全 文 ：* 广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻 11107009 － 3 － 4)
第一作者 Tel:13877502503;E － mail:liujichenggood@ 126． com
HPLC法测定多叶越南槐中红车轴草苷及高丽槐素的含量*
刘吉成1，卢森华1，谢巍2，卢文杰3
(1．广西玉林食品药品检验所，玉林 537000;2．广西中医药大学，南宁 530001;3．广西中医药研究院，南宁 530022)
摘要 目的:建立测定多叶越南槐药材中红车轴草苷及高丽槐素 2 个黄酮类成分含量的高效液相色谱法。方法:采用 Agilent
Eclipse XDB －C18色谱柱(4. 6 mm ×250 mm，5 μm)，柱温 25 ℃，以乙腈 －0. 1%乙酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速 1. 0 mL·min
－1，
检测波长 310 nm，进样量 10 μL，外标法定量。结果:红车轴草苷进样量在 0. 025 1 ～ 2. 51 μg范围内与峰面积呈良好的线性关
系(r = 0. 999 0) ，平均回收率为 97. 0%(ＲSD = 1. 5%) ;高丽槐素进样量在 0. 025 2 ～ 2. 52 μg范围内与峰面积呈良好的线性关
系(r = 0. 999 0) ，平均回收率为 101. 3%(ＲSD = 2. 2%)。结论:建立的含量测定方法符合方法验证要求。
关键词:多叶越南槐;红车轴草苷;高丽槐素;高效液相色谱;黄酮成分测定;方法验证
中图分类号:Ｒ 917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2015)01 － 0121 － 04
HPLC method for simultaneous determination of trifolirhizin and
maackiain in Sophora tonkinensis Gagnep． var．
polyphylla S． Z． Huang et Z． C． Zhou*
LIU Ji － cheng1，LU Sen － hua1，XIE Wei2，LU Wen － jie3
(1． Guangxi Yulin Institute for Food and Drug Control，Yulin 537000，China;2． Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China;
3． Guangxi Institute of Chinese Medicine and Pharmaceutical Science，Nanning 530022，China)
Abstract Objective:To establish an HPLC method to determine the content of two flavonoids(trifolirhizin and
maackiain)in Sophora tonkinensis Gagnep． var． polyphylla S． Z． Huang et Z． C． Zhou． Methods:An Agilent Eclipse
XDB － C18 column(4. 6 mm × 250 mm，5 μm)was adopted，and the mobile phase consisted of acetonitrile and
0. 1% aqueous acetic acid with a gradient elution． The flow rate was 1. 0 mL·min －1，the column temperature was
25 ℃，the detection wavelength was 310 nm and the injection volume was 10 μL，the sample was quantified with ex-
ternal standard． Ｒesults:The calibration curve of trifolirhizin was in good linearity at 0. 025 1 －2. 51 μg(r = 0. 999 0)
and the average recovery was 97. 0% with ＲSD of 1. 5% ． The calibration curve of maackiain was in good linearity at
0. 025 2 － 2. 52 μg(r = 0. 999 0)and the average recovery was 101. 3% with ＲSD of 2. 2% ． Conclusion:The
method established in this paper conforms to the requirements of the methodology validation．
Keywords:Sophora tonkinensis Gagnep． var． polyphylla S． Z． Huang et Z． C． Zhou;trifolirhizin;maackiain;HPLC;
flavonoid determination;method validation
多叶越南槐(Sophora tonkinensis Gagnep． var．
