全 文 ：药活性成分的生物合成及其调控机制, 有可能会给
制药工业带来巨大变革, 同时也可以解决一些药用
植物资源的问题。本研究通过酶的保守域来设计引
物, 采用RA CE 技术克隆其基因, 这对进一步研究
黄连N 2甲基乌药碱23′2羟化酶的功能、表达特征以
及利用基因工程技术促进黄连生物碱合成具有重
要意义。
参考文献:
[ 1 ]　 Ikezaw a N , T anaka M , N agayo sh i M , et a l1 M o lecu lar
clon ing and characterization of CYP 719, a m ethylenedioxy
bridge2fo rm ing enzym e that belongs to a novel P 450 fam ily,
from cu ltu red Cop tis jap on ica cells [J ]1 J B iol Chem , 2003,
278: 385572385651
[ 2 ]　O kada N , Ko Izum i N , T anaka T , et a l1 Iso lation, se2
quence, and bacterial exp ression of a cDNA fo r (S ) 2tetrahy2
droberberine ox idase from cultu red berberine2p roducing Cop 2 tis jap on ica cells [J ] 1P roc N a tl A cad S ci, 1989, 86: 53425381[ 3 ]　Sato F , H ash imo to T , H ach iya A , et a l1 M etabo lic engi2neering of p lan t alkalo id b io syn thesis [J ] 1 P roc N a tl A cadS ci, 2001, 98: 36723721[ 4 ]　李海涛, 张万年, 周有骏, 等1 细胞素P450 超家族蛋白质基于结构知识的序列联配 [ J ]1 生物物理学报, 1999, 15: 41924261[ 5 ]　 Im aiM , Sh im ada H , W atanabe Y, et a l1 U ncoup ling of thecytoch rom e P2450cam monooxygenase reaction by a singlem utation, th reon ine2252 to alan ine o r valine: A po ssib le ro leof the hydroxy am ino acid in oxygen activation [ J ] 1 P rocN a tl A cad S ci, 1989, 86: 7823278271[ 6 ]　Pau li H H , Kutchan T M 1 M o lecu lar clon ing and functionalhetero logous exp ression of two alleles encoding ( S ) 2N 2m ethylcoclau rine 3′2hydroxylase (CYP80B1) , a new m ethy1jasmonate2inducib le cytoch rom e P24502dependen t mono2oxy2genase of benzylisoqu ino line alkalo id b io syn thesis [J ]1 P lan tJ , 1998, 13: 79328011
真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生长的影响
陈晓梅, 郭顺星Ξ , 孟志霞
(中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所 生物技术中心, 北京　100094)
摘　要: 目的　研究固体培养条件下2 种真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生长的影响。方法　筛选获得铁皮石斛原球
茎的继代培养基及其生长曲线。根据生长曲线, 在原球茎生长的不同时期加入真菌诱导子, 考察诱导子对原球茎鲜
质量和干质量的影响。结果　铁皮石斛原球茎继代培养基: 1ö2M S+ 20% 土豆+ 3% 蔗糖+ 018% 琼脂。与对照相
比, 第11 周和第13 周加入M F23 诱导子使原球茎鲜质量分别提高了1614% (P < 0101)和2314% (P < 0101) , 干质量
分别提高了617% (P < 0105)和1719% (P < 0101) , 继代培养基中加入M F23 诱导子使原球茎干质量降低了919% (P
< 0101)。与对照相比, 第11 周和第13 周加入M F24 诱导子使原球茎鲜质量分别提高了1717% (P < 0101)和1210%
(P < 0105) , 第11 周加入M F24 诱导子使原球茎干质量提高了912% (P < 0105) , 继代培养基中加入M F24 诱导子使
原球茎干质量降低了1319% (P < 0101)。结论　在原球茎培养的早期加入真菌诱导子, 对原球茎的生长有一定抑制
作用; 在原球茎培养的后期加入真菌诱导子, 对原球茎的生长有促进作用。
关键词: 铁皮石斛; 原球茎; 真菌诱导子
中图分类号: R 28212　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253- 2670 (2008) 03- 0423- 04
