全 文 ：野西瓜总生物碱诱导 HepG2 细胞凋亡与[ Ca2 + ] i变化的相关性
于 　蕾1 ,2 ,3 ,莫 　科2 ,3 ,王 　崴2 ,3 ,崔荣田2 ,3 ,邹 　翔1 ,2 ,3 ,季宇彬1 ,2 ,3 3
(11 北京中医药大学中药学院 ,北京 　100102 ; 21 哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心 ,
黑龙江 哈尔滨 　150076 ; 31 抗肿瘤天然药物教育部工程研究中心 ,黑龙江 哈尔滨 　150076)
摘 　要 :目的 　探讨野西瓜总生物碱 ( Ca p paris s pinosa alkaloid , CSA) 对人肝癌 Hep G2 细胞的杀伤和诱导凋亡
的作用机制。方法 　M TT 法研究 CSA 对人肝癌 Hep G2 的杀伤作用 ;荧光显微镜观察 Hep G2 细胞形态 ;流式细
胞仪研究 CSA 对 Hep G2 细胞的凋亡诱导作用 ;激光共聚焦显微镜检测 CSA 对 Hep G2 细胞内 [ Ca2 + ] i的影响。
结果 　CSA 对人肝癌 Hep G2 有明显细胞毒性作用 ,并且有剂量依赖性 , IC50 为 142182μg/ mL ; Hep G2 细胞在
CSA 作用后出现特征性凋亡形态特征 ,凋亡细胞比率明显高于自然凋亡率 ;且阻断细胞由 S 期向 G2 期的移行 ,
CSA 明显升高 Hep G2 细胞[ Ca2 + ] i ,并与药物质量浓度呈量效正相关。结论 　CSA 对人肝癌 Hep G2 有明显的杀
伤和促凋亡作用 ,其机制可能与 CSA 造成肿瘤细胞内钙离子超载有关。
关键词 :野西瓜总生物碱 ; 人肝癌 Hep G2 细胞 ; 细胞凋亡 ; 钙超载
中图分类号 :R286191 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0220255204
Relationship between apoptosis and [ Ca2 + ] i in HepG2 induced by Ca p pa ris s pinosa alkaloid
YU Lei1 ,2 ,3 , MO Ke2 ,3 , WAN G Wei2 ,3 , CU I Rong2tian2 ,3 , ZOU Xiang1 ,2 ,3 , J I Yu2bin1 ,2 ,3
(11 School of Chinese Materia Medica , Beijing University of Traditional Chinese Medicine , Beijing 100102 , China ;
2. Research Center of Life and Environment Science , Harbin University of Commerce , Harbin 150076 , China ;
3. Engineering Research Center of Natural Anti2cancer Drugs , Minist ry of Education , Harbin 150076 , China)
Abstract : Objective 　To st udy t he mechanism of killing and apoptosis2inducing effect s of Ca p p aris
s pi nosa alkaloid (CSA) on human hepatocarcinoma cell line Hep G2. Methods 　The killing effect of CSA
on human hepatocarcinoma cell line Hep G2 was st udied by M T T met hod. Morp hological observation of
Hep G2 cells was carried out by fluorescence microscope. Results 　The CSA had obvious cytotoxicity on
t he Hep G2 in a dose2dependent manner and it s IC50 value was 142. 82μg/ mL . The Hep G2 cells showed t he
characteristic morp hologic changes of apoptosis by t he f unction of CSA and the apoptosis percentage is
higher t han t hat of the nat ural one. The progress of cells cycle f rom S p hase to G2 p hase had been blocked
by CSA. The int racellular Ca2 + level had been increased by the f unction of CSA , which was positively
related wit h drug concent ration. Conclusion 　CSA has obviously killing and apoptosis2inducing effect s on
human hepatocarcinoma cell line Hep G2 and calcium overload might also be invovled in t hese event s.
