全 文 ：表 1 　野生、退化、复壮蜜环菌对同一天麻生物产量、
天麻素量的影响
Table 1 　Effect of wild , degradative , and rejuvenative A. mel2
lea on yield of G. elata and content of gastrodin
菌号 鲜质量/ g 干质量/ g 天麻素/ %
野生菌种 　A121 444185 290153 01443 8 3
　　　　　A122 452137 301112 (297151 ±6105) 3 3 1 01432 4 (01437 6 ±01005 7) 3 3 1
　　　　　A123 450152 300189 01437 6
退化菌种 　A221 212104 110164 01155 8
　　　　　A222 224138 103127 (107141 ±3177) 01167 2 (01162 0 ±01005 8)
　　　　　A223 219156 108133 01163 0
复壮菌种 　A321 438142 287126 01431 2
　　　　　A322 445155 292132 (290114 ±2160) 3 3 2 01438 2 (01436 7 ±01004 9) 3 3 2
　　　　　A323 440131 291185 01440 7
　　3 3 次测定结果的均值 ; 3 3 1野生菌种组与退化菌种组之间比
较差异极显著 ( P < 01 01) ; 3 3 2复壮菌种组与退化菌种组之间比较
差异极显著 ( P < 0101)
　　3 mean of t hree analyses ; 3 3 1 significant difference between
wild and degradative st rains ( P < 0101) ; 3 3 2 significant differences
between rejuvenative and degradative st rains ( P < 0101)
( P < 0101) ;复壮菌种与退化菌种处理组间差异极
显著 ( P < 0101) ;野生菌种与复壮菌种处理组间无
显著性差异 ,在栽培试验中复壮的蜜环菌与野生的
第一代蜜环菌菌材上的菌索 ( rhizomorp h) 颜色红
亮、粗壮 ,生长态势旺盛 ;而无性繁殖第二代蜜环菌
菌索色泽、生长态势均次于第一代菌索 ;第三代菌索
则更差 ,这一现象符合微生物生长代谢的一般规律 ,
表明栽培天麻的产量与质量不仅取决于麻种的质
量 ,而且与菌种的无性繁殖代数密切相关 ,蜜环菌连
续无性繁殖代数越高其质量越差 ,药农所谓“菌棒只
能用一年的说法”是有科学依据的。
目前实验室条件下采用诱导子实体方法能够使
由于连续无性繁殖退化的蜜环菌菌种复壮 ,其促进
天麻生长及天麻素积累的生物学效能相应得到恢
复。但在天麻实际生产过程中药农需在每个栽培季
节开始前 ,采集优良的野生蜜环菌菌种扩大培养作
为当年的天麻栽培用菌种 ,而对于前一年收获天麻
后剩余的蜜环菌菌材由于缺乏大生产条件下诱发子
实体的适宜方法大多废弃造成浪费 ,今后应加强大
生产条件下栽培天麻后剩余蜜环菌菌材诱导产生子
实体的研究。一旦突破即可形成栽培天麻后剩余蜜
环菌菌材成为美味食用菌榛蘑 (即蜜环菌子实体)的
栽培料 ,实现植物、微生物资源最大限度的利用。
参考文献 :
[1 ] 　王秋颖 , 郭顺星 , 关凤斌1 不同来源蜜环菌对天麻产量影响
的研究 [J ]1 中草药 , 2001 , 32 (9) : 83928411
[2 ] 　孙士青 , 史建国 , 李雪梅 , 等1 连续无性繁殖蜜环菌对天麻
生物产量及天麻素含量的影响 [J ]1 山东科学 , 2008 , 21
(4) : 102121
[3 ] 　程显好 , 郭顺星 1 蜜环菌子实体的诱导和发生条件 [J ]1 菌
物学报 , 2006 , 25 (2) : 30223071
[4 ] 　王淑芬 , 杨金玲 , 朱 　平 ,等1 蜜环菌菌种的复壮研究 [J ]1
中国中药杂志 , 2008 , 33 (2) : 12121231
[5 ] 　谢笑天 , 郑　萍 , 李海燕 , 等1 反相 HPLC 法测定天麻中药
材中天麻素含量 [J ]1 云南化工 , 2004 , 31 (4) : 232251
刺五加叶柄的体细胞胚胎发生研究
邢朝斌1 ,劳凤云2 ,田春迎1 ,王建石1 3
(11 华北煤炭医学院 生物科学系 ,河北 唐山 　063000 ; 21 华北煤炭医学院 药学系 ,河北 唐山 　063000)
摘 　要 :目的 　以来源广泛、原植物药用成分量可测定的刺五加叶柄为外植体 ,研究刺五加体细胞胚胎发生情况 ,
为实现药用成分高产刺五加的快速繁殖奠定基础。方法 　以 3 年生植株萌发 15 d 以内的刺五加复叶叶柄为外植
体 ,考察 2 ,42D 和 BA 对刺五加体细胞胚胎发生的影响。结果 　28 d 培养后 ,2 ,42D 115 mg/ L + BA 110 mg/ L 处
理的叶柄外植体中 7114 % 直接产生或经由愈伤组织间接产生了 815 个体胚。两种产生方式均可在诱导培养基中
进行 ,但间接发生比例较少。转入相同或降低 2 ,42D 质量浓度的培养基后 ,体胚渐次发育成熟。同时新的体胚也
在逐渐产生 ,经由间接途径产生的体胚所占比例也随之上升。结论 　刺五加可以通过萌发 15 d 以内的复叶叶柄