Effects of funga l el ic itors on growth of D end robium cand idum protocorm s
CH EN X iao2m ei, GUO Shun2x ing, M eng Zh i2x ia
(B io techno logy Center, Inst itu te of M edicinal P lan ts D evelopm ent, Ch inese A cadem y of M edical Sciences
and Pek ing U nion M edical Co llege, Beijing 100094, Ch ina)
Abstract: Objective　To study the effects of tw o fungal elicito rs on the grow th of D end robium can2
d id um p ro toco rm s cu ltu red on the so lid m edium 1 M ethods　T he m edium fo r p ropagat ion of p ro toco rm s
w as selected and the grow th cu rve on that m edium w as ob ta ined1 A cco rding to the cu rve, the tw o fungal
elicito rs w ere added at the differen t grow th stages of p ro toco rm s1 T he fresh w eigh t (FW ) and dry w eigh t
(DW ) of p ro toco rm s w ere m easu red1 Results　T he m edium fo r p ropagat ion of p ro toco rm s w as 1ö2M S+
20% po ta to ex tract+ 3% sucro se+ 018% agar1 Compared w ith the con tro l M F23 elicito r added at w eek s
·324·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2007205207
基金项目: 国家杰出青年科学基金专项资助项目 (30325047)
作者简介: 陈晓梅 (1970—) , 女, 北京市人, 副研究员, 博士, 从事药用植物菌根生物学和药用真菌化学研究。
T el: (010) 62819871　E2m ail: xm chen@ imp lad1ac1cn3 通讯作者　郭顺星　T el: (010) 62829619　E2m ail: sxguo2006@yahoo1com 1cn
11 and 13 cou ld sign if ican t ly increase the FW by 1614% (P < 0101) and 2314% (P < 0101) , respect ively,
and the DW by 617% (P < 0105) and 1719% (P < 0101) , respect ively, and M F23 added in to the m edium
fo r the w ho le cu ltu re cou ld sign if ican t ly decrease the DW by 919% (P < 0101) 1 Compared w ith the con2
t ro l, M F24 elicito r added at w eek s 11 and 13 cou ld sign if ican t ly increase the FW by 1717% (P < 0101) and
1210% (P < 0105) , respect ively, added at w eek 11 cou ld sign if ican t ly increase the DW by 912% (P <
0105) , and M F24 added in to the m edium fo r the w ho le cu ltu re cou ld sign if ican t ly decrease the DW by
1319% (P < 0101) 1 Conclusion　T he grow th of p ro toco rm s can be inh ib ited w hen the fungal elicito r is
added at the early stage of cu ltu re and be imp roved w hen the fungal elicito r is added at the la ter stage of
the cu ltu re1
Key words: D end robium cand id um W all1 ex L indl1; p ro toco rm s; fungal elicito r
　　铁皮石斛 D end robium cand id um W all1 ex
L indl1 是《中国药典》2005 年版收载的石斛属3 种植
物之一, 也是该属药用植物中最为珍稀名贵的一种。
铁皮石斛生长在北亚热带雨林, 以半自养半异养的
方式进行生长和发育[1 ] , 其种子极小、无胚乳, 自然
繁殖率极低[2 ] , 被列为国家二级保护植物。铁皮石斛
原球茎是利用铁皮石斛种子进行人工繁殖的起点,
有较高的增殖效率[3 ] , 药理研究证明其具有提高机
体免疫功能的作用, 且作用强度与原药材相似[4 ]。本
