全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 10 期 2013 年 5 月

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• 药理与临床 •
蓬子菜黄酮类化合物对人肝癌 HepG2 细胞增殖及凋亡的机制研究
李海霞 1，马英丽 2，史灵恩 1，董 晶 1，马 玲 1*
1. 哈尔滨医科大学公共卫生学院，黑龙江 哈尔滨 150081
2. 黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040
摘 要：目的 探讨蓬子菜黄酮类化合物香叶木素-7-O-β-D-木糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷（DXG）对人肝癌细胞株 HepG2 增殖
的抑制作用及其诱导 HepG2 细胞凋亡的机制。方法 台盼蓝染色法检测 DXG 对 HepG2 细胞生长的影响；MTT 法检测 DXG
对细胞增殖的抑制作用；吖啶橙/溴乙（AO-EB）荧光染色法观察 DXG 对 HepG2 细胞凋亡的形态学影响；琼脂糖凝胶电泳
观察凋亡细胞的 DNA 图谱变化；反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测凋亡相关基因 bcl-2 及 bax 的表达。结果 台盼蓝
染色和 MTT 检测显示，DXG 50、100、200 μg/mL 能明显抑制 HepG2 细胞增殖，与对照组相比差异显著（P＜0.05）。AO-EB
染色可见 DXG 诱导 HepG2 细胞凋亡并发生形态学改变，且随 DXG 的质量浓度升高，凋亡细胞的比例显著增加。琼脂糖凝
胶电泳显示，HepG2 细胞经 DXG 100、200 μg/mL 处理 48 h 后，可见 DNA“梯形”碎片条带。RT-PCR 实验表明，DXG 下
调细胞凋亡的抑制基因 bcl-2 mRNA 表达，促使凋亡基因 bax mRNA 表达增强。结论 DXG 具有显著抑制人肝癌细胞 HepG2
增殖、诱导其凋亡的作用，其作用机制与调控 bax/bcl-2 的表达有关。
关键词：蓬子菜；香叶木素-7-O-β-D-木糖-(1→6)-β-D-葡萄糖苷；人肝癌 HepG2 细胞；细胞凋亡；细胞增殖；bcl-2；bax
中图分类号：R282.710.5；R979.19 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)10 - 1290 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.10.016
Mechanism of flavonoids from Galium verum on cell proliferation
and apoptosis of HepG2
LI Hai-xia1, MA Ying-li2, SHI Ling-en1, DONG Jing1, MA Ling1
1. College of Public Health, Harbin Medical University, Harbin 150081, China
2. College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China
Abstract: Objective To investigate the inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis of flavonoids [diosmetin-7-O-β-D-
xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside, DXG)] from Gallium verum on liver cancer cell HepG2 and to study its mechanisms.
Methods Cell growth was detected with Trypan blue staining. The proliferation inhibition rates of DXG on HepG2 were measured by
MTT assay. The morphology changes of apoptotic cell were obserbed by AO-EB double staining. Agarose gel electrophoresis was
used to detect the DNA fragmentation. The expression of apoptosis-related genes bax and bcl-2 was examined by RT-PCR. Results
DXG (50, 100, and 200 μg/mL) could significantly inhibit the proliferation of HepG2 cells by Trypan blue staining and MTT assay
compared with the control group (P < 0.05). AO-EB double staining showed that DXG could induce the apoptosis and morphological
change of HepG2 cells and the ratios of apoptosis were obviously high when the concentration of DXG increased. The laddering
pattern was clearly presented in the cells treated with 100 and 200 μg/mL DXG for 48 h. RT-PCR showed that DXG could up-regulate
the mRNA level of bax and down-regulate the mRNA levels of bcl-2 in HepG2 cells. Conclusion DXG could obviously inhibit the
proliferation and induce the apoptosis in HepG2 cells. The mechanism is related to the modulation of the expression level of bax/bcl-2
mRNA.
Key words: Galium verum L.; diosmetin-7-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside; liver cancer HepG2 cell; apoptosis;
cell proliferation; bcl-2; bax