外植体实现体细胞胚胎发生 ,体胚诱导率取决于 2 ,42D 和 BA 的质量浓度。
关键词 :刺五加 ; 叶柄 ; 体细胞胚胎 ; 2 ,42D ; BA
中图分类号 :R28211 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821302204
·2031· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
3 收稿日期 :2008210209　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30701086)
作者简介 :邢朝斌 (1975 —) ,男 ,河北省定州市人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事药用植物细胞工程方面的研究。
Tel : (0315) 3726238 　E2mail : xingzhaobin @yahoo. com. cn
Somatic embryogenesis from petiole in Eleut herococcus senticosus
XIN G Zhao2bin1 , L AO Feng2yun2 , TIAN Chun2ying1 , WAN G Jian2shi1
(11Department of Biology , North China Coal Medical College , Tangshan 063000 , China ; 2. Department of Pharmacy ,
North China Coal Medical College , Tangshan 063000 , China)
Abstract : Objective 　The petiole of Eleut herococcus senticosus was used as somatic embryo , which is
widely original plant s wit h t he p harmacological active component s whose content s could be determined , the
somatic embryo in E. senticosus was st udied , t he aim of t his st udy is to p rovide the p roof of E. senticosus
species which have the higher yield of p harmacological active component s. Methods 　U sing t he petiole of
E. senticosus of three years old plant s germinated somatic embryos within 15 d to observe t he somatic em2
bryogenesis of E. senticosus wit h t he 2 ,42D + BA medium. Results 　After cult ured for 28 d wit h 2 ,42D 1. 5
mg/ L + BA 1. 0 mg/ L , 71. 4 % of t he petiole somatic embryos were directly p roduced or 8. 5 embryos in to2
tal were p roduced via callus. Both of t he two met hods could be used in the elicitation medium , but t he per2
centage of indirect p roduction was smaller . After t ransforming into t he same or t he lower concent ration of
2 ,42D medium , t he somatic embryos gradually mat ured. At t he same time , t hose of t he new somatic em2
bryos were also produced , t he percentage of t he somatic embryos which were produced by indirect way was
increased wit h it . Conclusion 　U sing t he petiole of E. senticosus germination wit hin 15 d could make so2
matic embryogenesis. It confirms t hat t he somatic embryogenesis and t he bodybmeryos inductivity depend
on t he 2 , 42D and BA concent ration.
Key words : Eleut herococcus senticosus Harms ; petiole ; somatic embryos ; 2 ,42D ; BA
