全 文 ：子一样的分子量,再次证明了我们之前的推断,干扰
物极有可能是羟基积雪草苷的同分异构体。结合相
关文献的报道[ 7] ,推断干扰峰为积雪草苷 B,它与羟
基积雪草苷是一对乌苏烷型和齐墩果烷型结构异构
的同分异构体。
3 2 异构体的分离: 目前对于 HPLC 法拆分异构
体的方法主要有手性试剂衍生、采用手性柱、手性流
动相添加剂法等,其中手性流动相添加剂法有其独
特的优点。据文献报道,潘见等 [ 8]采用 环糊精流
动相添加剂法来分离测定积雪草总苷元中的羟基积
雪草酸。因此我们尝试采用同样的方法来分离积雪
草总苷中的羟基积雪草苷和积雪草苷 B。试验证
明, 环糊精的加入, 使各异构体与环糊精形成不
同空间位阻的包含物, 得到了不同的保留时间。而
且随着环糊精浓度的增加, 羟基积雪草苷峰与积
雪草苷 B峰的分离度越高,而流动相的 pH 值对于
色谱峰形、分离效果等均无显著影响。由于高浓度
的环糊精水溶液存在溶解性的问题 ( 1 85 g/ 100
mL, 25 ) ,在权衡了各浓度 环糊精条件下的分
离效果后,最终选择乙腈2 mmol/ L 环糊精溶液
( 24 76) 作为流动相条件。
4 结论
本实验对积雪草药材及其总苷的测定方法进行
了研究。通过在流动相中添加 环糊精, 成功地区
分了样品中的异构体, 建立了样品中羟基积雪草苷
和积雪草苷的定量测定方法;同时,在此基础上建立
了积雪草总苷的 HPLC 特征图谱, 所得图谱中共确
定了 6个共有峰,非共有峰面积所占总面积均小于
5% ,各共有峰的相对保留时间均十分稳定。各批号
样品的相似度均在 0 95~ 1 00,表明不同批号样品
间具有很高的相似度。方法快速简便、结果准确、重
现性好,为积雪草药材及其总苷的质量控制提供了
有价值的参考。
参考文献:
[ 1] 秦路平, 庄卫国, 郑汉臣, 等 积雪草研究进展 [ J] 国外医
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25( 3) : 316318
三叶木通 AFLP 反应体系的建立及优化
王 喆1 ,张 铮1, 2, 3 * ,褚会娟1 ,王喆之1, 2, 3
收稿日期: 20100202
基金项目:陕西省科技攻关项目 ( 2010K1705)
作者简介:王 喆( 1985 ∀ ) ,女,河北省石家庄市人,硕士,研究方向为植物遗传多样性。Email : w zveta@ gmail. com
* 通讯作者 张 铮 研究方向为植物遗传 Em ail: zhangzheng@ snnu. edu. cn
( 1 陕西师范大学生命科学学院,陕西 西安 710062; 2 陕西师范大学 药用资源与天然药物化学教育部重点实验室,
陕西 西安 710062; 3 西北濒危药材资源开发国家工程实验室, 陕西 西安 710062)
摘 要:目的 为研究三叶木通种质资源遗传多样性,建立并优化三叶木通 AFLP 反应体系。方法 以三叶木通
叶片为材料,对影响 AFLP 反应体系中连接、预扩增和选择性扩增的各因素进行分析, 建立优化的 AFLP 反应体
系。结果 建立三叶木通 AFLP 反应优化体系: 连接体系加入 T 4连接酶 2 U , Mse I 接头 100 pmo l, EcoR I 接头
10 pmo l;预扩增反应总体积 20L ,加入连接产物 2 0L, E0、M0 各 100 ng , dNTPs 0. 250 mmol/ L , Mg2+ 1. 875
mmol/ L , T aq DNA 聚合酶 2 U ;选择性扩增反应总体积 20 L, 加入 5 L 稀释 100 倍的预扩增产物, E3、M 3各
50 ng , dNTPs 0. 250 mmo l/ L, Mg 2+ 1. 875 mmo l/ L, Taq DNA 酶 1 5 U。结论 建立适用于三叶木通种质资源
遗传多样性研究的 AFLP 反应优化体系。
关键词:三叶木通; AFLP; 优化
中图分类号: R282 71 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2010) 12 2074 05
!2074! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
Establishment and optimization of AFLP reaction system for Akebia trif oliata
WANG Zhe
1
, ZHANG Zheng