收稿日期：2012-07-11
基金项目：国家自然科学基金资助项目（201281274034）；教育部博士点基金资助项目（20112327110006）
作者简介：李海霞（1986—），女，山东泰安人，硕士，主要从事中药抗肿瘤作用机制研究。Tel: 13946097470 E-mail: xinyuanfangfei@126.com
*通信作者 马 玲 Tel: 13654657092 E-mail: malinghai@126.com
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许多天然黄酮类化合物具有抗肿瘤和诱导细胞
凋亡的作用[1-2]。蓬子菜 Galium verum L. 含有大量黄
酮类化合物，其中香叶木苷可抑制黑色素瘤转移，
阻止口腔癌细胞增殖[3-4]。前期研究从蓬子菜总黄酮
中分离到单体化合物香叶木素-7-O-β-D-木糖-(1→
6)-β-D-葡萄糖苷（DXG）[5]，本实验研究 DXG 体外
对人肝癌 HepG2 细胞增殖与凋亡的作用，并探讨其
作用机制，为蓬子菜黄酮类成分的研发及寻找新的
抗肿瘤药物提供实验依据。
1 材料
1.1 药物与试剂
DXG，相对分子质量 594，质量分数 95%，由
黑龙江中医药大学提供。新生牛血清，杭州四季青
公司；DMEM 培养基，Gibco 公司；台盼蓝染液、
MTT 试剂、Trizol 细胞裂解液、吖啶橙-溴乙啶
（AO-EB），Sigma 公司；琼脂糖，Biowest 公司；EDTA、
Tris-HCl，KH 公司；反转录及 PCR 试剂盒，TakaRa
公司，引物由上海英俊公司合成。
1.2 细胞
人肝癌 HepG2 细胞株，购于中国科学院上海研
究所。
1.3 仪器
CO2 恒温培养箱，Heal Force 生物医疗科技有
限公司；倒置显微镜、荧光显微镜，日本 Olympus
公司；多功能酶标仪，美国 BioTek 公司；PCR 仪，
美国 ABI 公司。
2 方法
2.1 细胞培养
HepG2 细胞用含有 10% 新生牛血清的 DMEM
培养基、于 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养。当细胞
密度达 80%～90%时，弃掉培养液，用磷酸盐缓冲
液（PBS）洗 2 遍，加入消化液（0.02%EDTA 和 0.25%
胰蛋白酶），37 ℃消化 2 min。倒置显微镜观察细
胞变圆、收缩、细胞间隙增大时，弃掉消化液，加
培养基制成单细胞悬液，分装到新的培养瓶中，继
续培养。
2.2 台盼蓝染色法检测 HepG2 细胞生长
取对数生长期 HepG2 细胞，调整细胞悬液密度
为 1.75×104/mL，接种于 96 孔板，每孔 200 μL。
待细胞贴壁后换液，给药组分别加入 DXG 50、100、
200 μg/mL，对照组加入 DMEM 培养液，每组均设
3 个平行孔，培养 24、48 h 后收集细胞，细胞悬液
与 0.4%台盼蓝以 9∶1 混合，倒置显微镜下观察（死
细胞被染成蓝色，活细胞呈无色透明），计算活细胞
和死细胞数目。
2.3 MTT 法检测 HepG2 细胞增殖
HepG2 细胞处理与给药同“2.2”项。细胞培养
24、48、72 h 后，各给药组及对照组每孔均分别加
入 20 μL MTT（5 mg/mL），37 ℃孵育 4 h，弃上清，
每孔加入 200 μL DMSO，37 ℃下摇床振荡 10 min，
酶标仪测定 490 nm 处吸光度（A）值，计算细胞增
殖抑制率。
增殖抑制率＝1－A 给药组 / A 对照组
2.4 AO-EB染色法检测HepG2细胞凋亡的形态学
改变
收集对数生长期 HepG2 细胞，调整细胞悬液密
度为 1.8×105/mL，接种到有盖玻片的培养皿中，待