polyphylla S． Z． Huang et Z． C． Zhou)为豆科槐属植物
越南槐(山豆根)的一个新变种，生长于石山区，分
布于广东、贵州、广西、云南和江西等地，具有清热解
毒、消肿利咽之功效［1］。作为广西常用的民间药，
主要用于咽喉肿痛、火毒蕴结齿、肺热咳嗽、龈肿痛、
肝炎等的治疗。现代药理研究表明，多叶越南槐具
有一定的抗炎、镇痛、抗肝损伤、抗肺栓塞、免疫增
强、抗疲劳［2］及保肝护肝等［3］药理作用。广西中医
药研究院卢文杰教授从多叶越南槐中提取分离出长
链脂肪酸类成分［4］、生物碱成分(包括苦参碱、氧化
苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、金雀花碱、槐花醇
等)［5］和黄酮类成分(包括红车轴草苷、高丽槐素、
芒柄花素等)［6］。目前有关多叶越南槐质量标准方
—121—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(1)
面研究的报道只有性状和显微鉴别［7 － 8］，为完善多
叶越南槐药材的质量控制标准，本实验建立了
HPLC同时测定多叶越南槐药材中主要黄酮类成分
红车轴草苷及高丽槐素含量的方法，为控制多叶越
南槐的质量提供了一种新的方法。
1 仪器与试药
1. 1 仪器
UltiMate 3000 高效液相色谱仪(Thermo Scientif-
ic);AG － 204 电子分析天平(METTLEＲ TOLEDO);
HH －S6数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂);Milli-
pore Simplicity －UV超纯水器(美国密里博)。
1. 2 试药
多叶越南槐药材采集于广西西林、忻城、来宾、
天峨、合山、大化、都安、东兰、马山等地，经广西中医
药研究院卢文杰教授鉴定为豆科槐属植物多叶越南
槐(Sophora tonkinensis Gagnep． var． polyphylla S． Z．
Huang et Z． C． Zhou) ;红车轴草苷及高丽槐素的对
照品由广西中医药研究院卢文杰教授提供(经 DAD
检测器进行峰纯度检测均为单一成分峰，用面积归
一化法算得纯度大于 99. 9%) ;液相色谱用水为超
纯水，甲醇、乙腈(Fisher;色谱纯) ，冰乙酸(色谱纯)
及提取用甲醇、乙醇(分析纯) ，西陇化工股份有限
公司。
2 方法与结果
2. 1 溶液制备
2. 1. 1 混合对照品储备液 精密称取红车轴草苷
对照品 10. 02 mg、高丽槐素对照品 10. 04 mg，置同
一 20 mL量瓶中，加适量甲醇超声使溶解并稀释至
刻度，摇匀，制成每 1 mL 溶液中含红车轴草苷
0. 502 mg、高丽槐素 0. 504 mg的混合溶液，即得。
2. 1. 2 供试品溶液 取过 4 号筛的多叶越南槐
药材粉末约 1. 0 g，置 150 mL 具塞三角瓶中，精
密称定，精密加入甲醇 20 mL，称量，加热回流提
取 1. 5 h，放冷，用甲醇补足减失的量，过滤，取续
滤液用 0. 45 μm 微孔滤膜过滤，即得。
2. 2 色谱条件与系统适用性试验
采 用 Agilent Eclipse XDB － C18 色 谱 柱
(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，以乙腈 － 0. 1%乙酸
水溶液为流动相，梯度洗脱(0 ～ 10 min，乙腈体
积分数为 30%，0. 1% 乙酸水溶液体积分数为
70%;10 ～ 25 min，乙腈体积分数 30% →75%，
0. 1%乙酸水溶液体积分数 70% →25%) ，流速
1. 0 mL·min － 1，检测波长 310 nm，柱温 25 ℃，进
样量10 μL。红车轴草苷及高丽槐素的理论塔板
数均大于 5 000，与相邻杂质峰的分离度均大于
1. 5，色谱图见图 1。
图 1 对照品(A)、产地为西林的样品(B)HPLC色谱图
Fig． 1 HPLC chromatograms of reference substance(A)and sample from
Xilin(B)
1．红车轴草苷(trifolirhizin) 2．高丽槐素(maackiain)
2. 3 线性关系考察
精密吸取混合对照品储备液 0. 05、0. 5、1、2、3、
5 mL，分别置 10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇
匀。按“2. 2”项色谱条件进样测定，以峰面积为纵
坐标，进样量(μg)为横坐标，经线性回归处理得红
车轴草苷和高丽槐素的回归方程:
Y = 12. 96X + 0. 052 r = 0. 999 0
Y = 25. 66X + 0. 269 r = 0. 999 0
线性范围分别为 0. 025 1 ～ 2. 510 μg 和
0. 025 2 ～ 2. 520 μg。
2. 4 精密度试验
取多叶越南槐药材(产地为百色西林)粉末约
1. 0 g，精密称定，按“2. 1. 2”项下方法制备供试品溶
液，连续进样测定 6 次，记录峰面积。结果红车轴草
苷峰面积的 ＲSD为 0. 29%，高丽槐素峰面积的 ＲSD
为 0. 10%，表明仪器精密度良好。
2. 5 稳定性试验
取上述多叶越南槐供试品溶液，分别于 0、2、4、
12、24 h进样10 μL，记录峰面积。结果红车轴草苷峰
面积的 ＲSD 为 0. 32%，高丽槐素峰面积的 ＲSD 为
0. 25%，表明供试品溶液在 24 h内基本稳定。