　　刺五加 Eleut herococcus senticosus Harms 是我
国医药珍品 ,根、茎、叶均可入药[1 ] 。历代本草医药
记载 ,其有益气健脾、补肾安神之功效 ,已载入《中国
药典》(1977 年版) 。自 70 年代末以来以刺五加为
原料生产的各种制剂和饮料等产品远销国外 ,因而
使刺五加资源消耗与日俱增[1 ,2 ] 。在自然状态下刺
五加有性生殖能力弱[2 ] 、无性繁殖困难[3 ,4 ] ,1992 年
出版的《中国植物红皮书》已把刺五加列为了渐危物
种。近年来利用植物组织、细胞培养快速繁殖刺五
加和生产其药用成分的研究成为热点[ 5 ] 。但刺五加
的茎尖外植体繁殖系数低[4 ] ,不能满足生产需要。
经由愈伤组织也难以形成不定器官[6 ] 。邢朝斌
等[ 5 ] 、宋永贤等[7 ] 以经过层积处理的刺五加种子的
合子胚为起始材料获得了体细胞胚胎。但由于刺五
加自身产生种子的能力有限 ,且种子萌发形成的植
株药用成分的合成能力也不能早期鉴定 ,因此通过
合子胚的体细胞胚胎发生难以实现药用成分高产刺
五加的快速繁殖。本实验以来源广泛、原植物药用
成分的量可测定的刺五加叶柄为外植体 ,研究了其
体细胞胚胎的发生。
1 　材料与方法
111 　材料 :2007 年 3 月采集吉林省伊通满族自治
县西苇镇天然分布的 3 年生刺五加 ,假植于华北煤
炭医学院校园内 ,经药学系韩刚教授鉴定为五加科
植物刺五加 Eleut herococcus senticosus Harms。取
新萌发 15 d 以内的掌状复叶 ,去除小叶及小叶柄 ,
以复叶叶柄为试验材料。
112 　方法
11211 　外植体 :将复叶叶柄流水冲洗 30 min ,70 %
酒精 2 min ,无菌水洗 3 次 ,011 % HgCl2 5 min ,无
菌水洗 4 次 ,在超净工作台中吸干表面水分。用解
剖刀分成 015 mm 小段 ,接种于诱导培养基。
11212 　体细胞胚胎诱导 :诱导培养基为 MS (含蔗
糖 30 g/ L 、琼脂 6 g/ L 、p H 5. 8) ,根据实验要求设
置 015、110、115、210 mg/ L BA 与 2 ,42D 的不同组
合。采用 50 mL 三角瓶 ,每瓶 20 mL 培养基 ,每处
理 30 瓶。(25 ±1) ℃暗培养 ,待体胚产生后转移
至 011 mg/ L 2 ,42D MS 培养基中光培养 ,诱导体胚
发育成熟。光照强度为 2 000 lx ,每日光照 16 h。
2 　结果
211 　愈伤组织的诱导 :叶柄外植体在诱导培养基中
培养 5 d 左右 ,自切口处开始膨大 ,7 d 后便可观察
到白色、明亮的愈伤组织。之后逐渐转变为淡黄色 ,
结构紧密的愈伤组织 ,且表面产生颗粒状突起 (图
12a) 。当单独添加 2 ,42D ,或同时添加的 BA 质量
浓度较低 (110 mg/ L) 时 ,愈伤组织的发生率与 2 ,
42D 的质量浓度呈正相关 ;当同时添加高质量浓度
BA 时 (115、210 mg/ L) ,全部外植体均产生了愈伤
组织 ,但后者产生的数量更多。BA 对愈伤组织产
生的影响与 2 ,42D 相同 (表 1) 。
212 　体细胞胚胎发生的方式 :培养 20 d 后 ,自叶柄
外植体切口中未被愈伤组织覆盖的韧皮部与木质部
·3031·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
交界处开始产生体细胞胚胎 (图 12b) ,即体胚经由
叶柄的形成层切口处直接产生。除此以外 ,体胚尚
可通过先期产生的愈伤组织间接产生 (图 12c) 。两 种产生方式均可在诱导培养基中进行 ,但间接发生比例较少 ,转入降低 2 ,42D 质量浓度的继代培养基后 ,比例随之上升。
a2愈伤组织　b2直接产生的体胚　c2间接产生的体胚
a2callus 　b2directly f rom embryos 　c2indirectly f rom embryos
图 1 　刺五加叶柄的体细胞胚胎发生
Fig. 1 　Somatic embryogenesis from petiole in E. senticosus
213 　激素对体细胞胚胎发生的影响 :在未添加任何
激素和仅添加 BA 的培养基中 ,经 10 周培养后 ,所
有外植体均未见有体胚的产生。28 d 培养后 2 ,42D
115 mg/ L + BA 110 mg/ L 使 7114 % 的外植体产生
了体胚 ,显著高于其他处理的体胚发生率 ,除 BA 为
210 mg/ L 外 ,115、210 mg/ L 2 ,42D 与各质量浓度
BA 组合的体胚发生率均高于与 110 mg/ L BA 组
合的发生率 ,且前者之间的诱导率没有差异显著性。
在体胚的数量上 ,附加 2 ,42D 115 mg/ L + BA 115
mg/ L 处理的最高 ,平均每个外植体上产生了 815
个体胚 (表 1) 。
表 1 　激素对体细胞胚胎和愈伤组织的影响 (培养 28 d)
Table 1 　Effect of hormone on somatic embryos
and callus ( cultured for 28 d)
激素/ (mg ·L - 1 )
2 ,42D BA 体细胞胚胎发生率/ % 数量/ 个 愈伤组织发生率/ % 数量
0 0 0 0 0 无
11 0 0 0 513 少
11 5 0 0 161 2 较少