细胞贴壁后换液，给药组加入 DXG 50、100、200
μg/mL，对照组加入培养液。培养 48 h 后，取出盖
玻片，PBS 洗 3 min，取 10 μL AO-EB（250 μg/mL
AO，250 μg/mL EB）染色，荧光显微镜下（×200）
观察，计数一个视野下的细胞凋亡率。
细胞凋亡率＝ (早期凋亡细胞数＋晚期凋亡细胞数) / (早
期凋亡细胞数＋晚期凋亡细胞数＋坏死细胞数＋活细胞数)
2.5 琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞 DNA 变化
将 HepG2 细胞分成 DXG 50、100、200 μg/mL
组和对照组（给予培养液），加药后各组细胞培养
48 h，收集细胞，调整细胞数约 3×106 个，PBS 洗
2 遍，加入 600 μL 细胞裂解液（0.5 mol/L EDTA，1
mol/L Tris-HCl，10% SDS）、20 μL 蛋白酶 K（200
μg/mL），55 ℃孵育 3 h，用等体积的 Tris-饱和酚-
氯仿-异丙醇（25∶24∶1）提取 3 次，1.2 倍体积无
水乙醇沉淀 DNA，等体积 70%乙醇洗沉淀后，三羟
甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液（TE 缓冲液，
0.5 mol/L EDTA，1 mol/L Tris-HCl）溶解 DNA。进
行 2%琼脂糖凝胶电泳分析。
2.6 RT-PCR 检测 bcl-2 及 bax 基因表达
HepG2 细胞处理与给药同“2.5”项。细胞培养
48 h，收集细胞，调整细胞数约 2×106个，用 Trizol
裂解法提取细胞中 RNA 并检测其量和纯度，按照
反转录试剂盒说明书，合成 cDNA。反应条件：42 ℃，
30 min；95 ℃，5 min；5 ℃，5 min。bcl-2（340 bp）
引物序列：上游引物 5’-TTCCCATCGCTGTCCTT
CG-3’，下游引物 3’-CGCTTAGATACAAATGTCC
GTGTC-5’；PCR 反应条件：94 ℃、5 min，94 ℃、
30 s，59 ℃、30 s，72 ℃、45 s，35 个循环，最后 72
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℃延伸 7 min。bax（386 bp）引物序列：上游引物
5’-GGATGCGTCCACCAAGAA-3’，下游引物 3’-
AAACACCGCCCTCACG-5’；PCR 反应条件：94 ℃、
5 min，94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、45 s，30
个循环，最后 72 ℃延伸 7 min。β-actin（256 bp）
引物序列：上游引物 5’-CTCGCTGTCCACCTT
CCA-3’，下游引物 3’-CTTGCCACTTCCACTGTC
G-5’，PCR 反应条件：94 ℃、2 min，94 ℃、45 s，
55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，35 个循环，最后 72
℃延伸 10 min。PCR 产物在 1.5%琼脂糖凝胶电泳
分析。
2.7 统计学分析
采用 SPSS 16.0 统计软件处理数据，连续型变
量以 ±x s 表示，多组间比较采用方差分析，组间两
两比较采用 LSD 检验。
3 结果
3.1 对 HepG2 细胞生长的影响
与对照组相比，DXG 50、100、200 μg/mL 均
抑制 HepG2 细胞生长，并随着培养时间延长、质量
浓度升高，细胞数量逐渐减少，表明 DXG 对 HepG2
细胞生长抑制作用明显（P＜0.01）。结果见图 1。