1, 2, 3
, CHU Huijuan1 , WANG Zhezhi1, 2, 3
( 1 Co llege of L ife Science, Shaanx i Normal Univ ersity , X i#an 710062, China; 2. Key Labor ator y o f M inistr y
of Education for M edicinal Resources and Nat ur al Pha rmaceutical Chemist ry, Shaanx i Normal Univ ersity ,
Xi#an 710062, China; 3. National Engineer ing Labo rato ry for Resource Development
of Endanger ed Crude D rugs in Nor thwest of China, X i#an 710062, China)
Abstract: Objective T o establish and opt im ize the AFLP react ion system for g enet ic diversity analysis
on A kebia tr i f oliata. Methods The leaves of A . t ri f ol iata were used to analyze the inf luencing factors of
the lig at ion, the preamplificat ion, and the select ive amplif ication of AFLP, so that the optimal AFLP
react ion system could be built up. Results T he opt imal AFLP react ion sy stem has been set up: added 10
pmol o f EcoR I adapter, 100 pmol of Mse I adapter, and 2 U of T 4 DNA lig ase in the ligat ion m ixture;
The preamplificat ion mix ture ( 20 L) contained 2. 0 L of ligat ion pr oducts, 100 ng of each preselect ive
primer, E0 and M0, 0. 250 mmol/ L of dN TPs, 1. 875 mmol/ L of Mg 2+ , 2 U of T aq DNA polymer ase;
the select ive amplif icat ion mixture ( 20 L) contained 5 L of 1 100 diluted pr eamplif icat ion products, 50
ng of each select ive primer, E3 , M 3 , 0. 250 mmo l/ L of dNT Ps, 1. 875 mmol/ L o f M g
2+
, 1. 5 U of Taq
DNA po lymerase. Conclusion The study on A. tr if ol iata could establish and opt imize the AFLP react ion
system which can be used in the resear ch o f genet ic diversity of the species in future.
Key words: A kebia tr if ol iata ( Thunb. ) Koidz. ; AFLP; optim izat ion
三叶木通 Akebia t ri f ol iata ( Thunb. ) Koidz.
为木通科木通属落叶木质藤本植物,主要分布在我
国的河北、山西、山东、河南、陕西南部、甘肃东南部
至长江流域各省区, 其根、藤茎、叶、花、果均可入药,
有利尿、抗肿瘤、抗菌等功效 [ 12]。目前对三叶木通
的研究主要集中在化学成分、药用价值、生物学特
征、栽培技术和资源分布等方面,对其遗传结构的研
究仅局限于构建 RAPD 反应体系阶段 [ 36]。
扩增片段长度多态性 ( amplif ied fr agment
