全 文 ：HPLC法测定不同产地蜂房中没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸
刘东洋1 ,2 ,史国兵1 3 ,赵庆春1
(11 沈阳军区总医院 药剂科 , 辽宁 沈阳 　110016 ; 21 辽宁医学院 ,辽宁 锦州 　121001)
摘 　要 :目的 　建立同时测定蜂房药材中没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸的方法。方法 　采用 HPLC 法 ,梯度
洗脱。色谱柱为 Kromasil ODS2C18 (250 mm ×416 mm ,5μm) ,流动相为甲醇2水 (三氟乙酸调 p H 至 5) ,体积流量
110 mL/ min ,柱温 30 ℃,检测波长 254 nm。结果 　没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸质量浓度与峰面积均呈良
好的线性关系 ,平均回收率分别为 9819 %(RSD 为 1101 %) 、9814 %(RSD 为 1118 %) 、9713 %(RSD 为 1118) 。结论
该方法准确、重现性好、专属性强 ,可为蜂房质量标准的控制提供依据。
关键词 : HPLC ;蜂房 ;没食子酸 ;对羟基苯甲酸 ;原儿茶酸
中图分类号 :R28216 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0620977202
　　蜂房为胡蜂科昆虫果马峰 Pol istes ol i v aceous
(De Geer) 、日本长脚胡蜂 P1 j a ponicus Saussure 或
异腹胡蜂 Para pol ybi a v ari a Fabricius 的巢。《中
国药典》2005 年版中记载蜂房具有祛风 ,攻毒 ,杀
虫 ,止痛的作用。《中药大辞典》中记载蜂房药液具
有“去腐、生肌、消炎、止痛等作用 ,并能促进创口早
期愈合”。近年来国内多篇文献报道蜂房临床疗效
显著 ,大多数集中于抗肿瘤与抗炎两个方面 ,已有文
献明确指出抗肿瘤物质基础在于它所含有的极性低
的脂肪酸类[ 1 ] ,而关于抗炎作用的物质基础研究报
道甚少。在前期工作中 ,发现蜂房的正丁醇提取物
具有明显的抗炎活性 ,从中分离并鉴定了部分酚酸、
含氮类化合物[2 ] 。为了进一步对阐明蜂房抗炎活性
的物质基础 ,本实验对 16 批不同产地蜂房药材进行
了 H PL C 比较分析 ,建立了同时测定蜂房药材中主
要成分没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸量的方
法 ,为蜂房药材质量控制提供了借鉴。
1 　仪器与试药
高效液相色谱仪 : Waters 600 E 泵 , Waters
PAD996 二极管阵列检测器 ;紫外分光光度仪 (UV2
2501PC ,日本岛津) ;电子分析天平 ( UV120D ,日本
岛津) ;高效液相色谱用试剂 :甲醇 (色谱纯) ,三氟乙
酸 (分析纯) ,没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸对
照品购自中国药品生物制品检定所 ;实验室用药材
来自不同产地均由沈阳药科大学中药教研室孙启时
教授鉴定为 P. ol i v aceous (De Geer) 。
2 　试验方法与结果
211 　色谱条件 :色谱柱为 Kromasil ODS2C18 (250
mm ×416 mm ,5μm) ;流动相为甲醇 (A)2水 (三氟
乙酸调 p H 至 5) (B) ;梯度洗脱程序 : 0 min (0 %
A) ,15 min (8 % A) ,18 min (12 % A) ,30 min (15 %
A) ,45 min (18 % A) ;体积流量 :110 mL/ min ;检测
波长 :254 nm ;柱温 25 ℃。色谱图见图 1。
图 1 　对照品( A)和蜂房( B)色谱图
Fig11 　HPLC Chromatograms of reference substances
( A) and Nidus Ves pae ( B)
212 　供试品溶液的制备 :称取剪碎的峰房药材 (辽
宁沈阳) 2 g ,用 20 倍水煎煮 3 次 ,水煎液用滤纸滤