与同期对照组比较：**P＜0.01
**P < 0.01 vs control group at same phase
图 1 DXG 对 HepG2 细胞生长的影响
Fig. 1 Effect of DXG on growth of HepG2 cells
3.2 对 HepG2 细胞增殖的影响
MTT 法检测显示，DXG 在 50、100、200 μg/mL
时，对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，也呈现明显
的时间和质量浓度相关性，与同期对照组相比差异
显著（P＜0.05）。结果见图 2。

与同期对照组比较：*P＜0.05
*P < 0.05 vs control group at same phase
图 2 DXG 对 HepG2 细胞增殖抑制的影响
Fig. 2 Inhibition of DXG on proliferation of HepG2 cells
3.3 对 HepG2 细胞形态学及凋亡率的影响
荧光显微镜下可见，对照组 HepG2 细胞核为绿
色，细胞排列紧密呈多边形。DXG 50 μg/mL 组，
HepG2 细胞出现早期凋亡的特点，细胞体积缩小，
核呈绿色、固缩，可见圆柱状的小体；DXG 100、
200 μg/mL 组 HepG2 细胞呈现晚期凋亡的特点，由
于细胞膜通透性的改变，使溴乙啶（EB）进入细胞
内，细胞核为橘红色并呈固缩状或破碎状。随着
DXG 质量浓度的增加，细胞凋亡率明显增大。结果
见图 3、4。
3.4 对 bcl-2 和 bax 基因表达及 bax/bcl-2 的影响
以质量浓度分别为 100、200 μg/mL 的 DXG 处
理 HepG2 细胞 48 h 后，细胞出现凋亡特征性“梯
形”条带（图 5）；HepG2 细胞 bax 基因表达明显增
强，且呈质量浓度相关性；而随着 DXG 质量浓度
的增高，bcl-2 基因表达则显著减弱（图 6），bax/bcl-2
值增大（表 1）。


图 3 DXG 对 HepG2 细胞形态学的影响
Fig. 3 Morphological changes of HepG2 cells induced by DXG
对照
DXG 50 μg·mL−1
DXG 100 μg·mL−1
DXG 200 μg·mL−1
24 h 48 h 72 h
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
细
胞
增
殖
抑
制
率
/
%

*
*
*
*
*
*
*
*
*

25
20
15
10
5
0
对照 50 100 200
DXG / (μg·mL−1)
细
胞
数
(
×
10
3 )
/
m
L
24 h
48 h
** ** **
** **
**

对照 DXG 50 μg·mL−1 DXG 100 μg·mL−1 DXG 200 μg·mL−1
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与对照组比较：*P＜0.05
*P < 0.05 vs control group
图 4 DXG 对 HepG2 细胞凋亡的影响
Fig. 4 Effect of DXG on apoptosis of HepG2 cells

图 5 DXG 诱导 HepG2 细胞凋亡的 DNA 片段
Fig. 5 DNA fragmentation in HepG2 cells induced by DXG

