全 文 ：当归根际土壤水浸液的自毒作用研究及化感物质的鉴定
张新慧1, 2, 3 , 郎多勇4 ,张恩和2 *
收稿日期: 20100413
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 31060182) ; 甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目; 宁夏自然科学基金项目 ( NZ10109) ; 甘肃
省教育厅项目 ( 0906B- 04) ; 国家科技支撑计划项目 ( 2007BAI37B02)
作者简介:张新慧( 1979 ) ,女,甘肃岷县人,讲师,博士,主要从事中药栽培与质量评价研究。Em ail : zh angx h801011@ yah oo. com
* 通讯作者 张恩和,教授,博士生导师。Tel: ( 0931) 8816658 Emai l: z han geh@ gsau. edu. cn
( 1 宁夏医科大学药学院, 宁夏 银川 750004; 2 甘肃农业大学农学院, 甘肃 兰州 730070; 3 宁夏回药现代化
工程技术研究中心, 宁夏 银川 750004; 4 宁夏医科大学医学科学技术研究中心, 宁夏 银川 750004)
摘 要:目的 通过对当归根际土壤提取液的生物学试验和有机化合物的分离鉴定, 探讨当归连作障碍与自毒作
用的关系。方法 设置水 ( CK)、当归根际土水提液 100、125、250、500 mg/ mL 共 5 个处理, 用于当归自毒作用的
生物学实验;气相色谱质谱联用技术 ( GCMS) 鉴定当归根际土壤有机化合物。结果 125 mg / mL 当归根际土壤
水提液能显著抑制当归自身种子发芽率、发芽指数及胚根和胚芽的伸长,且随水提液浓度的升高,这种抑制作用增
强。在当归根际土壤水提液中鉴定到 17 个化合物, 包括有机酸、酮、醛、酯和烃类等化感物质,其中很多被报道是
化感物质。结论 当归根际土壤水提液对自身种子萌发和幼苗生长具有明显的自毒作用, 且自毒效应具有一定的
浓度依赖性,推断自毒作用可能是造成当归连作障碍的原因之一。
关键词:当归; 自毒作用; 根际土壤; 化感物质; 连作障碍
中图分类号: R286 1 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2010) 12 2063 04
Autotoxicity of water extracts from rhizosphere soil of cultivated Angelica sinensis
and identification of their allelopathic compounds
ZHANG Xinhui1, 2, 3 , LANG Duoyong 4 , ZHANG Enhe2
( 1 Co llege of Pharmacolog y, Ningx ia Medical Univer sity , Y inchuan 750004, China; 2. Co llege of Ag ronomy, Gansu
Ag ricultur al Univ ersit y, L anzhou 730070, China; 3. N ingxia Resear ch Center of M odern Hui Medicine
Eng ineering and Techno lo gy , Y inchuan 750004, China; 4. Medical Techno log y Resear ch Cent er,
Ningx ia Medical Univ er sity , Y inchuan 750004, China)
Abstract: Objective To explore the relat ionship betw een cont inuous cropping obstacle and autotox ici
ty of A ngel ica sinensi s, auto to xic effect and org anic compounds of r hizo sphere soil w ater ext ract w er e de
termined. Methods Distilled w ater ( CK) , w ater ext ract of rhizosphere soil ( 100, 125, 250, and 500 mg/
mL) w ere applied to test ing their ef fect on ear ly development of A . sinensi s. Seed germinat ion rate, g erm i
nat ion index , elongat ion of radicle and embryo w ere reco rded, and GCMS was conducted for the com
pound ident ificat ion in the ex t ract . Results T he w ater ex t ract at concentraion as low as 125 mg / mL sig
nificant ly inhibited the germination and seedling gr ow th o f A. sinensi s, and this inhibitory effect generally
increased w ith the increase of the concentrat ion o f w ater ex t racts. Seventeen compounds in rhizosphere soil
w ater ext ract w ere ident if ied, including org anic acids, ketones, aldehydes, esters, and hydrocar bons,
most of them ar e al lelophathic substance. Conclusion Water ex tr acts from A . sinensi s rhizosphere soil
have inhibitory effects on A . sinensis germinat ion and seedling g row th, and this inhibitory effect generally
increased w ith the incr eases of the w ater ex t ract concentr at ion at a certain ranges. In conclusion, there is
autotox icity in continuous cropping of A . sinensi s, which is one of the causes of problems associated w ith
the continuous cropping obstacle of a single plant species.