leng th polymorphism, AFLP) ,是 Vos创立的一项
检测 DNA 多态性的分子标记技术[ 7] , 因其具有多
态性丰富、无需预知序列信息、稳定性好、DNA 用
量少等优点,目前已广泛应用于种质资源鉴定、遗传
多样性研究和遗传连锁图谱的构建等方面[ 89] ,然而
尚未见 AFLP 应用于三叶木通的相关报道。本研
究以三叶木通为材料,对 AFLP 分析过程中的主要
影响因素进行单因素多水平分析,建立并优化了三
叶木通 AFLP 反应体系,为今后研究其遗传多样性
奠定了基础。
1 材料与方法
1 1 材料:实验所用三叶木通采自陕西师范大学三
叶木通种质资源圃。
1 2 试剂: 限制性内切酶 M se I 和 EcoR I ( NEB
公司) , T 4连接酶 ( MBI 公司) , Taq DNA 聚合酶
( T aKaRa 公司) , DL2000 M arker (西安润德生物技
术有限公司) ,引物和接头由北京赛百盛基因技术有
限公司合成。
1 3 主要仪器: M icr ofuge 22R 离心机、DU 730 核
酸蛋白分析仪 ( Beckman Coulter 公司) , PT C ∀ 200
PCR 仪 ( BIORAD 公司) , Tanon ∀ 1600 数码凝胶
图像处理系统 (上海天能科技有限公司) , DYCZ ∀
20F 型 DNA 序列分析电泳槽、DYY ∀ 12 型电泳仪
电源 (北京市六一仪器厂)。
1 4 基因组 DNA 的提取: 根据席在星等[ 6] 的
CTA B 法做了改良, 叶片研磨后用缓冲洗涤液
( 0 25 mL/ L N aCl, 0. 2 mol/ L T risCl ( pH 8. 0) ,
50 mmol/ L EDTA ( pH 8. 0) , 0. 1% PVP, 4% 巯
基乙醇) 清洗,氯仿异戊醇抽提前先用等体积苯酚
氯仿异戊醇 ( 25 24 1) 抽提 1次,用 50% 体积的
5 mol/ L NaCl替换 NaAc。取 3 L 提取的基因组
DNA 样品于 06% 琼脂糖凝胶电泳检测 ( 5 V/ cm)。
1 5 双酶切体系:总体积 20 L, 包括 500 ng 基因
组 DNA、NEB Buf fer 4 2 L、100 ∃ BSA ( 10 mg/
mL) 0. 2 L、EcoR I 3 U、Mse I 3 U。37 恒温孵
育 6 h, 65 变性 20 min。取 5 L 酶切产物于
1 6% 琼脂糖凝胶电泳检测 ( 5 V/ cm )。
1 6 连接体系 [ 10] : 酶切产物 7 5 L, 缓冲液 2 0
L,连接体系总体积 20 L, ddH 2O 补足。对影响
连接体系的 2 个因素, 即连接酶用量和接头浓度进
行优化 (表 1)。22 连接反应 2 h, 65 变性 10
m in, - 20 保存。
1 7 预扩增体系优化:用不含有任何选择性碱基的
E0/ M0引物组合进行预扩增反应, 反应总体积
20 L。对影响预扩增体系的各主要因素设置梯度实
!2075!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
表 1 不同连接体系
Table 1 Different ligation systems
体系 EcoR I 接头 M se I 接头 T 4连接酶
1 1 0 1 0 0 2
2 2 0 2 0 0 2
3 2 0 2 0 0 4
4 2 5 2 5 0 4
5 2 5 2 5 0 5
验 (表 2)。PCR扩增程序: 94 、2 min; 94 、30 s,
56 、30 s, 72 、1 min, 30个循环; 72 、5 min。预
扩增产物于 1 6% 琼脂糖凝胶电泳检测 ( 5 V/ cm)。
1 8 选择性扩增体系优化:根据前期预实验对 64
对引物组合的初步筛选结果, 从中选用条带相对丰
富且稳定的 EACT/ MCAG 引物组合, 反应总体
积 20 L。对影响选择性扩增体系的各主要因素设
置梯度实验 (表 3)。PCR 扩增程序: 94 、2 m in;
94 、30 s, 65 、30 s (每循环降低 0 7 ) , 72 、
1 min,共 13 个循环; 72 、5 min; 94 、30 s, 56 、
30 s, 72 、1 min,共 23 个循环。选择性扩增产物用
16% 琼脂糖凝胶电泳检测 ( 5 V/ cm)。
表 2 预扩增体系优化的各因素变量梯度
Table 2 Variable gradient for optimizing every