图 6 DXG 对 HepG2 细胞 bcl-2、bax 表达的影响
Fig. 6 Effect of DXG on expression of bcl-2
and bax in HepG2 cells
4 讨论
天然黄酮类化合物具有较好的抗癌作用，能够
抑制肿瘤细胞增殖，并通过多种信号途径诱导细胞
凋亡[6-9]。蓬子菜具有多种药理作用，如降血压、抗
血栓、抗氧化、消炎、抗癌和保肝作用等[10]，其主
要生物活性成分是黄酮类化合物，其中香叶木苷可
通过Fas/FasL受体途径抑制肿瘤细胞诱导的胸腺细
胞凋亡，调节免疫系统的功能，发挥抑制肿瘤细胞
增殖的作用[11]。为了进一步研究蓬子菜黄酮类成分
的抗癌作用，本实验观察从蓬子菜总黄酮中分得的
单体化合物 DXG 对肝癌 HepG2 细胞的体外抗肿瘤
作用。结果表明，DXG 能够显著抑制 HepG2 细胞
增殖，诱导其凋亡；观察到经 DXG 100、200 μg/mL
处理 48 h，HepG2 细胞出现明显的“梯状”条带，
表 1 DXG 对 HepG2 细胞 bcl-2 和 bax 表达的影响 ( 3=± n , sx )
Table 1 Effect of DXG on expression of bcl-2 and bax gene in HepG2 cells ( 3=± n , sx )
组 别 ρ / (μg·mL−1) bcl-2 相对表达量 bax 相对表达量 bax/bcl-2
对照 － 0.96±0.02 0.87±0.01 0.79±0.11
DXG 50 0.90±0.01 0.96±0.03 0.91±0.10
100 0.88±0.22* 1.02±0.04* 1.01±0.14*
200 0.60±0.03* 1.06±0.08* 1.50±0.13*
与对照组比较：*P＜0.05
*P < 0.05 vs control group
进一步证实 DXG 诱导 HepG2 细胞凋亡；DXG 还可
调节 bax 和 bcl-2 基因表达。此外，随着 DXG 质量浓
度的增加，细胞凋亡抑制基因 bax 的表达明显上调，
细胞凋亡抑制基因 bax 的表达明显增强，而促凋亡基
因 bcl-2 的表达逐渐减少，导致了 bax/bcl-2 的增加。
综上所述，蓬子菜中黄酮化合物 DXG 具有明
显的抑制人肝癌细胞 HepG2 增殖、诱导其凋亡的作
用，其作用机制与调控 bax、bcl-2 的表达有关。
参考文献
[1] Wenzel U, Kuntz S, Brendel M D, et al. Dietary flavone
is a potent apoptosis inducer in human colon carcinoma
cells [J]. Cancer Res, 2000, 60(14): 3823-3831.
[2] Suh Y, Afaq F, Johnson J J, et al. A plant flavonoid
fisetein induces apoptosis in colon cells by inhibition of
COX2 and Wnt/EGFR/NF-κb-signaling pathways [J].
Carcinogenesis, 2009, 30(2): 300-307.
[3] Conesa M C, Ortega V V, Gascon M J Y, et al. Treatment
of metastatic melanoma B16F10 by the flavonoids
tangeretin rutin and disomin [J]. J Agric Food Chem,
2005, 53(17): 6791-6793.
[4] Browning A M, Walle U K, Walle T. Falvonoid

对照 50 100 200
DXG / (μg·mL−1)
60
50
40
30
20
10
0
细
胞
凋
亡
率
/
%

*
*
*

对照 50 100 200
DXG / (μg·mL−1)





对照 50 100 200
DXG / (μg·mL−1)
bax
bcl-2
β-actin
386 bp
340 bp
256 bp
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glycodides inhibitis oral cancer cell proliferation-role of
cellular uptake and hydrolysis to the aglycones [J]. J
Pharm Pharmacol, 2005, 57(8): 1037-1042.
[5] 崔明宇, 孙志伟, 王 艳, 等. 蓬子菜中活性成分DXG
在大鼠体内的药物动力学研究 [J]. 中医药学报, 2012,
40(6): 47-50.
[6] 肖义军, 陈元仲, 陈炳华, 等. 红花桑寄生总黄酮提取
物选择性抑制人源肿瘤细胞增殖和诱导凋亡 [J]. 中国
中西医结合杂志, 2009, 29(2): 148-152.
[7] 唐丽华, 游本钢, 徐向义, 等. 珍珠菜总黄酮苷诱导
HL-60 细胞凋亡作用研究 [J]. 上海中医药大学学报,
2007, 21(1): 54-57.
[8] Chen Y C, Shen S C, Lee W R, et al. Wogonin and fisetin
induction of apoptosis through activation of caspase 3
cascade and alter native expression of p21 protein in
hepatocellular carcinoma cells SK-HEP-1 [J]. Arch
Toxicol, 2002, 76(5/6): 351-359.
[9] Lv W, Sheng X, Chen T, et al. Jaceosidin induces apoptosis
in human ovary cancer cells through mitochondrial
pathway [J]. J Biomed Biotech, 2008, 7: 1-6.
[10] 崔明宇, 冀有良, 苏连杰, 等. 蓬子菜的化学成分与药理
作用 [J]. 国外医药: 植物学分册, 2008, 23(3): 112-114.
[11] Zhao R, Chen Z B, Jia G Y, et al. Protective effects of
diosmetin extracted from Galium verum L. on the thymus
of U14-bearing mice [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2011,
89(9): 665-673.