全 文 ：　　由于冬虫夏草为我国高原特产,每年出口量极
大。据报道, 2006年上半年,中药材和饮片累计出口
1. 80亿美元,其中冬虫夏草占中国大陆出口总值的
90%。故在冬虫夏草药材出口前,应考察进口国对药
材的重金属残留的限度要求。在对药材的砷元素的
限度规定中, WHO、FDA、香港是以每日(周)最大摄
入量(含来源于其他食品或药品的摄入)计算的, 而
加拿大、新加坡、泰国和韩国的标准均不同程度地低
于我国药用植物及制剂绿色行业标准的要求, 但欧
盟的标准最为严格。即使采用限度最为宽松的加拿
大标准,仍有7批来自青海的药材不符合规定。
　　鉴于本实验中多数天然冬虫夏草的砷量超过《中
国药典》和欧盟的标准规定,笔者认为: ( 1)有必要对
出口的天然冬虫夏草药材加强砷元素量的检查(尤其
是出口到欧洲国家)以避免由于砷元素量过高影响出
口而造成的不良影响和经济损失。在天然冬虫夏草的
使用中也应注意避免砷量超标对人体所造成的不良
影响。( 2)有必要开展对冬虫夏草产区土壤和植被的
重金属研究,以确定冬虫夏草药材含砷量高的机制。
( 3)有必要探讨冬虫夏草中微量砷元素的实际存在状
态(有机与无机) ,及对体内代谢的作用与影响。
参考文献:
[ 1]　中国药典 [ S ] . 一部 . 2005.
[ 2]　韩国草药典 [ S ] . (四) . 2002.
[ 3]　石　岩, 王钢力, 林瑞超. 近红外技术测定冬虫夏草中氨基酸
的含量 [ J ] . 药物分析杂志, 2007( 1) : 90.
[ 4]　《中国药典》[ S ] . 二部 . 附录Ⅸ B. 2005.
HPLC法测定云南红豆杉细胞悬浮培养中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ
郭玉婷1 ,张　臻2,张经硕1,王剑文1X
( 1. 苏州大学药学院,江苏 苏州　215123; 2. 南京大学生命科学院, 江苏 南京　210093)
摘　要: 目的　测定经寡聚半乳糖醛酸( o ligo galacturonic acid, OGA )诱导的云南红豆杉Taxus yunnanensis细胞悬
浮培养物中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ( 10-deacety l baccatin Ⅲ, 10-DAB Ⅲ)的量。方法　采用不同质量浓度的OGA 处
理云南红豆杉悬浮培养细胞, 通过RP-HPLC 法测定细胞和培养液中的10-DAB Ⅲ的量, 甲醇-乙腈-水( 2∶3∶8)为
流动相, 检测波长为232 nm。结果　10-DAB Ⅲ在 0. 05～2. 06 Lg 与峰面积线性关系良好,回归方程为Y= 89. 146
X + 27. 067 ( R2= 0. 999 6) , 细胞内、外样品平均回收率分别为 94. 96%、100. 72% , RSD 分别为 0. 44%、0. 81%。
OGA ( 40 Lg/ mL )可显著提高云南红豆杉细胞中10-DAB Ⅲ的量。结论　10-DAB Ⅲ的RP-HPLC 方法可靠简便、重
现性好、灵敏度高, 具有较高的实用价值,可用于对红豆杉细胞诱导培养研究中的分析, OGA 是 10-DAB Ⅲ细胞生
产的有效诱导子。
关键词: 云南红豆杉;细胞培养; 寡聚半乳糖醛酸; 10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ; HPLC
中图分类号: R282. 6　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2008) 01 0118 03
　　云南红豆杉T axus yunnanensis Cheng et L . K.