factors of preamplif ication system
序号 连接产物/L
引物量/
ng
Mg2+ 浓度/
( mmol! L- 1 )
dN TP s 浓度/
( mmol! L - 1)
T aq酶量/
U
1 1 0 50 0 625 0 063 0 5
2 2 0 75 1 250 0 125 1 0
3 3 0 100 1 875 0 188 1 5
4 4 0 2 500 0 250 2 0
5 3 125 0 313
表 3 选择性扩增体系各因素优化的变量梯度
Table 3 Variable gradient for optimizing every
factors of selective amplification system
序号 预扩产物稀释倍数
引物量/
ng
Mg 2+ 浓度/
( mmol! L- 1)
dNTPs 浓度/
( mmo l! L- 1 )
T aq酶量/
U
1 10 30 0 625 0 063 0 5
2 20 40 1 250 0 125 1 0
3 50 50 1 875 0 188 1 5
4 100 2 500 0 250 2 0
5 200 3 125 0 313
1 9 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:取 100 mL 60 g/ L
PA 胶, 120 L T EMED和 300 L 100 g/ L A PS 混
匀制胶,恒功率 85 W 预电泳 1 h。取 4 L 选择性
扩增产物加入等体积变性上样液 ( 98% 去离子甲
酰胺, 10 mmol/ L EDTA, 0. 25% 溴酚蓝, 0 25%
二甲苯氰) ,混匀, 95 变性 5 m in,上样量 8 L, 恒
功率 50 W 电泳 150 m in。
1 10 银染检测: 对 Bassan [ 11] 方法进行改进, 缩短
了银染时间。 % 固定: 2 L 10% 冰醋酸固定 10
m in。& 漂洗: 超纯水清洗 2次,每次 2 m in。 ∋ 染
色: 2 L 0 1% 硝酸银 (用前加 37% 甲醛 1 5 mL)
染色 15 min。(漂洗: 超纯水清洗 5 s。 ) 显色:
2 L、4 预冷的显影液 ( 30 g NaOH , 1. 6 g
NaH 2PO4 !H 2O,用前加 8 mL 37% 甲醛) 显色 10
m in。∗终止: 2 L、10% 冰醋酸终止 5 m in。 +漂
洗:超纯水清洗 5 min,室温干燥, 照相。
2 结果与分析
2 1 基因组 DNA 提取:模板 DNA 的质量直接影
响酶切以及连接反应是否充分, 因此, 高质量模板
DNA 的获取是 AFLP 成功的关键。本研究所用的
改良 CTAB 法得到 DNA 的 A 260 / A 280值在 1 7~
1 8,且电泳结果 (图 1) 显示 DNA 无降解, 条带清
晰,无 RNA, 无拖尾,适于 AFLP 分析。
图 1 基因组 DNA 电泳结果
Fig. 1 Electrophoresis of genomic DNA
2 2 酶切体系: 由图 2可见, 基因组 DNA 经过双
酶切后在 100~ 500 bp 形成均匀的弥散带,说明基
因组 DNA 被限制性内切酶 EcoR I 和 M se I 彻
底酶切。
MMar ker 1~ 4酶切产物
MMarker 1 ∀ 4digest ion products
图 2 基因组 DNA 双酶切电泳结果
Fig. 2 Electrophoresis of genomic DNA digested
by two restricted enzyme
2 3 连接体系: T 4连接酶用量和接头浓度是影响
连接体系的关键因素, 不同连接体系的优劣可以通
过电泳其预扩增产物进行比较 [ 10]。图 3 显示, 1和
2泳道条带范围在 100~ 1 000 bp, 3~ 5泳道条带范
围在 100~ 500 bp,可见增加接头浓度和 T 4连接酶
量后可降低非特异性扩增。连接体系 3、4和 5 产物
经过预扩增后得到的产物在凝胶上显示差别不大,考
虑到经济节约,选择体系 3,即 T 4连接酶量 2 U、EcoR
!2076! 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
MM ark er 1~ 5连接体系 1~ 5的预扩增产物结果图
MMark er 1 ∀ 5 elect rophoresis of preamplif icat ion
