全 文 ：罗汉果试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生
刘华英 ,覃灵华 3
(广西师范大学生命科学学院 ,广西 桂林 　541004)
摘　要 :目的 　为罗汉果 S i rai tia g rosvenori i 种质资源的保存提供一条新途径。方法 　以继代 15 d 生长健壮的罗
汉果试管苗 018～1 cm 长嫩梢进行预培养 ,剥取 2～3 mm 茎尖 ,25 ℃下 60 % PVS2 装载 ,再用 100 % PVS2 在 0 ℃
脱水处理 ,更换新鲜 100 % PVS2 后投入液氮保存 24 h ,化冻 ,用 MS + 112 mol/ L 蔗糖的液体培养基洗涤 ,滤纸吸
干后接种于 MS + 110 mg/ L 62BA + 0105 mg/ L NAA + 011 mg/ L GA3 + 018 %琼脂粉 + 45 g/ L 蔗糖的恢复培养基
上 , 25 ℃暗培养 7 d , 转入正常光下培养。再生苗生根培养基为 1/ 2 MS + 012 mg/ L NAA + 30 g/ L 蔗糖。结果
嫩梢于 MS + 017 mol/ L 蔗糖的培养基上预培养 3 d ,茎尖装载 40 min ,脱水 50 min ,液氮保存后于 40 ℃水浴中快速
化冻 ,洗涤 40 min ,恢复培养 1 周时存活率最高可达 100 % ,30 d 时再生率最高可达 78133 %。再生苗转入生根培
养基可形成完整植株。结论 　罗汉果种质资源的玻璃化法超低温保存操作简单、成活率高、再生植株正常。
关键词 :罗汉果 ;茎尖 ;玻璃化法 ;超低温保存
中图分类号 :R28211 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0220293204
Cryopreservation of test2tube shoot tips of Si raitia grosvenorii by vitrif ication
and plant regeneration
L IU Hua2ying , Q IN Ling2hua
(College of Life Science , Guangxi Normal University , Guilin 541004 , China)
Abstract : Objective 　To get a new approach for conserving t he germplasm of S i rai t i a g rosvenori i1
Methods 　Shoot s , 018 —1 cm in lengt h , excised f rom test2t ube plantlet s which were subcult ured 15 d ,
were p recult ured1 Then it s shoot2tip s about 2 —3 mm in lengt h were dissected and loaded wit h 60 % PVS2
at 25 ℃, and dehydrated wit h 100 % PVS2 at 0 ℃, changed for f resh 100 % PVS2 prior to directly plunging
into liquid nit rogen1 After cryopreservation for 24 h , t he shoot tip s were t hawed , rinsed in MS + 112 mol/
L sucrose medium , blot ted wit h filter papers , t hen plated on t he MS + 110 mg/ L 62BA + 0105 mg/ L
NAA + 011 mg/ L GA3 + 018 % agar + 45 g/ L sucrose medium at 25 ℃for 7 d in dark prior to exposure
to t he light1 The root medium for regeneration plantlet s was 1/ 2 MS + 012 mg/ L NAA + 30 g/ L su2
cro se1 Results 　Shoot s were p recult ured for 3 d on MS + 017 mol/ L sucrose medium , then it s shoot2tip s