21 0 0 0 181 7 较少
11 0 0 0 0 816 少
11 0 261 7 11 0 801 0 3 较多
11 5 381 9 11 8 941 4 3 3 多
21 0 331 3 11 9 1001 0 3 3 多
11 5 0 61 7 21 0 281 5 少
11 0 711 4 3 3 81 5 3 3 1001 0 3 3 较少
11 5 531 3 3 31 9 3 1001 0 3 3 多
21 0 111 8 11 7 1001 0 3 3 中等
21 0 0 111 8 11 8 321 3 少
11 0 661 7 3 21 3 1001 0 3 3 中等
11 5 641 7 3 21 5 1001 0 3 3 较多
21 0 571 1 3 21 1 1001 0 3 3 多
　　3 P < 0105 　3 3 P < 01 01
214 　体细胞胚胎的诱导成熟 :培养早期产生的体胚
在原培养基中随着培养时间的推移 ,依次经心形胚、
鱼雷形胚等阶段后 ,渐次发育成熟。与此同时 ,新的
体胚也在逐渐产生。培养 28 d 时 ,上述外植体整体
继代入附加了 011 mg/ L 2 ,42D 的 MS 培养基中 ,
先前产生的体胚逐渐发育成熟。
3 　讨论
　　诱导体细胞胚胎发生时 ,对于绝大多数植物而
言 ,2 ,42D 都是诱导胚性愈伤组织必不可少的。在
胚性愈伤组织形成后 ,应降低 2 ,42D 的量或去除 2 ,
42D ;否则 ,胚状体便不能正常生长[8 ] 。而刺五加与
这些植物不同 ,在植物激素作用下 ,来自刺五加成熟
胚的外植体 ,不经过胚性愈伤组织阶段 ,而由外植体
直接产生体胚[5 ,7 ,9 ] ,经由胚性愈伤组织产生的体胚
仅 1 例[5 ] 。在本实验中 ,刺五加的复叶叶柄 ,在 2 ,
42D 的作用下多数以类似于来自成熟胚外植体的发
育方式直接产生体胚 ,但同时也产生了较前者更多
的胚性愈伤组织 ,且在先期诱导阶段和继代后均可
由此愈伤组织产生体胚。产生的体胚在原培养基
中 ,或者降低 2 ,42D 质量浓度的培养基中均能促进
体胚成熟和新体胚产生的特性也与成熟胚外植
体[5 ,9 ]的特点相同。
目前关于刺五加体细胞胚胎发生的报道中 ,起
始外植体均来自胚及胚相关组织[5 ,7 ,9 ] ,并表现出来
自合子胚时期的外植体诱导产生体胚所需要的 2 ,
42D 质量浓度比来自幼苗外植体的低 ,且萌发时间
越久 ,成胚能力越低[5 ] 。即细胞的分化程度越高 ,体
胚发生能力越低。与合子胚的胚性组织具有相同分
化程度的顶端分生组织可分化产生幼叶原基 ,进而
形成幼叶、成熟叶。本实验所用材料虽取自萌发后
3 年 (3 年生)的刺五加 ,但新萌发的复叶叶柄同样为
分化程度较低的组织类型。因而萌发 15 d 以内的
·4031· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
复叶叶柄可以产生体胚 ,而萌发 30 d 以后的叶柄在
整个实验周期内均未见胚胎发生 ,产生的愈伤组织
量也极少。
参考文献 :
[ 1 ] 　吉林省中医中药研究所等编著 1 长白山植物药志 [ M ]1 长
春 : 吉林人民出版社 , 19821
[ 2 ] 　祝　宁 , 卓丽环 , 臧润国1 刺五加 ( Eleutherococcus sentinco2
sus) 会成为频危种吗 ? [J ]1 生物多样性 , 1998 , 6 (4) : 2532
2591
[ 3 ] 　赵淑兰 , 沈育杰1 刺五加绿枝扦插繁殖研究 [J ]1 特产研究 ,
2003 , 25 (3) : 1221
[ 4 ] 　张喜春 , 刘宏伟 , 张　弘 , 等1 影响刺五加茎尖培养的因素 [J ]1 东北林业大学学报 , 1996 , 24 (6) : 10721101[5 ] 　邢朝斌 , 沈海龙 , 赵丽娜 , 等1 刺五加的体细胞胚胎发生研究 [J ]1 中草药 , 2006 , 37 (5) : 76927721[6 ] 　李学宝 , 金　波 1 刺五加愈伤组织的遗传转化 [J ]1 华中师范大学学报 (自然科学版) , 1995 , 29 (4) : 49424971[7 ] 　宋永贤 , 孙　利 , 孙金元1 刺五加离体培养中胚状体的诱导[J ]1 时珍国医国药 , 2005 , 16 (5) : 44024421[8 ] 　崔凯荣 , 邢更生 , 周攻克 , 等1 植物激素对体细胞胚胎发生的诱导与调节 [J ]1 遗传 , 2000 , 22 (5) : 34923541[9 ] 　Choi Y E , Yang D C , Yoon E S1 Rapid propagation ofEleutherococcus senticosus via direct somatic embryogenesisf rom explant s of seedlings [J ]1 Plant Cell , Tissue Org Cult ,1999 , 58 : 932971
不同款冬花药材中槲皮素和山柰素的定量分析及 HPLC 指纹图谱研究
马致洁1 ,2 ,董红红2 ,李振宇2 ,周玉枝2 ,秦雪梅1 ,2 3 ,郭小青2 ,孙海峰2 ,张丽增2 3
(11 山西大学化学化工学院 ,山西 太原 　030006 ; 21 山西大学 化学生物学与分子工程国家教育部
重点实验室中医药现代研究中心 ,山西 太原 　030006)
