ace to-
nitrile - 0. 1 H3PO 4(40∶60), the flow rate w as 1. 0mL m in-1 the w ave leng th of detection w as se t at 254 nm
and the co lumn tempera ture w as at 25°C. RESULTS:The linear range o f daidze in, genistein, formonone tin and
biochan in A was 0. 0662 ～ 0. 6620 μg, 0. 0978 ～ 0. 9780 μg, 0. 0866 ～ 0. 8660 μg and 0. 0992 ～ 0. 9920 μg, re-
spective ly. The ave rage recovery w as 98. 9 (RSD =0. 46 ), 98. 8 (RSD =1. 21 ), 98. 8 (RSD =
0. 71 ) and 97. 5 (RSD =1. 33 ), respective ly. CONCLUSION:The me thod is simp le, rap id and accu-
ra te.
　　红车轴草 (Trifolium pratense L. )系豆科车轴草
属多年生草本植物 ,又名红三叶 、红菽草 、红荷兰翘
摇 、红花苜蓿 、金雀菜 、三叶草等 ,原产亚洲西部 ,现
广泛分布于世界各地 , 我国各地均有栽培或野生 。
红车轴草中主要含有鹰嘴豆芽素 A、芒柄花素等异
黄酮类成分 ,文献报道其具有抗肿瘤 ,治疗胃癌 、肠
癌 、乳腺癌等功效 ,此外还有治疗骨质疏松 ,改善妇
女更年期症状等用途 ,因而备受关注 [ 1] 。本文建立
了测定红车轴草中大豆苷元 、染料木素 、芒柄花素和
鹰嘴豆芽素 A含量的高效液相色谱方法。
1　仪器与试药
Ag ilent 1100高效液相色谱仪 (四元泵 、在线脱
气机 、自动进样器 、柱温箱 、二极管阵列检测器 ),大
豆苷元对照品由中国药品生物制品检定所提供 ,染
料木素对照品为自制 (纯度 >98 ),芒柄花素对照
品购自 A cros公司 ,鹰嘴豆芽素 A对照品购自 S igma
公司。红车轴草采自湖北恩施 ,由湖北中医学院药
学系詹亚华教授鉴定 。色谱纯乙腈购自 Fisher公
司 ,水为 M illi-Q。
2　色谱条件
色谱柱:K romasil C18色谱柱 (250 mm ×4. 6
mm , 5μm),流动相:乙腈-0. 1 H3 PO 4(40∶60),流
速:1. 0 mL m in- 1 ,检测波长:254 nm ,柱温:25 °C。
3　实验部分
3. 1　提取溶剂的选择
精密称取同一样品约 0. 5 g,分别精密移取水 、
30 乙醇 、50 乙醇 、70 乙醇 、90 乙醇 20mL,超
声提取 30 m in,进样 10 μL,比较峰面积 ,实验结果
表明 90 乙醇提取效果最好。
3. 2　超声提取时间的选择
精密称取同一样品约 0. 5 g, 分别精密移取
90 乙醇 20 mL,超声提取 20 , 30, 40 m in,进样 10
μL,比较峰面积 ,实验结果表明超声 30 m in为最佳
提取条件。
3. 3　流动相及流速的选择
试验中曾采用下述流动相进行测定:甲醇-水
(50∶50)乙腈-水 (50∶50)、乙腈-水(40∶60)、乙腈-0.