Fu 株数或蓄积量都占云南3 种红豆杉的99. 6%以
上[ 1] ,其中紫杉醇和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的量高于
同属其他植物[ 2]。10-DAB Ⅲ是红豆杉中的紫杉烷
萜类化合物之一, 不仅自身有抗癌活性,且可作为紫
杉醇及其类似物的合成前体, 其天然储量比紫杉醇
高数十倍,利用10-DAB Ⅲ可合成比紫杉醇抗癌活
性更高的tax otere[ 3] ,因此对10-DAB Ⅲ的开发利用
具有更广泛的前景。近年来,细胞培养技术已成为红
豆杉研究的重要手段, 通过细胞培养[ 4]、诱导技
术[ 5]、前体饲喂 [ 6]、生物反应器 [ 7]等各种生物技术来
生产紫杉醇, 已取得了许多进展。本实验利用RP-
HPLC法测定OGA 诱导云南红豆杉细胞悬浮培养
物中 10-DAB Ⅲ的量,为通过云南红豆杉细胞培养
生产10-DAB Ⅲ提供调控手段和依据。
1　仪器与试剂
岛津LC—10AT 型高效液相色谱系统,自动液
相色谱分离色谱仪(上海琪特分析仪器有限公司) ,
Sk3300H 型超声清洗器(上海科导超声仪器有限公
司) , 电子分析天平( Sartor ius) ,冷冻干燥机(上海市
离心机械研究所) ,单层摇床(太仓市实验设备厂)。
10-DAB Ⅲ对照品(上海同田生化技术有限公
·118· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第39卷第 1期 2008 年1 月
X 收稿日期: 2007-03-20基金项目:江苏省高校自然科学基金项目( 05KJB360120) ;苏州大学医学发展基金项目( EE132514)作者简介:郭玉婷( 1982—) ,女,辽宁锦州人,硕士研究生,研究方向为中药生物技术。
* 通讯作者　王剑文　Tel: ( 0512) 65880025　E-mail: jw w an g@ suda. edu . cn
司, 质量分数> 98% ) , Sephadex G-10( Pharmacia,
MW > 700) , 多聚半乳糖醛酸 ( Fluka ) , 果胶酶
( Fluka) ,甲醇(色谱纯、分析纯)、乙腈(色谱纯) ,三
蒸水,环己烷、二氯甲烷、冰醋酸均为分析纯。实验用
的细胞株由本院生物制药研究室提供。
2　方法与结果
2. 1　色谱条件: 色谱柱为Restek C18柱( 150 mm×
2. 1 mm, 5 Lm) , 流动相为甲醇-乙腈-水( 2∶3∶
8) ,检测波长为232 nm, 体积流量为0. 2 mL/ min,柱
温为35℃,进样量为10 LL。
2. 2　红豆杉细胞的培养及处理
2. 2. 1　细胞的培养:研究用的细胞系是经多次继代
培养的云南红豆杉细胞株。在改良的MS固体培养
基[含蔗糖20 g/ L、萘乙酸( NAA) 0. 5 mg/ L、2, 4-二
氯苯氧乙酸( 2, 4-D) 0. 08 mg/ L、6-苄基嘌呤( 6-BA )
0. 5 mg / L ]上继代培养, 每25天接种一次。将生长良
好的细胞3 g 转入含30 mL MS 液体培养的150 mL
三角瓶中, 25 ℃、110 r/ m in黑暗振荡培养。
2. 2. 2　诱导子的制备:诱导子的制备参照Hu 等方
法[ 8] ,略修改。多聚半乳糖醛酸经果胶酶室温下裂解
20 min,滤过,浓缩后冻干成粗OGA 粉末。将OGA
粉末配成1 g / L 溶液,经Sephdex G-10柱处理滤除
Mw < 700的寡聚物,所得溶液浓缩后用0. 45 Lm 微
孔滤膜滤过除菌,作为OGA 诱导子备用, 测定糖终
质量浓度为285. 53 Lg/ mL。
2. 2. 3　红豆杉细胞的诱导处理:本实验将培养的云
南红豆杉细胞分成对照组及处理组, 处理组设 4种
不同诱导子质量浓度, 分别为20、40、60、80 Lg/ mL,
对照组加入同量双蒸水。每种处理4瓶, 共4个重复。
细胞培养至第17天加入OGA, 继续培养至第24天
收获。
2. 3　溶液的配制