过 ,所得滤液浓缩至约 10 mL ;将浓缩液醇沉 12 h ,
滤过得醇沉液 ;醇沉液减压浓缩至无醇味 ,用水 25
mL 分次定量转移至分液漏斗中 ,正丁醇等体积萃
取 3 次 ,萃取液合并 ,旋转蒸发至干 ,用甲醇溶解并
定容至 10 mL 量瓶中 ,微孔滤膜滤过 ,取续滤液作
为供试品溶液。
213 　对照品溶液的制备 :精密称没食子酸对照品 810
mg、对羟基苯甲酸对照品 716 mg 和原儿茶酸对照品
1111 mg ,分别置于 10 mL 量瓶中 ,用甲醇溶液稀释到
刻度 ,摇匀即得 ,作为对照品储备液。分别精密吸取
上述贮备液 110 mL ,置同一 10 mL 量瓶中 ,用甲醇溶
液稀释到刻度 ,摇匀即得 ,作为对照品溶液。
·779·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
3 收稿日期 :2008208217　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :刘东洋 (1981 —) ,男 ,辽宁铁岭人 ,硕士研究生 ,主要从事生药学研究。3 通讯作者　史国兵　Tel : (024) 23056262 　E2mail :sysgb @1261com
214 　线性关系的考察 :精密吸取对照品溶液 0104、
011、012、014、016、018、110、115、118 mL ,分别置于
2 mL 量瓶中 ,用甲醇溶液稀释到刻度 ,摇匀 ,分别进
样 5μL 。以各成分峰面积为纵坐标 ( Y) ,质量浓度
为横坐标 ( X ) , 绘制标准曲线 , 计算回归方程 :
Y没食子酸 = 8197 ×106 X + 7 31711 , r = 01999 6 ,线性
范围 116～7210μg/ mL ; Y对羟基苯甲酸 = 1195 ×107 X -
73 247 , r = 01999 5 ,线性范围 1152～6814μg/ mL ;
Y原儿茶酸 = 5101 ×107 X - 169 012 , r = 01999 8 ,线性
范围 2122～9919μg/ mL 。
215 　精密度试验 :取同一供试品溶液 ,分别连续进
样 6 次 ,测定没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸峰
面积 ,结果 RSD 分别为 01 41 %、0156 %、0172 % ,均
小于 2 % ,表明仪器精密度良好。
216 　重现性试验 :取同一批蜂房样品 6 份 (辽宁沈
阳) ,按供试品溶液的制备方法制备成 6 份 ,分别进样
5μL ,测定峰面积 ,结果没食子酸、对羟基苯甲酸、原
儿茶酸质量分数的 RSD 分别为 0183 %、0174 %、
0195 % ,均小于 2 % ,表明方法重现性良好。
217 　稳定性试验:取同一供试品溶液 ,分别于 0、2、4、6、8、
24 h进样 5μL。结果 ,没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸
的峰面积的 RSD 分别为 1172 %、1161 %、2119 %,均小于
5 %,表明供试品溶液在24 h内稳定。
218 　回收率试验 :精密称取 6 份已测定的蜂房 (辽宁
沈阳) 1 g ,分别加入没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿
茶酸对照品溶液适量 ,按 212 项下操作 ,计算回收率。
结果没食子酸平均回收率 9819 % ,RSD 为 1101 % ;对
羟基苯甲酸平均回收率 9814 % ,RSD 为 1118 %;原儿
茶酸平均回收率 9713 % ,RSD 为 1118 %。
219 　样品测定 :分别取不同产地的蜂房 1 g ,按照上
述方法制备供试品溶液 ,分别进样 5μL ,测定峰面
积 ,根据标准曲线计算样品中没食子酸、对羟基苯甲
酸和原儿茶酸的量 ,结果见表 1。
3 　讨论
311 　检测波长的选择 :采用 Waters 二级管阵列检
测器对检测波长进行了选择 ,首先从中选出 243、
254、261 nm 3 个分离度较好的波长 ,然后进一步通
过分析比较这 3 个波长下的图谱 ,发现检测波长为
254 nm 时 ,3 种酚酸均有最大吸收 ,且基线较平稳 ,