loaded for 40 min , dehydrated for 50 min1 After cryopreservation , t he shoot tip s were rapidly t hawed in
water at 40 ℃, t hen rinsed for 40 min1 The survival rate of shoot2tip s plated on t he recovering medium in
one week was 100 % , and regeneration rate af ter 30 d was 78133 % , which was the highest1 The regenera2
tion plantlet s inoculated on root medium were reconst ructed integrating plantlet s1 Conclusion 　The method
of vit rification to cryopreserve t he germplasm of S1 g rosvenori i is a simple way wit h high survival rate and
normal regeneration plant s1
Key words : S i rai t i a g rosvenori i (Swingle) C1 J eff rey ; shoot2tip s ; vit rification ; cryopreservation
　　罗汉果 S i rait i a g rosvenori i ( Swingle ) C1
J eff rey ,又叫拉汗果、长寿果、神仙果、罗晃子、光果
木鳖等 ,为葫芦科 ( Cucurbitaceae) 罗汉果属 ( S i r2 ait i a Merr)多年生草质藤本 ,雌雄异株植物 ,是广西最重要的特产中药材之一。罗汉果果实营养价值高 ,含有丰富的果糖、葡萄糖、蛋白质和多种维生素 ,
·392·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008205203
基金项目 :广西自然科学基金资助项目 (桂科自 0542032) ; 广西师范大学博士启动基金项目 ; 广西研究生教育创新计划项目
(2008106020710M255)
作者简介 :刘华英 (1971 —) ,女 ,广西桂林人 ,副教授 ,博士 ,从事植物细胞生物学教学、科研工作。　Tel :13597325026 　
E2mail :hyliuchsh @yahoo1com1cn
其性凉味甘 ,具有清热解毒、止咳润肺等功效 ,已广
泛应用于医药、饮料和调味品中。因此 ,在医疗与保
健方面有很高的应用价值和广泛的开发前景[1 ] 。
由于长期的无性繁殖 ,不仅造成罗汉果品种退
化 ,产量与品质下降 ,病虫害严重 ,而且还使一些野
生种面临绝种的危险[2 ] 。目前 ,罗汉果种质资源通
过组织培养不断继代得以保存下来 ,然而 ,组织培养
仍存在不少问题 ,如组培苗遗传性状表现不稳定 ;组
培苗容易感染病毒病等。因此 ,如何较好地保存罗
汉果种质资源是一需深入研究的课题。
超低温保存是目前植物种质资源长期稳定保存
比较理想的方法 ,在超低温 (通常指液氮温度 —196
℃)条件下 ,细胞的分化和全部代谢活动近于停止 ,
因而可以保持种质的遗传稳定性 ,达到长期保存的
目的[ 3 ] 。其中玻璃化法以其独特的优势备受人们推
崇。玻璃化法超低温保存是目前植物细胞和组织长
期稳定保存的理想方法 ,不仅能节省空间 ,无需继
代 ,避免污染 ,而且设备简单 ,操作简便。运用该方
法已成功地保存了柿和君迁子[4 ] 、木薯[ 5 ] 、怀山
药[6 ] 、石楠[ 7 ] 。本研究采用玻璃化法对罗汉果离体
茎尖进行超低温保存 ,拟建立罗汉果离体茎尖的超
低温保存体系 ,为长期安全保存罗汉果种质资源奠
定基础。
1 　材料与方法
111 　材料 :选取罗汉果青皮品种健康、无病毒的母
株上成熟果实 ,取其种子在自来水下洗净 ,于超净工
作台上除去外种皮后用 75 %酒精浸泡 30 s ,无菌水
冲洗 2 次后用 011 %升汞灭菌 8 min ,再用无菌水冲
洗 4～5 次 ,放在无菌纸上吸干多余水分后进行无菌
暗培养 (MS + 30 g/ L 蔗糖 + 017 %琼脂粉) ,萌发后
转入正常光照培养。培养温度为 (25 ±2) ℃,每天
12 h 光照。长至 10 cm 长时切取茎段继代培养
(MS + 015 mg/ L 62BA + 0105 mg/ L NAA + 30 g/ L
蔗糖 + 017 %琼脂粉)得无菌试管苗。
112 　方法