实验研究固体培养条件下2 种真菌诱导子对铁皮石
斛原球茎生长的影响, 为进一步研究利用真菌诱导
子提高铁皮石斛原球茎的内在质量奠定基础。
1　材料与方法
111　材料: 铁皮石斛由中国医学科学院药用植物研
究所生物技术中心郭顺星教授鉴定。铁皮石斛原球
茎由铁皮石斛种子通过无菌培养诱导繁殖形成。原
球茎在1ö2M S+ 3% 蔗糖+ 018% 琼脂的培养基上继
代培养保存[5 ]。
真菌M F23 和M F24 均分离自野生铁皮石斛的
根部, 经首都师范大学生物系范黎博士鉴定, 均为小
菇属真菌 (M y cena sp 1)。
112　方法
11211　培养方法: 原球茎的固体培养, 培养基A 为
M S 培养基; 培养基B 为M S 培养基大量元素减半; 培
养基C 为M S 培养基大量元素减半, 土豆200 göL (煮
20 m in, 取汁) ; 培养基D 为672v 培养基, 土豆200 gö
L (煮20 m in, 取汁) ; 培养基E 为B 5 培养基。以上培养
基中都要加入蔗糖30 göL , 琼脂810 göL , pH 518。培
养条件: 温度24～ 26 ℃, 光照强度1 500～ 2 000 lx, 光
照时间10 höd。
真菌的液体培养: 培养基为麦麸 30 göL (煮 30
m in, 取汁) , 葡萄糖 20 göL , 磷酸二氢钾 310 göL , 硫
酸镁115 göL , pH 自然。培养条件: 温度24～ 26 ℃,
暗培养, 摇床转速100 röm in, 培养21 d。
11212 　真菌诱导子的制备: 真菌液体培养 21 d, 将
发酵产物打碎, 121 ℃灭菌20 m in, 为真菌诱导子。
11213　原球茎固体培养的培养基筛选: 原球茎分别
接入培养基 A、B、C、D、E 中, 接种量 ( 01851 ±
01089) g。原球茎培养 12 周后收获, 以瓶为单位称
量原球茎的鲜质量; 收获的原球茎于 50 ℃干燥恒
重, 以瓶为单位称量干质量。采用完全随机实验设
计, 每种处理重复10 次。
11214　原球茎生长曲线实验: 原球茎接入培养基C
中, 接种量 (01856±01114) g。从培养的第 6 周开
始, 每周收获原球茎。称量原球茎鲜质量和干质量的
方法同11213。根据结果绘制原球茎在培养基C 上的
生长曲线。采用完全随机实验设计, 每种处理重复6
次。
11215　真菌诱导子对原球茎生长的影响: 原球茎接
种量 (21201±01311) g。真菌诱导子的加入量均为
150 mL öL (诱导子ö培养基)。诱导子的加入时间分
别为: 配制培养基时、培养的第 11 周和培养的第 13
周。各处理的原球茎均在培养的第14 周收获。称量
原球茎鲜质量和干质量的方法同11213。以在培养基
C 上培养14 周的原球茎为空白对照。采用完全随机
实验设计, 每种处理重复7 次。
11216　统计学处理: 对原球茎的鲜质量和干质量进
行单因素方差分析, 如果F 检验各均数间存在显著
或极显著差异, 再对各均数进行 q 检验 (N ewm an2
Keu ls 检验) 的多重比较, 结果以 x ± s 的形式
表示[6 ]。
2　结果
211　原球茎固体培养的培养基筛选: 在不同的培养
基上生长, 对原球茎的鲜质量和干质量都有极显著
性影响 (P < 0101)。多重比较结果表明: 在培养基C
和D 上生长的原球茎的鲜质量和干质量均极显著地
高于在其他3 种培养基上生长的原球茎的鲜质量和
干质量 (P < 0101) ; 在培养基 E 上生长的原球茎的
·424· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
鲜质量极显著地高于在培养基A 和B 上生长的原球
茎的鲜质量 (P < 0101) ; 在培养基 E 上生长的原球
茎的干质量极显著地高于在培养基A 上生长的原球
茎的干质量 (P < 0101) , 显著地高于在培养基B 上
生长的原球茎的干质量 (P < 0105) ; 在培养基B 上
生长的原球茎的干质量显著地高于在培养基A 上生
长的原球茎的干质量 (P < 0105) , 见表1。
表 1　不同培养基对铁皮石斛原球茎鲜质量和干质量的
影响
Table 1　Effects of d ifferen t media on FW and DW
of D 1 cand idum protocorm s
组　别 鲜质量ö(g·瓶- 1) 干质量ö(g·瓶- 1)
培养基A 　31061±11802 　01168±01084
培养基B 41236±21267 　01249±01113▲
培养基C 161177±115723 　01725±010533
培养基D 151678±211483 　01742±010803
培养基E 71937±11150△ 　01331±01035★★☆
　　与培养基A , B 和E 比较: 3 P < 0101; 与培养基A 和B 比较:
△P < 0101; 与培养基A 比较: 　★★P < 0101; 与培养基B 比较:
☆P < 0105; 　与培养基A 比较: ▲P < 0105
　　Compared w ith m edia A , B , and E, 3 P < 0101; Compared
w ith m edia A and B, △P < 0101; Compared w ith m edium A ,
★★P < 0101; Compared w ith m edium B, ☆P < 0105; Compared
w ith m edium A : ▲P < 0105
212　铁皮石斛原球茎的生长曲线: 铁皮石斛原球茎
在培养基C 上生长的鲜质量变化曲线表明: 原球茎
生长的第7 周之前为延迟生长期, 第7～ 8 周为指数
