全 文 ：不同生长期紫花苜蓿中苜蓿素的测定
王淑惠1 ,李兰芳2 3 ,张勤增3 ,刘智鹏4 ,徐兴俊5 3 3
(11 石家庄市疾病预防控制中心 ,河北 石家庄 　050011 ; 21 河北省医学科学院 ,河北 石家庄 　050021 ;
31 黄骅市骨科医院 ,河北 黄骅 　061100)
摘 　要 :目的 　测定紫花苜蓿在不同生长期苜蓿素的量 ,为合理利用资源提供实验依据。方法 　采用 HPLC 法 ,色
谱柱为 Zorbax SB C18 (250 mm ×416 mm ,5μm) ,以甲醇2水 (65 ∶35)为流动相 ,体积流量为 018 mL/ min ,检测波长
为 349 nm ,进样量为 5μL 。结果 　在紫花苜蓿不同生长期苜蓿素的量不同 ,8 月份量最高。结论 　苜蓿在不同生
长期苜蓿素的量不同 ,如果主要利用紫花苜蓿中的苜蓿素时应在 8 月中旬采收。
关键词 :不同生长期 ;紫花苜蓿 ;苜蓿素 ; HPLC
中图分类号 :R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0220311203
　　紫花苜蓿 Medicago sati v a L1 为多年生宿根草
本植物 ,本属约有 70 余种 ,分布于地中海区域、西南
亚、中亚和非洲。紫花苜蓿在我国种植已有2 000多
年的历史 ,主要在畜牧业作为饲料应用。民间作为
传统的草药用于治疗细菌性痢疾、肺热咳嗽、黄疸、
膀胱结石等症[1 ] 。国内外学者报道苜蓿皂苷具有防
治高脂血症和动脉粥样硬化作用[2～4 ] 。苜蓿中的黄
酮类成分苜蓿素具有抗氧化[5 ] 、松弛平滑肌、抗肿
瘤[6 ]和植物生长调节作用。本研究考察不同生长期
紫花苜蓿中苜蓿素的变化 ,为苜蓿的深加工和合理
利用这一受到广泛关注的资源提供理论依据。
1 　仪器与试药
Agilent 1100 高效液相色谱系统 ,包括二极管
阵列检测器 (DAD) ,四元低压梯度泵 ,真空脱气机 ,
柱温箱 ,自动进样器。KQ —250 DB 型数控超声波
仪 (昆山市超声仪器有限公司) , Met tler A E240 电
子天平[梅特勒2托利多仪器 (上海) 有限公司 ]。甲
醇为色谱纯 ,水为 2 次蒸馏水。其他试剂均为分
析纯。
苜蓿素对照品由本室自制 ,经熔点、光谱、核磁
共振、质谱鉴定结构 ,质量分数为 9911 %。苜蓿采
自河北沧州黄骅 ,经河北省药品检验所孙惠葆主任
药师鉴定为紫花苜蓿 M1 sati v a L1 的全草。
2 　方法与结果
211 　色谱条件与适应性试验 :色谱柱为 Agilent
Zorbax SB C18 (250 mm ×415 mm ,5μm) ;流动相为
甲醇2水 (65 ∶35) ;体积流量为 018 mL/ min ;波长为
349 nm ;检测温度 :室温 ;理论塔板数按苜蓿素计不
低于3 000 ;分离度 > 115。色谱图见图 1。
t/ min3 2苜蓿素3 2t ricin
图 1 　苜蓿素对照品( A)和苜蓿( B)的 HPLC图
Fig. 1 　HPLC Chromatograms of tricin reference
substance ( A) and M. sativa sample ( B)
212 　对照品溶液的制备 :精密称取苜蓿素对照品
110 mg ,加甲醇制成质量浓度为 015 mg/ mL 的溶
液 ,摇匀 ,即得。
213 　供试品溶液的制备[ 7 ] :取干燥后紫花苜蓿全草
粉末 (20 目) 约 1 g ,精密称定 ,加入 70 %乙醇 20
mL ,浸泡过夜 ,超声处理 20 min ,滤过 ,保留提取
液 ,残渣再加 70 %乙醇 20 mL ,超声 20 min ,滤过 ,
共超声提取 3 次 ,合并 3 次提取液 ,回收乙醇 ,浓缩
至干。残渣加 10 mL 蒸馏水溶解 ,用醋酸乙酯萃取
3 次 (15、15、10 mL) ,合并萃取液 ,水浴蒸干 ,残渣用
甲醇溶解并定容至 2 mL ,作为供试品溶液。
214 　标准曲线与线性关系考察 :精密吸取苜蓿素对
照品溶液适量 ,分别制成 5、10、20、40、60、100μg/
mL 的对照品工作溶液 ,精密吸取 5μL ,注入液相色