Key words : Ca p p aris s pi nosa L . alkaloid ( CSA) ; human hepatocarcinoma cell line Hep G2 ; apopto2
sis ; calcium overload
　　野西瓜 Ca p p aris s pi nosa L . 为白花菜科山柑
属植物 ,味辛苦 ,性温 ,具有祛风除湿、止瘀消肿、止
痛活血之功效[1 ] 。据文献报道 ,野西瓜具有抗炎、抗
高血压、降血糖、治疗痛风、化痰、驱虫、利尿、通便等
功效[2 ] 。研究表明野西瓜多糖可诱导人肝癌
Hep G2 细胞凋亡[3 ] 。本课题组的前期研究成果和
文献报道均显示野西瓜中含有生物碱类成分[4 ,5 ] ,
研究证明较多种类的生物碱有抗癌功效 ,并且已有
报道 ,与野西瓜同科属的台湾山柑中含有一种生物
碱 ,对 6 种人肿瘤细胞系表现出广泛而显著的抗肿
瘤活性[ 5 ] 。而且 ,还发现野西瓜乙醇提取物的氯仿
萃取部位对人肝癌细胞 Hep G2 具有较好的抗肿瘤
活性 ,所以本实验以人肝癌细胞 Hep G2 为研究对
象 ,对野西瓜总生物碱抑制 Hep G2 细胞增殖的分
子机制进行深入研究。
1 　材料
111 　肿瘤细胞株 :人肝癌细胞株 Hep G2 由哈尔滨
商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所
·552·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008208210
基金项目 :黑龙江省自然科学基金资助项目 (C200610)
作者简介 :于　蕾 (1979 —) ,女 ,黑龙江省巴彦人 ,助理研究员 ,博士研究生 ,研究方向为抗肿瘤药物研究。
Tel : (0451) 84866922 　13936277007 　E2mail : yulei @hrbcu. edu. cn3 通讯作者　季宇彬
细胞培养室传代保种 ,于含 10 % 小牛血清的 RPMI
1640 培养基 ,置于 37 ℃、5 % CO2培养箱培养。
112 　药物及试剂 :野西瓜果实购于新疆西瓜开发
部 ;野西瓜总生物碱 ( Ca p p aris s pi nosa alkaloid ,
CSA ,质量分数 66108 %) 由哈尔滨商业大学药物
研究所提供 ; M T T 购自 Sigma 公司 ;硫化罗丹明
(SRB) 购自 Sigma 公司 ;碘化吡啶 ( PI) 购自 Sig2
ma 公司 ;二甲基亚砜 (DMSO) 购自北京化工厂 ;
RPMI 1640 培养基及胰酶购自 Gibco 公司 ;胎牛血
清 ( FCS) 购自 Hyclone 公司 ; Hochest 33258 购自
北京化学试剂公司 ; Fluo23/ AM 购自 Molecular
p robe 公司 ;罗丹明 123 ( Rhodamine 123) 购自北
京碧云天公司 ; 2′, 7′2二氯氢化荧光素二脂
(DCF H2DA) 购自北京碧云天公司。
113 　仪器 : WELL SCAN M K 3 型酶标仪 (美国
Bio2Rad 公司) ;荧光显微镜 (德国 Leica 公司) ;
CLOU TER EPICS2XL 流式细胞仪 (美国 Beck2
man2Coulter 公司) ;激光共聚焦显微镜 (德国 Leica
公司) 。
2 　方法
211 　M T T 比色法测定 CSA 对 Hep G2 细胞的细
胞毒性作用 :将对数生长期的细胞配制成浓度为
2 ×105个/ mL 的细胞悬液 ,每孔加 100μL 。24 h 加
入含不同质量浓度 (10、50、100、150、200、300μg/
mL) CSA 及相应溶剂对照的新鲜培养基 ,每孔加
100μL (DMSO 终体积分数 < 015 %) ,另设空白对
照、阳性对照组 (阿霉素 ,0101、011、1、10μg/ mL ) ,
每组设 6 个平行孔 ,给药后于 37 ℃继续培养 72 h
后 ,弃上清 ,每孔加 100μL 新鲜配制的含 015 mg/
mL M T T 的无血清培养基 ,继续培养 4 h ,弃上清