11211 　茎尖的预培养 :选取继代培养 15 d 生长健
壮的罗汉果试管苗 ,切取 018～1 cm 长嫩梢 ,接种到
分别添加 017 mol/ L 蔗糖、5 %二甲基亚砜 (DM2
SO) 、017 mol/ L 蔗糖 + 5 %二甲基亚砜的 MS 基本
培养基上 ,于 (25 ±2) ℃,正常光照下预培养不同
天数。
11212 　装载与脱水 :切取 2～3 mm 长的茎尖 ,放入
118 mL 冷冻管中 (10 个/ 管) ,用 60 % PVS2 (014
mol/ L 蔗糖 MS 液体培养基与 PVS2 溶液体积比为
40 ∶60) 在 25 ℃装载不同时间 ,再经 100 % PVS2
(30 %甘油 + 15 %乙二醇 + 15 % DMSO ,以含 014
mol/ L 蔗糖的 MS 液体培养基配制) 于 0 ℃下处理
不同时间 ,然后更换新鲜的 100 % PVS2 溶液 ,迅速
将冷冻管投入液氮中保存。每处理 20 个茎尖 ,重复
3 次。
11213 　化冻、恢复培养与植株再生 :液氮中保存 1 d
后取出茎尖 ,分别于不同温度下化冻 ,再用 MS 液体
培养液 (含 112 mol/ L 蔗糖)洗涤 4 次 ,每次 10 min ,
滤纸吸干后接种在恢复培养基 ( MS + 110 mg/ L 62
BA + 0105 mg/ L NAA + 011 mg/ L GA3 + 017 %琼
脂粉 + 45 g/ L 蔗糖)上 ,25 ℃暗培养 7 d ,转入正常
光下培养。生活力检测采用恢复生长法 ,即解冻后
一周统计成活率 (解冻后 1 周茎尖保持绿色 ,部分长
芽或长愈伤组织的茎尖占全部实验茎尖数的比率) ,
30 d 统计再生率 (长芽、长愈伤组织的茎尖占全部
实验茎尖数的比率) 。将培养成活的材料接种于生
根培养基 (1/ 2 MS + 012 mg/ L NAA + 30 g/ L 蔗
糖)上 ,诱导生根。
2 　结果与分析
211 　装载与脱水对冻后存活率与再生率的影响 :在
超低温保存过程中 ,水扮演着很重要的角色 ,它通过
进出细胞以维持渗透压的平衡 ,从而减少冻存过程
中低温对材料的伤害[8 ] 。一些植物用玻璃化溶液快
速脱水前 ,用较高浓度的溶液进行预处理 ,即装载 ,
以进一步降低组织含水量 ,避免由于渗透压变化剧
烈对材料造成伤害[3 ] 。本实验用 60 % PVS2 进行
装载 ,结果显示 (表 1) ,与对照 (预处理 0 min) 比较 ,
装载显著提高冻后存活率和再生率。材料装载后的
存活率和再生率首先随装载时间的延长而提高 ,在
处理 40 min 时达到最大值 ,然后逐渐降低。
玻璃化溶液处理是超低温保存的关键步骤。玻
璃化溶液能很快渗入到细胞 ,使材料完全达到玻璃
化状态 ,进一步使组织脱水 ,减轻伤害 ,提高存活
率[8 ] 。本实验结果 (表 1) 表明 ,脱水时间对经过装
载处理 40 min 的罗汉果茎尖冻后存活率和再生率
也有显著影响。茎尖不经过脱水处理 ,保存后不能
存活 ;随脱水时间的延长 ,存活率与再生率先升高然
后逐渐降低 ,脱水 50 min 时达峰值 ,存活率与再生
率分别为 91167 %和 46167 %。脱水时间少于 50
min ,材料脱水不够 ,不能迅速达到玻璃化状态 ,对
存活率的影响较大 ;脱水时间超过 50 min ,由于玻
璃化溶液对材料的毒害作用增强 ,造成存活率又有
所降低。
·492· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
表 1 　装载、脱水时间对冻后存活率和再生率的影响
Table 1 　Effect of different loading times and exposing times on survival rate and regeneration rate after cryopreservation
时间/ min
装　载
存活率/ % 再生率/ %
脱　水
存活率/ % 再生率/ %
0 (CK) 　　 01 0 a 　　 01 0 a 　　 010 a 　　 01 0 a
10 　　 81 33 ±21 89 b 　　 11 67 ±2189 b 　　 11167 ±2189 b 　　 31 33 ±21 89 b
20 　　 301 00 ±51 0 c 　　 131 33 ±2189 c 　　 30100 ±510 c 　　 81 33 ±21 89 bc
30 　　 431 33 ±21 89 de 　　 251 00 ±510 de 　　 43133 ±2189 d 　　 211 67 ±21 89 d