—221— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(1)
2. 6 重复性试验
取同一批多叶越南槐药材(产地为百色西林)
粉末 6 份，每份约 1. 0 g，精密称定，按“2. 1. 2”项下
方法制备供试品溶液，分别进样 10 μL，记录峰面
积，并计算含量。红车轴草苷的平均含量为
1. 33 mg·g －1，ＲSD 为 3. 0%;高丽槐素的平均含量
为 1. 47 mg·g －1，ＲSD为 2. 7%。表明该方法重复性
良好。
2. 7 加样回收率试验
精密称取红车轴草苷对照品 6. 65 mg、高丽槐
素对照品 7. 4 mg，置 200 mL量瓶中，加适量甲醇超
声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶
液。精密称定已测定含量(每 1 g 中含红车轴草苷
1. 33 mg，高丽槐素 1. 47 mg)的过 4 号筛的多叶越
南槐药材粉末 6 份，每份约 0. 5 g，置 150 mL具塞三
角瓶中，精密称定，分别精密加入混合对照品溶液
20 mL，按“2. 1. 2”项方法制备供试溶液，分别进样
10 μL，记录峰面积，计算红车轴草苷及高丽槐素的
量，求得回收率。结果红车轴草苷平均回收率(n =
6)为 97. 0%，ＲSD = 1. 5%;高丽槐素平均回收率
(n = 6)为 101. 3%，ＲSD = 2. 2%。表明该方法回收
率良好。
2. 8 样品含量测定
取 10 批不同产地的多叶越南槐药材粉末，分别
按“2. 1. 2”项下方法制备供试品溶液，分别进样
10 μL，记录红车轴草苷及高丽槐素的峰面积，采用
外标峰面积法计算含量，结果见表 1。
表 1 红车轴草苷及高丽槐素的含量测定结果(n =2)
Tab． 1 The determination results of contents of
trifolirhizin and maackiain
序号
(No．)
产地
(origin)
采收时间
(harvesting time)
含量(content)/(mg·g － 1)
红车轴草苷
(trifolirhizin)
高丽槐素
(maackiain)
1 西林(Xilin) 2011 － 07 － 04 1. 33 1. 47
2 忻城(Xincheng) 2012 － 07 － 23 2. 09 1. 18
3 忻城(Xincheng) 2011 － 09 － 14 1. 50 1. 56
4 来宾(Laibin) 2011 － 11 － 07 1. 75 1. 01
5 天峨(Tian＇e) 2011 － 09 － 08 1. 08 0. 93
6 合山(Heshan) 2011 － 10 － 18 1. 23 0. 65
7 大化(Dahua) 2011 － 09 － 12 1. 25 0. 88
8 都安(Du＇an) 2011 － 10 － 12 1. 54 1. 28
9 东兰(Donglan) 2012 － 08 － 30 1. 59 1. 11
10 马山(Mashan) 2012 － 07 － 12 1. 08 1. 00
3 讨论
3. 1 提取条件的选择
本试验考察了超声提取与回流提取 2 种提取方
法，发现回流提取的红车轴草苷及高丽槐素 2 个黄
酮类成分含量比超声要高，故选回流提取的方法来
提取样品。另分别考察提取溶剂甲醇、乙醇和 50%
乙醇，结果甲醇提取效果较优，2 个黄酮类成分的提
取率高，且提取液中杂质干扰较少。另对回流提取
时间进行比较，结果测得回流提取 1. 5 h 后趋于稳
定，故选定提取时间为 1. 5 h。
3. 2 洗脱条件的选择
红车轴草苷及高丽槐素 2 个黄酮类成分的极性
相差较大，曾用乙腈 － 0. 1%乙酸水溶液按不同的比
例等度洗脱［12 － 13］，发现高丽槐素色谱峰的保留时间
较长，改用梯度洗脱条件［14］，两者的出峰时间比较
适中，且与杂质峰分离较好，因此选定以乙腈 －
0. 1%乙酸水溶液作为流动相，按照不同的比例梯度
洗脱。
3. 3 小结
本试验测定了不同产地的 10 个批次的多叶越
南槐药材中红车轴草苷及高丽槐素 2 个黄酮类成分
的含量，其药材的 HPLC色谱图基本一致，但不同产
地的药材中红车轴草苷及高丽槐素 2 个黄酮类成分
的含量有一定差异。综上所述，该方法简便，分离效
果好，专属性较强，为多叶越南槐药材多指标质量标
准的建立提供了科学依据。
参考文献
［1］ XIE ZW(谢宗万)． Discusses the Varieties of Chinese Herbal
Medicines(中药材品种论述) ［M］． Shanghai(上海) :Shanghai
Science and Technology Publishers(上海科学技术出版社) ，
1990:142
［2］ ZHANG Y(张颖) ，ZHONG ZX(钟正贤) ，LU WJ(卢文杰) ，et
al． Protective effects of Sophora tonkinensis Gagnep． var． polyphyl-
la S． Z． Huang et Z． C． Zhou to acute liver injury in mice(多叶
越南槐对小鼠急性肝损伤的保护作用) ［J］． Chin J Tradit
Med Sci Technol(中国中医药科技) ，2012，19(4) :325
［3］ ZHANG Y(张颖) ，ZHONG ZX(钟正贤) ，LU WJ(卢文杰) ，et