液 ,每孔加 200μL DMSO 溶解 ,用微型振荡器振荡
混匀 ,用 M K3 型酶标仪在参考波长 490 nm ,检测
波长 570 nm 条件下测定吸光度 ( A ) 值 ,以溶剂对
照处理的肿瘤细胞为对照组 ,用下列公式计算药物
对肿瘤细胞的抑制率 ,并按中效方程计算 IC50 。
抑制率 = 对照组平均 A 值 - 给药组平均 A 值对照组平均 A 值 ×100 %
212 　荧光显微镜观察 Hep G2 细胞形态 :取指数生
长期的人肝癌细胞 Hep G2 ,加入适量 0125 % 胰蛋
白酶液消化细胞 ,使贴壁细胞脱落。用含 10 % 胎
牛血清的培养基制备成浓度为 3 ×105 / mL 的细胞
悬液 ,于 6 孔板中每孔接种 1 mL 。将平板置于
37 ℃、5 % CO2培养箱。24 h 后加入不同质量浓度
(75、150、300μg/ mL) 的 CSA ;阳性对照组加阿霉
素 ,其终质量浓度为 5μg/ mL ;对照组加相同体积
的培养液。48 h 后细胞用胰酶消化 ,加 PBS 洗 1
遍 ,加入固定液[甲醇2冰醋酸 (3 ∶1) ] ,置 4 ℃冰箱
固定 10 min 后 ,加入 5 mg/ L 的荧光探针 Hoechst
33258 ,置于 37 ℃、5 % CO2 培养箱中孵育 15 min ,
将孔中的盖玻片取出 ,盖在已滴好甘油的载玻片上 ,
置于荧光倒置显微镜上观察细胞形态并拍照。
213 　流式细胞仪 ( FCM) 测定 Hep G2 细胞凋亡
率 :取指数生长期人肝癌细胞 Hep G2 ,胰酶消化后
制备成浓度为 3 ×105 / mL 的细胞悬液 ,于 6 孔板中
每孔接种 1 mL 。将平板置于 37 ℃、5 % CO2 培养
箱。24 h 后加入不同质量浓度 (75、150、300μg/
mL) 的 CSA ,阳性对照组加阿霉素 ,其终质量浓度
为 5μg/ mL ;对照组加相同体积的培养液 ,每组设 3
个复孔。72 h 后细胞用胰酶消化 ,离心收集细胞 ,
细胞沉淀用 70 % 乙醇悬浮 ,在 4 ℃冰箱固定 12 h
以上。固定后的细胞用 PBS 洗两遍并悬浮 ,加入
PI 染液 (终质量浓度为 50μg/ mL) ,37 ℃避光温
育 30 min ,300 目尼龙网滤过 ,流式细胞仪上计数
10 000 个细胞 ,测定细胞各期 DNA 水平 ,分析细胞
周期分布 (激发波长 488 nm ,发射波长 630 nm) 。
214 　激光共聚焦检测 Hep G2 细胞[ Ca2 + ]i :将 6 孔
培养板内放上盖玻片 ,取对数生长期细胞接种于 6
孔培养板中 ,细胞浓度为 2 ×105 / mL ,置于 37 ℃、
5 % CO2培养箱中 ,24 h 后加入不同质量浓度 (75、
150、300μg/ mL) 的 CSA ;阳性对照组加阿霉素 ,其
终质量浓度为 215μg/ mL ;对照组加相同体积的培
养液 ;药物作用 24 h 后吸出培养皿中的培养液 ,加
胰酶消化 ,用无钙台氏液洗 1 遍 ;加入 4μg/ mL 的
Fluo23/ AM 荧光探针 200μL ,37 ℃避光温育 30
min ;将孔中的盖玻片取出 ,盖在载玻片上 ,避光 ,激
光共聚焦显微镜扫描观察。激发波长 488 nm ,发射
波长 540～570 nm。
215 　统计学处理 :所有数据用 SPSS 1115 统计软
件进行单因素方差分析 ,数据用 x ±s 表示。
3 　结果
311 　对 Hep G2 细胞的细胞毒性作用 : CSA 对
Hep G2 细胞有明显的细胞毒性作用 ,药物的质量浓
度2抑制率曲线呈 S 形 ,符合 Logistic 曲线 ,见图 1。
根据抑制率采用综合法计算 IC50 , M T T 结果显示
CSA 作用 72 h 对 Hep G2 细胞的 IC50值为 142182
μg/ mL ,阿霉素的 IC50值为 01196μg/ mL 。
312 　对 Hep G2 细胞凋亡形态的影响 :荧光显微镜
观察 CSA (75、150、300μg/ mL) 作用 48 h 后肿瘤