2. 3. 1　10-DAB Ⅲ的提取: 细胞培养液抽滤, 取滤
液8 mL,加入10 mL 二氯甲烷超声振荡后静置8 h,
收集二氯甲烷相, 上相再重复提取2次,合并二氯甲
烷相,于室温下风干。用1 mL 甲醇(色谱纯)溶解,过
0. 45 Lm 滤膜,作为胞外供试品待测。
将抽滤所得的细胞冷冻干燥, 取 100 mg 干细
胞, 于研钵中研磨成粉末状; 加入 20 mL 环己烷研
磨,转至离心管中静置,弃去环己烷相,向沉淀中加
入甲醇和二氯甲烷各10 mL,低温下超声振荡萃取
30 min;加入20 mL 蒸馏水充分混匀后静置10 h;收
集二氯甲烷相,水相加入10 mL 二氯甲烷再重复萃
取 2次; 将3次收集的二氯甲烷相室温下风干, 用1
mL 甲醇(色谱纯)溶解,过0. 45 Lm 滤膜, 作为胞内
供试品待测。
2. 3. 2　对照品储备液的制备:精密称取10-DAB Ⅲ
对照品,配制成1. 03 mg/ mL 对照品储备液。
2. 4　方法的专属性:在拟定的色谱条件下,分别取对
照品溶液及供试品溶液进样测定, 得到特征峰,出峰
时间为6. 490 min,与杂质分离良好,无干扰, 见图1。
* 10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ
* 10-deacetyl b accatin Ⅲ
图1　10-DAB Ⅲ对照品( A)、红豆杉细胞提取物(B)
和细胞外液提取物(C)的HPLC图谱
Fig. 1　HPLC Chromatograms of 10-DAB Ⅲ ref erence
substance (A) , intracellular (B) , and extra-
cellular (C) extract of T . yunnanensis cell
suspension cultures
2. 5　标准曲线与线性范围: 精密吸取对照品储备
液,依次稀释成5. 15、10. 3、20. 6、51. 5、103、206 Lg/
mL 溶液, 用 0. 45 Lm 微孔滤膜滤过, 进样量为 10
LL,每一质量浓度进3次。以10-DAB Ⅲ质量浓度对
峰面积进行回归,得标准曲线方程: Y= 89. 146 X +
27. 067, R
2 = 0. 999 6。结果表明, 10-DAB Ⅲ在
0. 051 5～2. 06 Lg 与峰面积线性关系良好。
2. 6　精密度试验: 取51. 5 Lg/ m 对照品溶液, 重复
进样6次,每次10 LL,测定峰面积值, 结果 10-DAB
Ⅲ峰面积积分值的RSD为1. 31% ( n= 6) ,表明仪器
精密度良好。
2. 7　稳定性试验:精密吸取同一份供试液,间隔3 h
进样1次,每次进样10 LL, 重复6次,测定峰面积值,
结果细胞内、外样品RSD分别为1. 43%、0. 64%。表
明供试品溶液在15 h 内稳定。
2. 8　重现性试验: 任选同一组细胞培养物(本实验
选处理 2组)按照2. 4项方法平行制备4 份供试品
(细胞内+ 细胞外) , 依法测定,计算,结果细胞内、外
样品中10-DAB Ⅲ质量分数的RSD分别为1. 58%、
1. 52%。
2. 9　加样回收率试验: 按2. 3. 1项平行制备供试品
溶液 4份, 各取 100 LL, 分别加入甲醇 100 LL、10-
DAB Ⅲ对照品10 LL(细胞内样品加 10-DAB Ⅲ对
照品 51. 5 Lg/ mL、细胞外样品加20. 6 Lg/ mL) , 混
匀, 进样测定, 结果细胞内、外供试品平均回收率分
·119·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第39卷第 1期 2008 年1 月
别为 94. 96%、100. 72% , RSD 分别为 0. 44%、
0. 81% ( n= 6)。
2. 10　样品测定: 每组细胞培养物按2. 3. 1项方法
制备供试品溶液, 依法进样测定, 每个样品进样 2
次,取平均值,并计算10-DAB Ⅲ的量,结果见表1。
表 1　OGA诱导红豆杉细胞培养中10-DAB Ⅲ的