生长期, 第9～ 13 周为线性生长期, 第14～ 16 周为减
速生长期, 16 周以后停止生长 (图1)。铁皮石斛原球
茎在培养基C 上生长的干质量变化趋势与鲜质量的
变化基本一致 (生长曲线实验的数据未列出)。
生长时间ö周
图 1　铁皮石斛原球茎生长曲线
F ig11　Growth curve of D 1 cand idum protocorm s
213　真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生长的影响
21311　真菌诱导子对铁皮石斛原球茎鲜质量的影
响: 2 种真菌诱导子对铁皮石斛原球茎的鲜质量均
有极显著性影响 (P < 0101)。
对M F23 诱导子处理的原球茎鲜质量的多重比较
结果表明: 与对照相比, 第11 周和第13 周加入诱导子
极显著地提高鲜质量 (P < 0101) , 分别提高了1614%
和 2314% ; 与培养基中加入诱导子的处理相比, 第11
周和第13 周加入诱导子, 极显著地提高鲜质量 (P <
0101) , 分别提高了1211% 和1818% (表2)。
表 2　两种真菌诱导子对铁皮石斛原球茎鲜质量
和干质量的影响
Table 2　Effects of two fungal el ic itors on FW
and DW of D 1 cand idum protocorm s
组　别 鲜质量ö(g·瓶- 1) 干质量ö(g·瓶- 1)
M F23 培养基加诱导子 301537±11386 11205±010553 3
第 11 周加诱导子 341222±015863 3 ▲▲ 11427±011003 ▲
第 13 周加诱导子 361283±317673 3 ▲▲ 11576±010773 3 ▲▲★★
M F24 培养基加诱导子 281086±11884 11151±010813 3
第 11 周加诱导子 341585±313313 3 ▲▲ 11460±011153 ▲▲
第 13 周加诱导子 321908±210523 ▲▲ 11409±01092▲▲
对照 291392±21309 11337±01075
　　与对照比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101; 与培养基加诱导子比较:
▲P < 0105　▲▲P < 0101; 与第11 周加诱导子比较: ★★P < 0101
　　Compared w ith con tro l, 3 P < 0105　3 3 P < 0101, respective2
ly; compared w ith adding elicito rs in to m edium , ▲P < 0105
▲▲P < 0101, respectively; compared w ith adding elicito rs in w eek
11, ★★P < 0101
21312　真菌诱导子对铁皮石斛原球茎干质量的影
响: 2 种真菌诱导子对铁皮石斛原球茎的干质量均
有极显著性影响 (P < 0101)。
对M F23 诱导子处理的原球茎干质量的多重比
较结果表明: 与对照相比, 培养基中加入诱导子极显
著地降低干质量 (P < 0101) , 降低了 919% , 第 11 周
加入诱导子显著地提高干质量 (P < 0105) , 第 13 周
加入诱导子极显著地提高干质量 (P < 0101) , 分别
提高了617% 和1719% ; 与培养基中加入诱导子的处
理相比, 第11 周和第13 周加入诱导子极显著地提高
干质量 (P < 0101) , 分别提高了1814% 和3018% ; 与
第11 周加入诱导子的处理相比, 第13 周加入诱导子
极显著地提高干质量 (P < 0101) , 提高了 1014% (表
2)。
对M F24 诱导子处理的原球茎干质量的多重比
较结果表明: 与对照相比, 在培养基中加入诱导子的
处理极显著地降低干质量 ( P < 0101) , 降低了
1319% , 第 11 周加入诱导子显著地提高干质量
(P < 0105) , 提高了 912% ; 与培养基中加入诱导子
的处理相比, 第11 周和第13 周加入诱导子极显著地
提高干质量 ( P < 0101) , 分别提高了 2618% 和
2214% (表2)。
3　讨论
通过实验筛选确定 1ö2M S+ 20% 土豆+ 3% 蔗
糖+ 018% 琼脂为铁皮石斛原球茎的适宜培养基。在
·524·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
此培养基上原球茎继代培养 5 代以上, 能保持较高
的增殖率, 且原球茎不易分化。本研究结果与文献报
道[5 ]的结果有所不同, 文献报道添加土豆提取物时
原球茎增殖量最大, 但原球茎易分化成小苗。
铁皮石斛原球茎固体培养的线性生长期为第
9～ 13周, 随后进入减速生长期。研究结果表明在原
球茎生长的初期加入真菌诱导子, 对原球茎的生长
有一定抑制作用。在原球茎线性生长的后期加入真
菌诱导子, 能提高原球茎的鲜质量和干质量, 说明诱
导子对原球茎的生长有促进作用, 并能影响原球茎
的物质代谢过程, 促进其干物质的积累。这些结果与
已有的研究报道[7 ]结果相符合。
上述研究结果显示, 2 种真菌对原球茎的作用
有一定差别: 原球茎与M F23 诱导子作用时间延长,
鲜质量和干质量有降低的趋势; 原球茎与M F24 诱
导子作用时间延后, 鲜质量和干质量有增加的趋势。
但它们的这种不同作用之间没有显著性差异。推测
M F24 对原球茎的作用较温和。对于菌根真菌对铁
皮石斛原球茎的作用, 还有待于从生理、生化及次生
代谢产物等方面进行深入研究。