·652· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
细胞形态变化 ,从图 1 可见凋亡细胞特征性形态明
显 ,细胞核固缩 ,染色体 DNA 广泛裂解断裂 ,并聚
集成细小的凝聚块 ,核膜皱缩 ,崩解后包裹染色体片
段弥散于细胞浆 ,可见凋亡小体。
图 1 　Hoechst 33258 荧光染色法测定 CSA 对 HepG2 诱导细胞凋亡作用
Fig. 1 　Apoptosis of CSA on HepG2 by Hoechst 33258 fluorescence staining
313 　对 Hep G2 细胞凋亡率及细胞周期的影响 :流
式细胞仪测定 CSA 处理细胞 72 h 后 ,所有标本均
显示“亚 G1 期”峰 ,提示细胞出现了凋亡 ,凋亡细胞
比例明显高于自然凋亡率 ,阳性对照组 (阿霉素 5
μg/ mL) ,由于作用时间长 ,细胞均呈碎片 ,见表 1。
CSA 各个剂量组均出现了 G0 / G1 期细胞比例显著
下降 , S 期细胞比例显著升高的趋势 ,在中剂量
(150μg/ mL) 组 , G2 期细胞比例显著下降 ,并出现
典型的凋亡峰。部分结果见图 2 和 3。
表 1 　CSA 作用 72 h 后对 HepG2 细胞周期分布
及凋亡的影响 ( x ±s , n = 3)
Table 1 　Effect of CSA on cell cycle distribution and apoptosis
of HepG2 cells for 72 h ( x ±s , n = 3)
组　别
ρ/
(μg·mL - 1 )
细胞周期分布/ %
G0 / G1 S G2 / M
凋亡率/ %
对照 - 641507 ±01458 271540 ±01090 71953 ±01521 　　-
CSA 75 551870 ±11913 3 3 341475 ±11415 3 3 101089 ±01013 17198 ±0101 3 3
150 421169 ±01305 3 3 551154 ±31066 3 3 21671 ±21770 3 3 37139 ±1109 3 3
300 541109 ±01054 3 3 351900 ±01050 3 3 101089 ±01013 25169 ±0130 3 3
阿霉素 　5 　　　0 　　　0 　　　0 100100 ±0116 3 3
　　与对照组比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101 　表 2 同
　　3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs cont rol group ; Table 2 is same
314 　对 Hep G2 细胞 [ Ca2 + ]i 的影响 : CSA 作用
24 h 后 , Hep G2 细胞内 [ Ca2 + ]i 升高 ,CSA 在 150、
300μg/ mL 质量浓度下可非常显著地升高 Hep G2
细胞[ Ca2 + ]i ( P < 0101) ,并且随着 CSA 剂量的增
加 ,[ Ca2 + ]i增幅也相应地增大 ,二者具有显著正相
关性 ( r = 01998 2) 。结果见表 2。
4 　讨论
·752·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
表 2 　CSA 作用 24 h 后对 HepG2 细胞[ Ca2 + ] i的影响
( x ±s , n = 3)
Table 2 　Effect of CSA on variation of [ Ca2 + ] i
of HepG2 cells for 24 h ( x ±s , n = 3)
组　别 ρ/ (μg ·mL - 1) [ Ca2 + ] i (荧光强度)
对照 - 151 758 ±21339
阿霉素 　　　215 1481 012 ±281 344 3 3
CSA 75 301 358 ±21987
150 481 232 ±21826 3 3
300 761 574 ±71543 3 3