谱仪。质量浓度为横坐标 ,峰面积积分值为纵坐标 ,
·113·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008205213
基金项目 :河北省科技攻关计划课题 (04276101D251)
作者简介 :王淑惠 (1966 —) ,女 ,河北满城人 ,副主任检验技师 ,研究方向为药物分析研究。　E2mail :shuhuiwang8888 @1631com3 通讯作者　李兰芳　Tel : (0311) 86573415 　E2mail :yaoyanllf @1631com
绘制标准曲线 , 得回归方程 Y = 61 999 6 X —
81103 7 ( r = 01999 9) 。结果表明在 01025～015μg
苜蓿素质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。
215 　精密度试验 :精密吸取苜蓿素对照品溶液 (20
μg/ mL)进样量为 5μL ,连续进样 5 次 ,测定其峰面
积 ,结果峰面积 RSD 为 0168 %。
216 　重现性试验 :取同一份紫花苜蓿样品 ,精密称
取 5 份 ,按供试品溶液制备方法平行操作。结果苜
蓿素质量分数的 RSD 为 1179 % ,说明方法重现性
较好。
217 　稳定性试验 :同一批苜蓿供试品溶液 ,分别在
制备后 0、2、4、6、8 h 检测。结果以苜蓿素峰面积
计 ,RSD 为 1166 %。
218 　回收率试验 :采用加样回收法。精密称定已知
苜蓿素量的同一批样品 6 份 ,分别加入苜蓿素对照
品溶液 (01500 4 mg/ mL) 01090、01120、01160 mL ,
按供试品溶液的制备方法制备。测定 ,结果苜蓿素
的平均回收率为 96181 % ,RSD 为 3195 %。
219 　样品测定 :分别精密吸取对照品溶液和样品溶
液各 5μL 注入液相色谱仪 ,测定 ,计算。河北沧州
黄骅不同生长期的紫花苜蓿样品测定结果见表 1。
表 1 　不同生长期的紫花苜蓿中苜蓿素的测定结果( n = 2)
Table 1 　Determination of tricin in M1 sativa
in different growth periods ( n = 2)
采收日期 苜蓿素/ (mg ·g - 1)
2006206215 01174 0
2006207201 01242 6
2006207215 01256 6
2006208201 01291 7
2006208215 01319 8
2006209201 01173 1
2006209215 01129 7
3 　讨论
经对河北黄骅栽种紫花苜蓿一年不同生长期中
苜蓿素的量考察 ,结果表明 ,从 6 月份后随着紫花苜
蓿的生长过程苜蓿素量有逐渐增加的趋势 ,到 8 月
中旬量最高 ,9 月份量下降。为利用紫花苜蓿中苜
蓿素的开发项目提供了合理利用资源的实验依据。
311 　样品的前处理参照文献方法[ 7 ] 采用了正交试
验设计 ,筛选乙醇体积分数、超声时间、溶剂用量、提
取次数等影响因素 ,以苜蓿素量为考察指标进行考
察。结果表明 ,用 20 倍量的 70 %乙醇 ,提取 3 次 ,
每次超声处理 20 min 为最佳提取条件。
312 　本试验比较了 70 %乙醇、70 %甲醇为提取溶
剂时的提取效率。以上 2 种溶剂在相同条件下分别
测定样品中苜蓿素的量 ,结果表明两种溶剂提取率
相近 ,因为甲醇毒性大 ,所以选择 70 %乙醇为本试
验的提取溶剂。
313 　在样品进样量选择上 ,试验开始时分别选择
215、5、10、15μL 对照品进行试验 ,结果上述 4 种条
件均出现不同程度的拖尾现象 ,其中 10、15μL 的进
样量拖尾现象较为严重 ,215μL 的进样量过少 ,受
偶然因素影响较多 ,因此选择进样量为 5μL 为最佳
进样量。
参考文献 :
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保 　护 　环 　境 　　保 　护 　植 　被
·213· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月