al． The pharmacological studies of Sophora tonkinensis Gagnep．
var． polyphylla S． Z． Huang et Z． C． Zhou(多叶越南槐的药理作
用研究) ［J］． Guid J Tradit Chin Med Pharm(中医药导报) ，
2011，17(11) :62
［4］ LU WJ(卢文杰) ，YA QK(牙启康) ，ZHOU B(周斌) ，et al． Li-
posoluble components from Sophora tonkinensis var． polyphylla
(多叶越南槐脂溶性成分研究) ［J］． Guangxi Sci(广西科学) ，
2011，18(1) :56
［5］ LU WJ(卢文杰) ，LU GS(陆国寿) ，TAN X(谭晓) ，et al． Alka-
—321—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(1)
loids isolated from Sophora tonkinensis var． polyphylla(多叶越南
槐生物碱类成分的研究) ［J］． Chin J Exp Tradit Med Form(中
国实验方剂学杂志) ，2014，20(8) :96
［6］ LU WJ(卢文杰) ，LU GS(陆国寿) ，TAN X(谭晓) ，et al． Stud-
ies on the chemical constituents from Sophora tonkinensis var．
polyphylla(多叶越南槐化学成分的研究) ［J］． West China J
Pharm(华西药学杂志) ，2014，29(5) :28
［7］ LAN ZZ(蓝祖栽) ，NING XQ(宁小清) ，TAN YF(谈远锋) ，et
al． Comparative study traits and microscopic identification of So-
phora tonkinensis Gapnep． and Sophora tonkinensis Gagnep． var．
polyphylla S． Z． Huang et Z． C． Zhou(越南槐与多叶越南槐的
性状与显微鉴别比较研究) ［J］． Lishizhen Med Mater Med Ｒes
(时珍国医国药) ，2010，21(4) :939
［8］ Guangxi Zhuang Autonomous Ｒegion Health Department(广西壮
族自治区卫生厅)． Guangxi Chinese Materia Medica Standards
(广西中药材标准) ［S］． Nanning(南宁) :Guangxi Science and
Technology Press(广西科学技术出版社) ，1992:18
［9］ LI Ｒ(李锐) ，CHEN GB(陈国彪)． Determination of maackiain
in root of Millettia speciosa by HPLC(HPLC法测定牛大力中高
丽槐素的含量) ［J］． Chin Pharm Aff(中国药事) ，2011，25
(2) :124
［10］ ZHAO YZ(赵月珍) ，XIANG DX(向大雄)． Determination of
trifolirhizin in Sophora flavescens Ait． by HPLC(高效液相色谱
法测定苦参中红车轴草苷的含量) ［J］． Cent South Pharm(中
南药学) ，2008，6(1) :50
［11］ CHEN C(陈超) ，QI JB(亓建斌) ，MA DY(马大友)． Determi-
nation of (-)maackiain in Jin Quegen by ＲP － HPLC(反相高效
液相色谱法测定金雀根中高丽槐素的含量) ［J］． Nat Prod
Ｒes Dev(天然产物研究与开发) ，2008，20(3) :472
［12］ HUANG YS(黄韵诗)． Determination of maackiain in Sophora
tonkinensis Gapnep． by HPLC(高效液相色谱法测定山豆根中
高丽槐素的含量) ［J］． Cent South Pharm(中南药学) ，2008，6
(2) :193
［13］ LU XH(陆向红)． Determination of trifolirhizin in Sophora
tonkinensis Gapnep． by HPLC(高效液相色谱法测定山豆根中
红车轴草苷的含量) ［J］． Cent South Pharm(中南药学) ，
2009，7(5) :333
［14］ YAN HL(严红亮) ，GUO YX(郭益新) ，ＲEN WQ(任卫琼) ，et
al． Determination of trifolirhizin and maackiain in Sophora
tonkinensis Gapnep． by HPLC(高效液相色谱法测定山豆根中
红车轴草苷及高丽槐素的含量) ［J］． Cent South Pharm(中南
药学) ，2010，6(2) :407
(本文于 2014 年 5 月 7 日收到)
—421— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(1)