测定结果( n= 4, A= 0. 05)
Table 1　Determination of 10-DAB Ⅲ in T . yunnanensis
cell suspension induced by OGA
OGA 诱导子浓度/
(Lg·mL- 1)
10-DA BⅢ质量分数
细胞内/ ( mg·g - 1) 培养液中/ ( mg·L - 1)
0 0. 052±0. 001 0. 092±0. 039
20 0. 143±0. 011 0. 151±0. 055
40 0. 178±0. 026 0. 275±0. 059
60 0. 139±0. 022 0. 179±0. 027
80 0. 154±0. 015 0. 219±0. 048
3　讨论
3. 1　本实验建立了HPLC 测定云南红豆杉细胞悬
浮培养物(细胞及胞外液)中10-DAB Ⅲ量的方法。
将10-DAB Ⅲ对照品的甲醇溶液在200～400 nm 内
扫描,结果在232 nm 处有最大吸收,故选232 nm 为
检测波长。同时, 分别采用不同流动相组成:甲醇-
水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水,以及各流动相不同配比
等多种条件下进行洗脱,考察各种流动相对细胞培
养物供试品中10-DAB Ⅲ分离度的影响, 结果发现
以甲醇-乙腈-水( 2∶3∶8)为流动相等度洗脱下,
10-DAB Ⅲ得到良好的分离,见图1。本操作简便可
靠、重现性好、灵敏度高,对红豆杉细胞大规模生产
具有实用价值, 此方法的建立将为云南红豆杉细胞
生产10-DAB Ⅲ开发研究提供依据。
3. 2　诱导作用: OGA 为果胶的不完全酶解产物, 其
单体半乳糖醛酸是组成植物细胞壁中果胶质的主要
成分, 参与细胞壁复杂网架的形成。以OGA 为诱导
物,可促进人参细胞中人参皂苷的合成[ 8] ,但未见其
对红豆杉属植物和紫杉烷类合成诱导作用的报道。本
实验测定结果可见, OGA 可显著提高云南红豆杉细
胞中10-DAB Ⅲ的量, 其中OGA 为40 Lg / mL 时诱导
效果较优,关于OGA 对10-DAB Ⅲ等紫杉烷类化合
物生物合成的诱导作用机制有待进一步探讨。
参考文献:
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[ J ] . P hy siol P lanta, 2003, 118: 414-421.
草叶总黄酮的测定及最佳采收期研究
陈伟光,盛　静X
(嘉兴学院医学院,浙江 嘉兴　314001)
摘　要: 目的　建立 草叶总黄酮的测定方法,并考察总黄酮的量随 草不同采摘时间的动态变化。方法　通过单
因素试验、正交试验, 考察乙醇体积分数、料液比、提取时间对提取液中总黄酮量的影响, 确定最佳提取条件, 然后
在该条件下对不同时间采收的 草叶进行总黄酮提取并进行定量测定。结果　所考察的因素中, 草总黄酮的超
声提取工艺各因素影响程度为: 乙醇体积分数> 提取时间> 料液比; 最佳水平搭配为: A 2B3C3。不同时间采收的
草中总黄酮的量有明显变化。结论　 草中黄酮类成分提取的最佳工艺为 75%乙醇,料液比1∶60, 超声提取50
min。 草总黄酮的量与采摘时间密切相关,以8 月采收量最高。
关键词: 草;总黄酮; 正交设计
中图分类号: R282. 6　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2008) 01 0120 03
·120· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第39卷第 1期 2008 年1 月
收稿日期: 2007-03-15基金项目:嘉兴市科技局科研基金资助项目( 2005AY3042)作者简介:陈伟光( 1952—) ,男,副教授,研究方向为天然药物化学成分的提取分离和定量分析。　T el : ( 0573) 82259796
E-mail: jx weiguang@ 126. com