40 　　 881 33 ±21 89 f 　　 431 33 ±2189 f 　　 56167 ±2189 e 　　 281 33 ±21 89 e
50 　　 701 00 ±51 0 g 　　 281 33 ±2189 d 　　 91167 ±2189 f 　　 461 67 ±21 89 f
60 　　 481 33 ±21 89 d 　　 201 0 ±01 0 e 　　 70100 ±510 g 　　 131 33 ±21 89 c
70 　　 381 33 ±21 89 e 　　 111 67 ±2189 c 　　 38133 ±2189 d 　　　81 33 ±21 89 bc
　　　　同列内不同字母表示在 01 05 水平上差异显著 (下同)
　　　　Means wit hin same columns followed by same letter are not significantly different at 01 05 level , followings are same
212 　预培养对冻后存活率与再生率的影响 :见表
2。植物细胞内含有大量的水分 ,在低温冰冻过程会
使水结冰 ,造成对细胞结构的损伤 ,可导致细胞死
亡。用高浓度的冰冻保护剂预培养诱导组织细胞进
行保护性脱水对提高超低温保存的成活率有较大的
影响[ 9 ] 。本实验中 ,在不同培养基上预培养后的罗
汉果嫩梢变结实 ,利于切取茎尖 ,但随预培养时间的
延长 ,嫩梢逐渐变黄甚至枯死。MS + 017 mol/ L 蔗
糖的效果最好 ,存活率与再生率最高 ,分别达到
100 %和 78133 % ,MS + 017 mol/ L 蔗糖 + 5 % DM2
SO 次之 ,MS + 5 % DMSO 对罗汉果毒害最大 ,3 者
间差异显著 (表 2) 。使用 DMSO 预培养 1 d ,罗汉
果嫩梢即开始变黄 ,预培养 3 d 以上 ,嫩梢出现枯
黄 ,部分茎尖枯死 ,预培养 5 d ,再生率为 0。加入
017 mol/ L 蔗糖可能缓解了 DMSO 的毒害 ,所以存
活率与再生率比单独使用 DMSO 高。
表 2 　不同培养基上预培养的最大冻后存活率与再生率
Table 2 　Maximum survival rate and regeneration
rate after cryopreservation on different
preculture media
培养基 存活率/ % 再生率/ %
MS + 017 mol/ L 蔗糖 10010 ±010 a 78133 ±71 64 a
MS + 017 mol/ L 蔗糖 + 5 %DMSO 93133 ±2189 b 51167 ±21 89 b
MS + 5 %DMSO 73133 ±7164 c 21167 ±21 89 c
　　在 MS + 017 mol/ L 蔗糖培养基上预培养 0～7
d 的结果显示 (图 1) ,预培养 1～6 d ,存活率显著高
于无预培养 ,最高达到 100 % (1～5 d) ,超过 6 d 则
显著降低。再生率则随预培养时间延长而升高 ,预
培养 3 d 时 ,再生率最高 ,达 78133 % ,超过 3 d ,再生
率逐渐降低 ,6～7 d 时显著低于对照 ,可能蔗糖处
理过长 ,引起细胞内严重脱水 ,甚至造成质壁分离 ,
导致再生困难。因此 ,预培养时间以 3 d 为宜。
213 　化冻方式对冻后存活率与再生率的影响 :化冻
预培养时间/ d
图 1 　预培养时间对冻后存活率与再生率的影响
Fig11 　Effect of preculture time on survival rate
and regeneration rate after cryopreservation
的速度也是玻璃化冻存的关键环节。化冻温度过
低 ,容易出现次生结冰 ,对组织、细胞造成伤害 ,伤害
程度与冻存降温时的同样严重[10 ] 。本实验结果 (表
3)显示 ,不同化冻温度对冻后存活率和再生率影响
显著 ,随化冻温度的升高 ,存活率与再生率逐渐升
高 ,40 ℃水浴快速化冻效果最好。0 ℃时存活率与
再生率比较低 ,可能因为化冻温度低 ,化冻速度较
慢 ,所以化冻过程出现次生结冰 ,化冻后温度维持较
长时间在 0 ℃,同样对茎尖造成伤害。
表 3 　化冻方式对冻后存活率与再生率的影响
Table 3 　Effect of different tha wing models
on survival rate and regeneration
rate after cryopreservation
化冻温度/ ℃ 　存活率/ % 再生率/ %
0 　　 711 67 ±21 89 a 　　33133 ±21 89 a