摘 　要 :目的 　建立款冬花药材中槲皮素和山柰素的定量测定方法 ,测定不同来源的药材中槲皮素和山柰素的量 ,
评价产地、生长方式及炮制对款冬花中槲皮素和山柰素量的影响 ;并建立款冬花中黄酮醇苷类成分指纹图谱 ,为款
冬花质量控制的制定提供依据。方法 　采用 HPLC 建立款冬花药材中槲皮素和山柰素的定量测定方法 ,色谱条
件 :Diamonsil C18 (200 mm ×4. 6 mm , 5μm) ,流动相为乙腈2水 (77 ∶23) ,检测波长 :365 nm。采用 HPLC 法建立
款冬花药材中黄酮醇苷类成分指纹图谱 ,色谱条件 :ODS2BP C18 (200 mm ×4. 6 mm , 5μm) ;流动相 :乙腈2011 %
H3 PO4水溶液梯度洗脱 ;检测波长为 365 nm。结果 　不同产地 ,炮制品与生品之间 ,其槲皮素和山柰素的量差异
较大 ,不同生长方式的药材之间无明显差异 ;不同产地及批次的款冬花药材的指纹图谱相似度较高。结论 　本研
究建立的槲皮素和山柰素的定量测定方法简便、准确、重现性好 ,可用于款冬花药材中黄酮醇苷类成分的质量控
制 ;不同来源的款冬花药材中的槲皮素和山柰素的量有明显差异 ;所建立的黄酮醇苷类成分的指纹图谱方法操作
性强、重现性好 ,可作为款冬花黄酮醇苷类成分指纹图谱研究的基础。
关键词 :款冬花 ; 槲皮素 ; 山柰素 ; HPLC ; 指纹图谱
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821305204
Quantitative analysis and HPLC f ingerprint of quercetin and kaempferide
from different Flos Fa r f a raes
MA Zhi2jie1 ,2 , DON G Hong2hong2 , L I Zhen2yu2 , ZHOU Yu2zhi2 , Q IN Xue2mei1 ,2 ,
GUO Xiao2qing2 , ZHAN G Li2zeng2
(11 College of Chemist ry and Chemical Engineering , Shanxi University , Taiyuan 030006 , China ; 2. Modern Research
Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering Centre for Traditional Chinese
Medicine , Minist ry of Education , Shanxi University , Taiyuan 030006 , China)
Abstract : Objective 　To establish t he method for quantitative analysis of quercetin and kaempferide in
Flos Far f arae , to determine t he content s of quercetin and kaempferide in Flos Far f arae f rom various
habitat s , to evaluate t he effect s of habitat s , growt h way , and p rocessing on the content s of quercetin and
kaempferide in Flos Far f arae , and to establish the fingerp rint of flavone glycosides in Flos Far f arae , so
as to p rovide the information for quality cont rol of Flos Far f arae. Methods 　Quantification of quercetin
and kaempferide in Flos Far f arae was performed by H PL C on Diamonsil C18 column (200 mm ×4. 6 mm ,
5μm) using acetonit rile2H2 O (77 ∶23) as mobile p hase and detected at 365 nm. And fingerp rint analysis
of flavone glycosides in Flos Far f arae was performed by HPL C on ODS2BP C18 column (200 mm ×4. 6
·5031·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
3 收稿日期 :2008210217　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :马致洁 (1983 —) ,天津人 ,在读硕士 ,主要从事中药质量控制及中药代谢组学研究。E2mail : zhijiesy @yahoo. com. cn3 通讯作者 :秦雪梅 ,教授 ,研究生导师。Tel : (0351) 7011202 　E2mail : qinxm @sxu. edu. cn