参考文献:
[ 1 ]　李铭宗1 铁皮石斛的生物学特性和人工栽培 [J ]1 福建热作
科技, 1999, 24 (1) : 292311
[ 2 ]　邵　华, 张玲琪, 李俊梅, 等 1 铁皮石斛研究进展 [ J ]1 中草
药, 2004, 35 (1) : 10921121
[ 3 ]　张　铭, 朱　峰, 魏小勇, 等 1 铁皮石斛种胚萌发和原球茎质
量控制 [J ]1 浙江大学学报 (理学版) , 2000, 27 (1) : 922941
[ 4 ]　高建平, 金若敏, 吴耀平, 等 1 铁皮石斛原球茎与原药材免疫
调节作用的比较研究 [J ]1 中药材, 2002, 25 (7) : 48724891
[ 5 ]　张治国, 刘　骅, 王　黎, 等 1 铁皮石斛原球茎增殖培养条件
研究 [J ]1 中草药, 1992, 23 (8) : 43124331
[ 6 ]　张　勤, 张启能1 生物统计学 [M ]1 北京: 中国农业大学出版
社, 20021
[ 7 ]　刘长军, 侯嵩生 1 真菌诱导子对新疆紫草悬浮培养细胞的生
长和紫草素合成的影响 [J ]1 植物生理学报, 1998, 24 (1) :
62101
肉苁蓉细胞悬浮培养体系的建立
欧阳杰1, 武彦文2, 王晓东3, 赵　兵3, 王玉春3Ξ
(11 北京林业大学生物科学与技术学院 食品科学与工程系, 北京　100083; 21 清华大学 化学系 生命有机磷化学
教育部重点实验室, 北京　100084; 31 中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室, 北京　100080)
摘　要: 目的　研究由肉苁蓉愈伤组织建立细胞悬浮培养体系的培养条件。方法　在固体培养基上添加不同比例
的生长激素, 考察生长激素、细胞种龄和接种量对细胞生长和次生代谢产物苯乙醇糖苷 (PeG)量的影响。结果　在
添加1 m göL 2, 42D 的B 5 固体培养基上形成的愈伤组织松散易碎, 适于进行悬浮培养。细胞种龄为25 d 和接种量为
3%～ 4% 时细胞悬浮培养的结果最好, PeG 产量达到最大, 为 0182 göL。细胞在悬浮培养时聚集体由大变小, 直径
小于015 mm 的细胞聚集体由接种时的5% 逐渐增加至第20 天时的81% , 其PeG 量为1011%。结论　通过摇瓶培养
建立了较好的细胞悬浮培养体系。
关键词: 肉苁蓉; 悬浮培养; 苯乙醇糖苷 (PeG)
中图分类号: R 28212　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253- 2670 (2008) 03- 0426- 04
Establ ishm en t of C is tanche deser ticola cell l ines in suspen sion culture
OU YAN G J ie1, W U Yan2w en2, W AN G X iao2dong3, ZHAO B ing3, W AN G Yu2chun3
(11 D epartm ent of Food Science and Engineering, Co llege of B io logical Science and T echno logy, Beijing Fo restry U niversity,
Beijing 100083, Ch ina; 21 Key L abo rato ry of B ioo rgan ic Pho spho rous Chem istry & Chem ical B io logy
(M in istry of Education) , D epartm ent of Chem istry, T singhua U niversity, Beijing 100084, Ch ina;
31 State Key L abo rato ry of B iochem ical Engineering, Inst itu te of P rocess Engineering,
Ch inese A cadem y of Sciences, Beijing 100080, Ch ina)
Abstract: Objective　To invest iga te the cu ltu re condit ion s fo r the estab lishm en t of su spen sion cell
lines from C istanche d eserticola callu s1M ethods　A dding differen t k inds and ra t io s of p lan t grow th regu la2
to r to so lid B 5 m edium , the effects of cell age, inocu la t ion size, and p lan t grow th regu la to r on the cell
grow th and the second m etabo lite accum u lat ion, phenylethano id glyco sides (PeG) w ere studied1 Results
·624· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2007205210
作者简介: 欧阳杰 (1971—) , 男, 湖南省安仁县人, 博士, 副教授, 主要从事生化工程方面的研究, 已在国内外发表论文30 余篇。
T el: (010) 62336700　Fax: (010) 62338221　E2m ail: ouyangjoy@ sohu1com