　　形态学观察是检测细胞凋亡最可靠的方法[6 ] ,
本实验采用 Hoechst 33258 荧光染色方法观察了被
不同质量浓度 CSA 作用 48 h 后的肿瘤细胞形态上
的变化。从结果可知随着药物质量浓度的加大 ,镜
下凋亡细胞比例逐渐增加 ,凋亡细胞特征性形态明
显 ,染色体 DNA 断裂并聚集成细小的凝聚块 ,并可
见到凋亡小体 ,说明细胞在药物作用下产生凋亡。
流式细胞仪检测结果表明 CSA 处理 Hep G2
细胞 72 h 后 ,所有标本均出现“亚 G1 期”峰 ,提示细
胞出现了凋亡 ,凋亡细胞比率明显高于自然凋亡率。
本实验还研究了不同质量浓度 CSA 作用于 Hep G2
细胞 72 h 对其细胞周期的影响。实验结果发现 ,各
个剂量组均出现了 G0 / G1 期细胞比例显著下降 , S
期细胞比例显著升高的趋势 ,在中剂量 (150μg/
mL) 组 ,出现了 G2 期显著下降的现象 ,提示 ,CSA
能够阻断细胞由 S 期向 G2期的移行 ,导致细胞在 S
期大量堆积 ,从而减少进入 G2 / M 期的细胞数目 ,
减少其有丝分裂和进入下一个细胞增殖周期 ,并最
终导致肿瘤细胞快速凋亡。
　　Ca2 + 与细胞凋亡的关系极其密切 ,细胞钙信号
是与细胞凋亡关系比较密切的信号分子[7 ] 。肿瘤细
胞内 Ca2 + 浓度的持续性升高 ,会通过不同途径诱导
凋亡。本实验发现 CSA 在 150、300μg/ mL 可非常
显著地升高 Hep G2 细胞 [ Ca2 + ]i ( P < 0101) ,并且
随着药物剂量的增加 ,细胞[ Ca2 + ]i增幅也相应地增
大 ,二者具有显著正相关性 ( r = 0. 998 2) ,说明细胞
[ Ca2 + ]i与药物质量浓度呈量效正相关。结果提示 ,
CSA 能够引起线粒体内 Ca2 + 缓慢积累导致线粒体
Ca2 + 超载 ,能启动高导性 P T 孔开放 ,线粒体膜电位
下降 ,线粒体膨胀 ,外膜破裂 ,诱导凋亡。
CSA 能够引起 Hep G2 细胞凋亡 ,并能够阻断
细胞由 S 期向 G2期的移行 ,导致细胞内钙超载是其
引起细胞凋亡的机制之一 ,进一步的机制还有待于
深入研究。
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物理学报 , 2005 , 1 : 11221141
海马不同提取物对雌二醇致肾阳虚小鼠的影响
陈素红1 ,吕圭源2 3 范 　景2 ,颜美秋2 ,叶 　合2 ,方 　哲2 ,汤小华1 ,吴海峰1
(11 温州医学院 ,浙江 温州 　325035 ; 21 浙江中医药大学 ,浙江 杭州 　310053)
摘 　要 :目的 　观察海马 4 个提取物 (水、正丁醇、醋酸乙酯、石油醚提取物)对雌二醇致肾阳虚模型小鼠的影响 ,认
识其“甘 ,温 ,入肝、肾经”药性的现代科学内涵。方法 　采用 ip 苯甲酸雌二醇造成小鼠肾阳虚模型 ,对小鼠体征、
肛温、抓力、游泳时间、自主活动、血清肌酐 (Cr) 及尿素 ( UR) 、血液学指标、睾丸和精囊腺指数进行测定。结果
海马 4 个提取物均能改善肾阳虚小鼠体征 ,升高精囊腺指数和血液 RBC、Hb、PL T ,降低血清 U R 水平 ;海马水提
取物、石油醚提取物均能提高肾阳虚小鼠肛温、抓力、游泳时间、自主活动次数、睾丸指数、WBC、淋巴细胞 (L Y) 、单
核细胞 (MO) 、嗜中性粒细胞 (N E) ;正丁醇提取物能提高小鼠自主活动次数、N E ;醋酸乙酯提取物能提高小鼠抓
力、游泳时间。结论 　海马的药效可作为改善肾阳虚证之腰膝酸软、性欲减退、畏寒肢冷、精神萎靡、阳虚水泛 ,以
·852· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008205211
基金项目 :国家重点基础研究发展计划 (973 计划) ,资助项目 (2007CB512603)
作者简介 :陈素红 (1973 —) ,女 ,副教授 ,博士 ,硕士生导师 ,主要从事中药药理及产品开发。3 通讯作者　吕圭源　Tel : (0571) 86613601 　E2mail : lv. gy @263. net