Key words: A ngel ica sinensi s ( Oliv. ) Diels; autotox icity; rhizosphere so il; allelopathic compound;
cont inuous cropping obstacle
当归为伞形科植物当归 A ngelica sinensis
( Oliv. ) Diels的干燥根, 是我国常用的大宗药材, 中
医素有 十药九归!之称。当归药材的成分复杂, 包
括挥发油、有机酸类、多糖等 [ 12] ,而这些成分都具有
良好的生理活性[ 34]。当归是一个典型的忌连作植
物,长期以来,当归栽培过程中出现了严重的连作障
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碍现象,表现为连作当归病虫害加重,生理性死苗现
象不断发生,给药农造成了很大的经济损失, 严重威
胁主产区当归生产的持续性发展。
自毒现象 ( auto to xicity) 是化感作用的重要形
式之一,它是指植物根分泌和残茬降解所释放出的
次生代谢物,对自身或种内其他植物产生危害的一
种现象,它是植物适应种内竞争的结果,许多作物的
连作障碍与此相关 [ 59]。李晶等[ 1011] 研究表明当归
根系分泌物及植株水提液有明显的自毒作用, 并认
为自毒作用是造成当归连作障碍的因素之一。但实
际上,土壤是植物产生化感作用的媒介,植物以根系
分泌物、地上部淋溶和残茬腐解等形式将化感物质
释放到土壤中, 化感物质在土壤中经过一系列的滞
留、转化、迁移等途径逐渐富集, 达到受体植物并维
持一定的浓度和持续的活性[ 1 213] ,才能产生化感现
象及连作障碍。因此, 本实验首先研究了当归根际
土提取液对当归种子发芽及幼苗生长的影响。然
后,采用 GCMS 分析鉴定了当归根际土水提液所
含的化合物,为探明自毒作用是当归连作障碍的原
因之一提供理论依据。
1 材料与方法
1 1 材料: 于 2006年 10月当归收获期, 在当归道
地产区甘肃岷县当归种植基地取样, 按 5 点取样法
选取当归植株, 先去掉 0~ 2 cm 的表土, 轻轻抖掉
根系外围土,再用毛刷轻刷黏附在根表面的土壤作
为根际土,过 40 目筛筛去根际土中残留的当归须
根等, 混匀备用。试验用当归种子购于岷县结布沟
农户,经岷县中药材生产技术指导站郭增祥站长鉴
定为伞形科植物紫当归 A ng el ica sinensis ( Oliv. )
Diels的种子。
1 2 自毒作用检测: 取新鲜的根际土壤 200 g , 按
1#2 的比例浸泡于烧杯中,充分振荡后静置过夜,
离心 ( 3 500 ∃ g, 25 % , 10 m in) , 取上清液滤过, 并
过 0 37 m 滤膜,得到相当于当归根际土 500 mg/
mL 的溶液 (浸提母液) , 编号为 S500。将 S500 分
别稀释 2、4、5 倍, 得到相当于当归根际土 250、125
和 100 mg/ mL 的溶液, 编号为 S250、S125、S100,
置于 4 % 冰箱中待用。用作当归自毒作用的生物
学研究。
以蒸馏水为对照 ( CK) , S500、S250、S125、S100
处理 3 次,每次随机选取 20 粒种子。种子用 0 1%
H2O2表面消毒 20 min, 用蒸馏水冲洗数次后随机铺
在垫有 2层滤纸的直径为 9 cm 的培养皿中,分别加
入水、不同浓度根际土水浸液各 5 mL,置 20 % 恒温
培养箱内培养 4 d 后开始观察计数,每 2 d 统计 1
次,共统计 9 次,第 20天测量胚根长和胚芽长。
1 3 发芽指标测定方法
发芽率= (发芽终期全部正常发芽的种子/供试种子
数) ∃ 100%
发芽指数 Gi = ( G t /D t ) 式中, G t为浸种后第 t 日的发
芽数; Dt为相应的发芽日数
胚根、胚芽长:将所有发芽种子的胚根、幼芽从种
子结合部切下后用直尺测定其长度,并计算平均值。
化感作用效应敏感数 ( RI ) 用 Williamson[ 14]
方法计算:
RI=
1- C/ T (T &C)
T / C- 1 (T < C)
式中, C 为对照值, T 为处理值, RI> 0 时表示促进作用, RI<
0 时表示抑制作用, RI 绝对值的大小代表化感作用强度
1 4 根际土水提液中化感物质鉴定:取当归根际土
样品适量,蒸馏水浸泡 24 h,其间多次振摇。离心
使当归根际土壤沉淀, 取上清液抽滤。滤液加入等