1 H3 PO4(40∶60)为流动相 ,结果采用乙腈-0. 1
H3PO 4(40∶60)为流动相时 ,样品分离良好 。而流速
以 1. 0 mL min- 1为合适 。
3. 4　对照品溶液的制备
精密称取 60°C干燥至恒重的大豆苷元 、染料木
素 、芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A适量 ,加甲醇制成每
毫升各含大豆苷元 0. 662 mg、染料木素 0. 978 mg、
芒柄花素 0. 866mg、鹰嘴豆芽素 A 0. 992mg的混合
溶液 ,作为对照品溶液。
3. 5　供试品溶液的制备
红车轴草经干燥 、粉碎 ,过 20目筛 ,精密称取粗
粉约 0. 5 g,置 50mL具塞瓶中 ,精密加入 20mL的
90 乙醇 ,称定重量 ,超声处理 30 m in,放至室温后 ,
称定重量 ,加 90 乙醇补足减失的重量 ,摇匀 ,滤
过 ,取续滤液作为供试品溶液 。
3. 6　线性关系考察
分别精密吸取上述混合对照品溶液 0. 1, 0. 3,
0. 5, 0. 7, 1. 0μL,注入液相色谱仪 ,测定各组分的峰
面积 ,以进样量 (μg)为横坐标 ,测得峰面积为纵坐
标 ,做线性回归 ,得各组分的回归方程 ,相关系数及
线性范围见表 1。
Tab le 1　 L inearing of standard com pounds
Com pound
Regress ion
equation
Correlation
coeff icient
Linear
range(μg)
Daidzein Y =8. 21×103X - 106. 13 r=0. 9996 0. 0662～ 0. 6620
G enis tein Y =1. 13×104X - 277. 09 r=0. 9995 0. 0978～ 0. 9780
Form ononetin Y =8. 35×103X - 139. 09 r=0. 9996 0. 0866～ 0. 8660
B iochan in A Y =1. 11×104X - 291. 76 r=0. 9995 0. 0992～ 0. 9920
3. 7　精密度试验
精密吸取对照品溶液 1 μL,连续进样 6次 ,测
得峰面积 ,大豆苷元 、染料木素 、芒柄花素和鹰嘴豆
芽素 A的 RSD 分别为 0. 87 , 0. 93 , 0. 74 ,
1. 04 。
3. 8　重复性试验
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取同一样品 ,精密称取 5份 ,每份约 0. 5 g,按供
试品的制备方法处理 , 进行 HPLC分析 , 测定峰面
积 ,结果大豆苷元 、染料木素 、芒柄花素和鹰嘴豆芽
素 A 的 RSD 分别为 0. 93 , 1. 01 , 1. 32 ,
1. 30 。
3. 9　稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液 10 μL,分别于第 0,
1, 2, 4, 6, 8 h进样 ,测得峰面积 ,大豆苷元 、染料木
素 、芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A 的 RSD 分别为
1. 17 , 1. 52 , 1. 36 , 1. 81 ,证明样品在 8 h内
进样稳定。
3. 10　回收率试验
精密称取已知含量的样品 ,分别加入一定量的
对照品 ,依照 “供试品溶液的制备 ”项下处理并测
定 ,计算回收率 ,结果见表 2。
Tab le 2　 Recovery of the m ethod
Compound
C on ten t
(m g)
Added
(m g)
Found
(mg)
Recovery
( )
Average
Recovery
( )
RSD
( )
1. 84 2. 01 3. 83 98. 9
Daidzein 1. 84 2. 27 4. 07 98. 4 98. 9 0. 46
1. 84 2. 35 4. 17 99. 3
0. 38 0. 42 0. 80 99. 6
G enis tein 0. 38 0. 51 0. 88 97. 4 98. 8 1. 21
0. 38 0. 57 0. 95 99. 3
5. 07 4. 83 9. 84 98. 7
Form ononetin 5. 07 5. 09 10. 06 98. 1 98. 8 0. 71
5. 07 5. 31 10. 35 99. 5
2. 20 2. 11 4. 28 98. 8
B iochan in A 2. 20 2. 35 4. 49 97. 6 97. 5 1. 33
2. 20 2. 39 4. 50 96. 2
3. 11　样品测定
精密吸取对照品溶液和供试品溶液 ,注入液相
色谱仪 ,测定 ,结果见表 3,色谱图见图 1。
4　讨论
4. 1　检测波长的选择　分别对大豆苷元 、染料木
素 、芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A对照品进行全波长扫
描 ,结果大豆苷元和芒柄花素的最大吸收波长为
Tab le 3　The conten ts of daidzein, gen iste in, form ononetin
and b iochan in A in sample (n=3)
Sam p le
Daid zein
(mg /g)
G en is tein
(m g /g)
Form ononetin
(m g /g)
B ioch anin A
(m g /g)
030514 11. 77 2. 40 32. 34 14. 06
030721 13. 54 3. 83 28. 61 15. 18
031105 10. 49 2. 72 30. 87 12. 95
031209 15. 73 4. 18 32. 41 16. 55
F ig. 1　The chrom atogram s of test sam p le and
re ference substance
A.供试品( tes t sam p le)　B.对照品(reference sub stance)
1.大豆苷元(Daidzein, 4. 9m in)　 2.染料木素(G en is tein, 8. 3 m in)　
3.芒柄花素(Form ononet in, 13. 3 m in)　 4. 鹰嘴豆芽素 A(B iochan in
A, 30. 3 m in)
248 nm ,染料木素和鹰嘴豆芽素 A的最大吸收波长
为 260 nm ,综合考虑 ,选择 254 nm作为检测波长 。
4. 2　本文在同一色谱条件下测定了红车轴草中大
豆苷元 、染料木素 、芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A的含
量 ,方法简便 、快速 、准确度高 、重复性好 ,可用于红
车轴草的含量测定和质量控制。
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