色谱峰分离较好。
312 　流动相的选择 :化合物在色谱柱上的保留行为
与其化学结构有关 ,没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿
茶酸化学结构有着一定差别 ,对羟基苯甲酸、原儿茶
酸保留时间远大于没食子酸 ,等度洗脱不适宜同时
表 1 　样品来源及其测定结果( n = 5)
Table 1 　Origin of samples and their determinations ( n = 5)
编号 来源
没食子酸
质量分数/
(mg ·g - 1 )
RSD
/ %
对羟基苯甲酸
质量分数/
(mg ·g - 1 )
RSD
/ %
原儿茶酸
质量分数/
(mg ·g - 1 )
RSD
/ %
1 锦州 　 01225 1169 01315 1194 01334 1102
2 铁岭 　 01212 1187 01326 1108 01354 0194
3 沈阳 　 01256 1142 01365 0195 01327 0180
4 丹东 　 01265 1128 01385 0198 01404 0179
5 吉林 　 01213 1189 01336 0182 01309 1102
6 佳木斯 01231 1143 01357 0184 01322 0199
7 石家庄 01244 0191 01343 0174 01298 0194
8 天津 　 01217 1120 01328 0158 01406 0187
9 开封 　 01195 1163 01295 0187 01284 1136
10 郑州 　 01206 1149 01294 0163 01313 0192
11 淄博 　 01224 1156 01364 0168 01277 1109
12 东海 　 01176 1192 01315 1104 01345 1116
13 武汉 　 01190 1175 01287 1113 01341 1105
14 常德 　 01255 1106 01373 0157 01397 0157
15 亳州 　 01230 1127 01353 0148 01376 0158
16 中山 　 01249 1110 01368 0170 01393 0180
测定这 3 种成分 ,故采用梯度洗脱 ,可缩短分析时
间 ,同时定量 3 个成分 ;分别用甲醇2水 (加三氟乙
酸) 、乙腈2水、乙腈2磷酸盐缓冲体系为流动相 ,以不
同梯度进行试验 ,结果表明用甲醇2水 (三氟乙酸调
p H 值至 5)线性梯度洗脱效果最好。
313 　提取条件的条件 :蜂房提取选用传统的水煎醇
沉工艺 ,但要考虑选加水量、煎煮时间、煎煮次数和
醇沉浓度的因素 ,选用 L 9 (34 ) 正交方案 ,系统考察
了 4 个因素对蜂房提取工艺的影响 ,选定蜂房最优
提取工艺 ,即每次用 20 倍量的水煎煮 3 次 ,总提取
时间为 4 h ,醇沉体积分数为 60 %。
314 　提取溶媒的选择 :通过对提取溶媒的考察 ,蜂
房水煎液的正丁醇提取物抗炎活性明显 ;此外 ,通过
对蜂房水煎液正丁醇提取物与水层图谱比较 ,没食
子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸的峰面积显著提高 ,
杂质明显减少。蜂房水煎液的正丁醇层提取物 ,不
仅有利于 3 种酚酸类化合物的定量测定 ,更有利于
不同产地蜂房抗炎活性的比较。
本实验建立了峰房药材中没食子酸、对羟基苯
甲酸和原儿茶酸的定量测定方法 ,该方法方便、快
捷、可靠 ;结果表明不同产地蜂房中 3 种酚酸的量存
在一定差异 ,以辽宁丹东、湖南和广东中山蜂房药材
中 3 种酚酸的量较高 ,考虑的可能因素有产地、加
工、采用季节、储存时间和方式等有关。
参考文献 :
[ 1 ] 　赵维成 , 肖　伟 , 于德泉 , 等1 蜂房抗肿瘤成分的提取及分
析检测 [J ]1 实用肿瘤学杂志 , 2000 , 14 (1) : 141
[ 2 ] 　王　伟 , 赵庆春 , 安 　晔 , 等 1 中药蜂房化学成分的研究
[J ]1 中国药物化学杂志 , 2007 , 15 (1) : 161
·879· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月