量醋酸乙酯萃取得到醋酸乙酯萃取液, 所得醋酸乙
酯萃取液浓缩至干,再用醋酸乙酯 1 mL 溶解, 用于
GCMS 分析。
GCMS 分析于兰州大学化工学院 GCMS 室
进行, 气质联用仪器为 T race GC 2000, 毛细管柱
cp5860、30 m ∃ 0. 25 mm。进样口温度 250 % , 柱温
50 % , 以 6 % / m in 程序升温至 250 % , 保持 15
m in。载气为 He, 体积流量 1 mL/ m in, 进样量为
1 L。GCMS 型号菲尼根 T race 2000, 电子轰击
源 70 eV,扫描范围为 m/ z 33~ 453, 0 4 s 扫全程,
离子源温度 200 % 。通过质谱分析和计算机标准
谱库检索,并采用峰面积归一化法确定各化合物的
质量分数。
1 5 数据分析:通过 DPS 7 05 软件,利用单因子
方差分析结合多重比较分析种子发芽率、发芽指数、
胚根长及胚芽长的差异。
2 结果与分析
2 1 自毒作用生物活性测定: 测定结果表明
(图 1) ,当归根际土壤水提液对其种子萌发和幼苗
生长表现出不同的抑制趋势。不同浓度根际土水提
液处理对受体当归发芽及生长的抑制作用具有浓度
梯度效应,随水提液浓度的提高,对种子萌发及幼苗
生长的抑制效应渐趋显著。在各浓度下各指标分别
有不同程度的降低: 发芽率降低 0% ~ 31 06%, 发
芽指数降低 16 96% ~ 57 69%, 胚根长度降低
22 14% ~ 46 19% , 胚 芽长度降低 13 05% ~
32 52% ,且均在浓度为 250 mg/ mL 时与对照达到
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同一指标不同字母表示处理间差异显著 ( P< 0 05)
Values w ith diff erent letters in sam e index are of sign ificant diff erence ( P< 0 05)
图 1 不同浓度当归根际土水提液对当归种子发芽率、胚根长及胚芽长的影响
Fig. 1 Inf luence of aqueous extracts from A. sinensis rhizosphere soil with different concentration
on germination rate, germination index, length of radicle and embryo
显著差异。发芽率、发芽指数、胚根长度和胚芽长度
对土壤浸提液的敏感程度不同, 整体表现为发芽指
数> 胚根长度> 胚芽长度> 发芽率。
2 2 根际土壤中化合物的 GCMS 鉴定:利用 GC
MS 分析, 从当归根际土壤中共鉴定出 17 个化合物
(图 2,表 1)。由表 1 可以看出, 当归根际土壤能被
醋酸乙酯提取的有机化合物种类丰富, 含有有机酸、
酮、醛、酯和烃类等物质。其中的丁酸、十一酸、肉豆
蔻酸、邻苯二甲酸二丁酯等均为被报道过的化感
物质[ 15] 。
图 2 当归根际土醋酸乙酯萃取 GCMS色谱图
Fig. 2 GCMS Chromatogram of ethyl acetate extraction
of rhizosphere soil of A. sinensis
表 1 当归根际土壤提取物 GCMS鉴别到的有机化合物
Table 1 Compounds in extract of rhizosphere soil
of A. sinensis identified by GCMS
t/ m in 化合物 分子式 质量分数/ %
2 09 丁酸 C4H 8O2 4 30
2 40 环己酮 C12H20O2 12 11
10 83 十一酸 C11H22O2 2 83
10 98 癸酸乙酯 C11H24O2 0 62
11 57 3, 4二甲基苯乙酮 C10H12O 0 43
12 28 十四烷 C14H30 1 74
12 49 2甲基3, 5十二炔 C13H20 1 49
13 00 肉豆蔻酸 C14H28O2 6 28
13 17 十五酸甲酯 C16H32O2 5 73
14 69 邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4 5 68
14 95 十六酸 C16H32O2 3 94
15 14 十五酸乙酯 C17H34O4 3 71
16 55 2十三(碳)烯醛 C13H24O 2 55