sys tem from 1 ∀ 5 ligation sy stem
图 3 不同连接体系的预扩增电泳结果
Fig. 3 Electrophoresis of preamplif ication system
from different ligation systems
I接头量 10 pmol和 Mse I接头量 100 pmol。
2 4 预扩增体系
2 4 1 模板浓度对预扩增的影响: 由图 4 ( 1~ 4 泳
道分别表示模板量 1 0、2 0、3 0 和 4 0 L) 可见
模板浓度对预扩增结果影响不大, 产物均在 100~
500 bp。考虑到经济节约及实验效果, 选择模板量
2 0 L 作为预扩增体系。
2 4 2 引物浓度对预扩增的影响:本实验对引物量
设置 50、75、100 ng 梯度实验,图 4 ( 5~ 7 泳道分别
表示引物量 50、75、100 ng ) 显示引物量增加对预扩
增产物片段范围影响不大,但加大引物量,可略微提
高产物的量,因此选择预扩增引物量 100 ng。
2 4 3 Mg2+ 浓度对预扩增的影响: M g2+ 浓度对扩
增反应的影响主要表现在影响酶的活性、扩增的真
实性以及产物的特异性, 因此选择合适的 Mg 2+ 浓
度是扩增的关键因素之一。由图 4 ( 12~ 16 泳道分
别表示 Mg2+ 浓度 0 625、1 250、1 875、2 500、
3 125 mmol/ L ) 可见, 当 Mg 2+ 浓度 为 1 875
mmo l/ L 时,预扩增结果相对较好。
2 4 4 dNTPs 浓度对预扩增的影响: dNTPs 可与
Mg
2+ 结合从而降低游离的 Mg2+ 浓度,不同浓度的
dNT Ps 会对扩增产生显著的影响。图 4 ( 17~ 21
泳道分别表示 dNT Ps 浓度 0 063、0 125、0 188、
0 250、0 313 mmol/ L ) 显示, 当 dN TPs 浓度低于
0 188 mmol/ L 时, 扩增产物量少; 当 dNT Ps 浓度
为 0 250 mmol/ L 时, 预扩增结果相对较好。
2 4 5 T aq DNA 聚合酶量对预扩增的影响: 由图
4 ( 8~ 11泳道分别表示 T aq DNA 聚合酶量 0 5、
1 0、1 5和 2 0 U) 可见,当 T aq 酶量为 0 5 U 时,
扩增产物量少, 随着酶量增加,预扩增产物量逐渐加
大,且片段范围均在 100~ 500 bp,因此, Taq DNA
聚合酶量选择 2 U。
MMar ker 1~ 21不同预扩增体系电泳结果
MMar ker 1 ∀ 21elect roph or esis of dif f erent
preamplif icat ion s ystem
图 4 不同预扩增体系电泳结果
Fig. 4 Electrophoresis of different preamplif ication systems
最终确定三叶木通 AFLP 预扩增体系: 连接产
物 2 0 L, E0 量 100 ng, M0 量 100 ng , dNT Ps
浓度 0 250 mmol/ L , Mg 2+ 浓度 1 875 mmol/ L,
T aq DNA 聚合酶量 2 U, ddH 2O 补至 20 L。
2 5 选择性扩增体系
2 5 1 预扩产物稀释倍数对选择性扩增的影响:由
图 5 ( 1~ 5 泳道分别表示模板稀释倍数 10、20、50、
100和 200 倍) 可见, 当模板浓度很高时,出现非特
异性扩增产物 (图 5: 1 泳道) ,随着模板稀释倍数的
加大,非特异性扩增产物量逐渐减少,但当模板稀释
200倍时, 扩增产物量较小。因此, 选择稀释 100 倍
的预扩增产物作为选择性扩增的模板。
2 5 2 引物浓度对选择性扩增的影响:由图 5 ( 6~ 8
泳道分别表示引物量 30、40 和 50 ng) 可见,随着引
物量增加, 扩增产物量加大,且片段范围均在 100~
500 bp,因此为保证扩增产物量,选择引物量 50 ng。
2 5 3 Mg2+ 浓度对选择性扩增的影响: 随着
Mg
2+ 用量增加, 扩增产物量加大 (图 5: 13~ 17 泳
道分别表示 Mg 2+ 浓度 0 625、1 250、1 875、2 500、
3 125 mmol/ L ) , 且片段范围均在 100~ 500 bp, 但
当 Mg2+ 浓度达到 2 500 mmol/ L 时, 扩增产物出