25 　　 931 33 ±21 89 b 　　56167 ±51 77 b
40 　　1001 0 ±01 00 c 　　78133 ±71 64 c
214 　茎尖恢复培养与植株再生 :茎尖超低温保存化
冻后接种于恢复培养基上。恢复培养 1 周 ,存活的
茎尖仍然为绿色或长出绿色的芽点 ,不存活的茎尖
变枯黄或褐色 (图 22A) 。1 周后 ,不存活的茎尖不
再变化 ,存活的茎尖部分形成愈伤组织 (图 22B) ,部
·592·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
分直接成苗并进一步形成丛生芽 (图 22C ,D) ,待植
株生长到一定高度后 ,转到生根培养基上 ,诱导生根
容易 ,根数较多 (图 22E) 。再生植株在形态上与常
规培养苗无异。
A2冻存后存活茎尖 (恢复培养 1 周) 　B2冻存后茎尖形成愈伤组织　C2冻存后茎尖直接成苗
D2冻存后茎尖形成丛生芽　E2冻存后再生苗生根
A2survival shoot2tip s after cryopreservation (1 week) 　B2callus derived f rom cryopreserved shoot2tip s 　C2regeneration plantlet s
f rom cryopreserved shoot2tips 　D2cluster buds derived f rom cryopreserved shoot2tips 　E2rooting of plantlet s after cryopreservation
图 2 　超低温保存后罗汉果茎尖培养和植株再生
Fig12 　Shoot2tips culture of S1 grosvenorii and plant regeneration after cryopreservation
3 　讨论
超低温保存成功与否 ,与材料的生理状态有关。
预培养是改变保存材料生理状态的重要步骤。预培
养的目的是增加细胞分裂与分化的同步性 ,减少细
胞内自由水的量 ,提高细胞的抗冻性 ,使材料冷冻后
仍能保持较高的生活力[11 ] 。不同材料需要不同的
预培养条件 ,5 %DMSO 适合柑桔茎尖的预培养[12 ] ,
高浓度蔗糖则适合柿和君迁子[ 4 ] ,而石楠[7 ] 不需要
预培养。本实验中 ,预培养可提高存活率和再生率 ,
高浓度蔗糖较适合。
生物材料在液氮条件下 ,其生理代谢基本停止 ,
所以保存时间长短不会影响保存结果 ,如广东粉蕉
一号 (ABB)茎尖[ 13 ]保存 1 h、1 d、1 周、10 周的存活
率都在 60 %以上 ,彼此之间差异不显著 ;大蒜[14 ] 茎
尖在液氮保存 2 d 和 1 个月茎尖存活率没有差别 ,
均可达 100 %。因此 ,本实验仅对茎尖在液氮中保
存 24 h 的存活和再生进行研究 ,结果在实际应用上
也是可行的。
　　玻璃化法超低温保存是一个连续过程 ,化冻后
的洗涤也是很重要的一个环节 ,这一过程不仅可除
去高含量玻璃化溶液对细胞的毒性 ,而且也是一个
后过渡 ,以防渗透损伤 ,影响材料恢复和继续生长 ,
因此需要除去玻璃化溶液[ 6 ] 。一般用含 112 mol/ L
蔗糖的培养液洗涤 2 次 ,每次 10 min。本实验发
现 ,罗汉果茎尖经玻璃化超低温保存后 ,洗涤 4 次 ,
每次洗涤 10 min ,效果好于洗涤 2 次或超过 4 次 ,表
明洗涤次数少 ,则去除玻璃化溶液不彻底 ,洗涤次数
多 ,则容易损伤细胞 ,都会影响茎尖存活。
影响超低温保存材料遗传稳定性的因素很多 ,
主要是材料和保存方法。通过茎尖培养再生植株 ,
不经过愈伤组织阶段 ,可减少发生变异的机率。木
薯茎尖用 5 % DMSO + 5 %蔗糖 + 5 %甘油脱水[15 ] ,
恢复培养时产生愈伤组织 ,而用 013 mol/ L 蔗糖预
培养 16 h ,2 mol/ L 甘油 + 014 mol/ L 蔗糖室温下
装载 20 min ,然后在 PVS2 室温下脱水 45 min ,恢复
培养时茎尖可以直接再生成苗[5 ] 。白杨树[ 16 ] 恢复
培养时添加 BA 310μmol/ L + GA3 110μmol/ L 产
生大量愈伤组织 ,添加 BA 115μmol/ L + GA3 015
μmol/ L 时茎尖直接再生成植株。本实验中 ,存活
后的罗汉果茎尖直接再生成苗占再生率的
30177 % ,部分形成愈伤组织。应尽量避免愈伤组织
的产生 ,上述方法是否可行 ,有待于进一步研究。
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