16 77 环戊基十一酸 C16H30O2 2 65
16 95 2, 6二甲基十七烷 C19H40 0 87
19 60 二十烷 C20H42 5 20
23 10 辛酸 2已基己酯 C16H32O2 2 96
3 讨论
3 1 当归根际土壤中化感物质分析:根际是受植物
根系活动影响,在物理、化学和生物学特性上不同于
原土体的特殊土壤微区, 是植物土壤微生物及其
环境条件相互作用的场所和特殊的微生态系统, 同
时也是各种养分、水分和有益、有害物质进入根系参
与生物链物质循环的门户 [ 15]。根际土壤有机化合
物的来源途径很多,如根系的分泌物、微生物的分泌
物、植物地上部的淋洗、挥发物、植物残体的腐解产
物等。前人对植物根系分泌物的研究报道较多, 而
对根际土壤化学成分的研究报道较少,但实际上,土
壤是植物产生化感作用的媒介, 植物以根系分泌物、
地上部淋溶和残茬腐解等形式将化感物质释放到土
壤中,化感物质在土壤中经过一系列的滞留、转化、
迁移等途径逐渐富集, 达到受体植物并维持一定的
浓度和持续的活性,从而产生化感现象及连作障碍。
考虑到当归栽培中面临的主要问题是连作障碍, 因
此,本研究以当归根际土壤为研究材料,进行了化感
物质的提取鉴别。本实验从当归根际土中共鉴定出
17 个化合物,包括烷、酸、酮、醛及酯等成分,尚包括
量低而未被鉴定出的化合物。迄今为止所发现的化
感物质几乎都是植物的次生代谢产物, 一般相对分
子质量较小,结构较简单, 包括水溶性有机酸、直链
醇、脂肪族醛和酮、简单不饱和内酯、长链脂肪酸和
多炔、内萜、氨基酸、生物碱、苯甲酸及其衍生物等
等。其中最常见的是低分子有机酸、酚类和内萜类
化合物[ 17] 。本实验所分离鉴定到的化合物中不乏
此类物质,证明当归根际土壤中含有抑制其自身生
长的化感物质,即植物自毒素。
3 2 当归根际土壤作用的生物学检测:测定种子萌
发和幼苗生长是研究化感作用的常规手段,种子萌
发影响出苗率和种群数量,幼苗生长则直接影响到
物种的生长状况、产量和品质。本实验中发现, 125
mg/ mL 当归根际土壤水提液能显著抑制当归自身
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种子发芽率、发芽指数及胚根和胚芽的伸长, 且随水
提液浓度的升高,这种抑制作用增强,表明当归根际
土壤水提液对自身种子萌发的抑制作用存在浓度效
应,这与以前在苜蓿 [ 18]、大豆[ 19] 和黄瓜 [ 20]等作物上
的研究结果一致。另外还发现, 所测定的各项指标
对同一浓度水提液的敏感程度也有差异, 在种子萌
发阶段,萌发指数的敏感性最强,表明种子萌发速度
受到较大影响, 从而延迟种子的发芽时间,影响出苗
整齐度;在幼苗生长阶段, 根长受到严重抑制, 且在
大于 250 mg/ mL 时根部明显褐化变软,甚至腐烂。
因此推断,连作当归根部易腐烂、病虫害严重和产量
品质下降很可能是自毒物质在土壤中积累的结果。
3 3 当归种植的自毒现象与解决策略:在中药栽培
过程中,各类药材所含的次生代谢产物丰富, 自毒物
质很容易积累而造成土壤环境恶化[ 78, 21]。因此, 自
毒作用很可能是引起中草药连作障碍的主要原因。
赵杨景等[ 9] 研究表明,西洋参存在明显的自毒作用,
且自毒作用是引起西洋参连作障碍的主要原因之
一;因此, 可以推断栽培当归连作障碍可能与自毒作
用有关,但因生产实践中当归的种植是育苗后移栽,
所以进一步的移栽苗生长试验有待于进行。
植物在生长发育过程中不断与根际土溶液进行
着物质与能量的交换, 通过各种途径(如地上部淋
溶、根系分泌、植物残体分解等) 进入根际区的植物
自身的化学物质,直接影响着根际区土壤中微生物
的群落结构,微生物分解代谢又会产生新的化学物
质,如此不断地影响和改变着根际区微生态环境, 反
过来又对植物自身的生长发育产生影响。在这个意
义上讲,自毒作用是植物长期适应种内竞争的重要
策略,在群体水平上实现了优胜劣汰,对物种的进化
具有积极的作用。但就栽培中药材而言, 植物自毒
造成的经济损失是显而易见的。所以在中药栽培
中,可以借鉴农业生产的方法,如采用间作制度、避
免连作等手段来缓解甚至是克服中药的自毒现象。
同时,应注意对不产生化感物质或具有抗化感作用
的品种进行筛选,最终通过遗传育种或转基因工程
的手段和方法, 彻底解决栽培中的自毒现象。
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