现非特异性扩增, 因此确定选择性扩增 Mg2+ 浓度
1 875 mmol/ L。
2 5 4 dNT Ps 浓度对选择性扩增的影响: 由图 5
( 18~ 22 泳道分别表示 dNT Ps 浓度 0 063、0 125、
0 188、0 250、0 313 mmol/ L ) 可见, 随着 dNT Ps
浓度的增加,扩增产量增加,且片段范围均在 100~
500 bp, 当 dNTPs 浓度为 0 250 mmol/ L 时,扩增
产物量最大。随着 dNT Ps 浓度增加到 0 313
mmol/ L ,由于和 Mg2+ 的结合, 导致扩增产物略微
减少,因此, 选择 dN TPs浓度 0 250 mmo l/ L。
2 5 5 T aq DNA 聚合酶量对选择性扩增的影响:
!2077!中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 12 期 2010 年 12月
由图 5 ( 9~ 12 泳道分别表示 T aq DNA 聚合酶量
0 5、1 0、1 5、2 0 U ) 可见随着 T aq 酶量增加, 扩
增产物量增加, 但当酶量增加到 2 U 时, 扩增产物
片段范围也相应增加。因此, 在保证扩增产物量和
没有非特异性扩增的前提下, 选择 T aq DNA 聚合
酶量 1 5 U。
MMarker 1~ 22不同选择性扩增体系电泳结果
MMarker 1 ∀ 22elect rophores is of diff erent
select ive amplif icat ion system s
图 5 不同选择性扩增体系电泳结果
Fig. 5 Electrophoresis of different selective
amplification systems
最终确定三叶木通 AFLP 选择性扩增体系: 预
扩增产物稀释倍数 100 倍, E3量 50 ng, M3量 50 ng,
dNTPs 浓度 0 250 mmol/ L, Mg2+ 浓度 1 875 mmol/
L, Taq DNA 聚合酶量 1 5 U, ddH 2O 补至 20 L。
2 6 银染结果:不同引物组合的选择性扩增产物通
过聚丙酰胺凝胶电泳和银染检测, 结果 (图 6) 显
示,条带清晰、丰富, 多态性好,可用于三叶木通遗传
多样性分析。
图 6 不同引物组合选择性扩增产物的银染结果 (局部)
Fig. 6 Silver stained results of selective amplification pro
ducts with dif ferent primer combinations (partial)
3 讨论
AFLP 分子标记技术由于其操作复杂,流程长,
所用药品和仪器多, 涉及因素多,且不同植物的反应
体系有差异,因此对影响三叶木通 AFLP 反应体系
的各关键因素的优化分析就显得尤为重要。本实验
着重分析基因组 DNA 的提取,并对扩增反应中的
主要因素进行优化。
三叶木通叶片中含有大量的多糖和酚类物质,
常规方法难以得到高质量的基因组 DNA。本实验
对 DNA 提取方法改良中, 增加洗涤步骤、苯酚氯
仿异戊醇 ( 25 24 1) 抽提和 NaCl 处理有效地
避免了酚类物质和多糖的干扰, 获得了完全符合
AFLP 要求的基因组 DNA。
扩增反应中, 模板浓度、引物量、Mg2+ 浓度、
dNTPs 浓度和 T aq DNA 聚合酶量均能够影响扩
增的效果, 其中以 Mg2+ 浓度、dNTPs 浓度和 Taq
DNA 聚合酶量的影响最为明显。Mg2+ 影响 Taq
酶的活性, dNTPs 可与 Mg 2+ 结合等,因此,三者的
配比关系,尤其是 Mg2+ 浓度和 dNTPs 浓度的配比
对扩增的影响更为重要。经过单因素多水平综合分
析,三叶木通 Mg2+ 和 dNT Ps 最适浓度分别为
1 875 和 0 250 mmo l/ L。
银染效果直接影响 AFLP 图谱分析, 显影液用
NaOH 代替 Na2 CO 3 , 可提供更强的碱性环境, 促进
显影液的显影能力,缩短了显影时间,同时加入少量
的 NaH 2PO4有效地控制了显影过程, 从而得到背
景清晰,对比度好的银染结果。
本实验通过对影响三叶木通 AFLP 反应中的
连接、预扩增以及选择性扩增中的各因素进行了梯
度优化分析,建立了适用于三叶木通种质资源遗传
多样性的 AFLP 反应优化体系。
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