全 文 ：内生真菌对生物活性物质代谢转化作用的研究进展
王 宇,戴传超*
(江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏 南京 210046)
摘 要:内生真菌广泛存在于健康植物组织内部 ,对生物活性物质具有独特的代谢转化能力。综述内生真菌在降
解宿主体内有毒物质、模拟药物在哺乳动物体内代谢、选择性转化手性化合物等方面的应用。此外, 还阐述了内生
真菌通过自身代谢产生前体活性物质及作为生物诱导子调节植物次生代谢、富集活性产物等方面的研究进展。内
生真菌作为微生物转化体系的独特材料具有广泛的应用前景。
关键词:内生真菌;活性物质;代谢;生物转化
中图分类号: R284 文献标识码: A 文章编号: 025322670( 2009)0921496204
Advances in studies on metabolic transformation of bioactive substances by endophytic fungi
WANG Yu, DAI Chuan2chao
( Jiangsu Provincial Key Laboratory of Biodiver sity and Biotechnology, College of Life Sciences,
Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)
Key words: endophytic fungi; act ive substance; metabolism; biot ransformat ion
生物转化( biotransformat ion)是以微生物或酶作为催化
剂,以可再生资源取代化石资源,大规模生产人类所需的化
学品、医药、能源、材料等, 是解决人类目前面临的资源, 能源
和环境危机的有效手段。生物转化是生物学、化学、过程工
程科学的交叉领域,是利用微生物细胞中的酶高效地、选择
性地通过某种化学反应催化一种化学成分,以获得具有高活
性成分的过程,即利用微生物代谢过程中产生的酶将无效或
低效成分变为有效和高效成分,又称微生物酶法转化[ 1]。微
生物转化具有传统化学工艺无可比拟的优越性,人们普遍认
为生物催化与生物转化将是生物技术革命的第三次浪潮[ 2]。
内生真菌是植物体内最主要的生物类群,存在于所有健
康植物组织中。由于其特殊的生活史,内生真菌引起了国内
外广泛的关注和研究,但目前对于内生真菌参与的生物活性
物质代谢及转化还未引起广泛的关注。本文着重阐述内生
真菌对植物活性成分的修饰改变以及内生真菌通过自身代
谢产生与宿主植物相同、相似的前体物质或活性成分等方面
的研究进展。
1 植物内生真菌研究进展
有关植物内生真菌的定义,现在普遍接受的一般是指那
些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各
种组织和器官内部的真菌,不仅包括了互惠共利的和中性的
共生真菌,也包括了那些潜伏在宿主体内的病原菌。研究发
现几乎所有的植物组织中都有内生真菌的存在[ 3]。在进化
过程中,内生菌在与宿主植物长期共存逐渐形成了各种对宿
主的适应机制, 除了从宿主吸收营养物质外, 内生真菌还能
通过自身的代谢活动减轻宿主产生的有毒物质, 增强其自身
生态位的优势;此外还能为宿主提供一些有益的特性, 如促
进植物生长发育, 增强植物对不良环境的各种抗性等[ 4]。通
过建立体外共培养技术, 观察内生真菌与无菌苗或愈伤组织
共培养时的各自生理反应, 表明内生真菌的某些化学成分
(多糖、糖蛋白等)作为外源信号分子能明显促进、转化或自
身合成宿主体内生物活性物质, 这成为目前很好的研究方
向。相比传统的化学合成法, 通过自然选择发现新的活性结
构物质明显比通过组合化学研究要优越得多。但是多数自
然产物只具有有限的特定功能, 因此研究新颖的次级代谢产
物有必要专注于具有特定生活史的微生物群体上。
2 利用生物转化体系对活性成分进行结构修饰的研究
中药活性成分是中药治疗与预防疾病的物质基础,也是
药物化学家寻找新的药理活性分子的重要来源。人们已经
从中药中分离纯化出数以万计的活性化合物, 其中许多化合
物被成功地开发成为药物, 诸如利血平、地高辛、青蒿素、麻
黄碱、紫杉醇等。但很多中药活性成分由于量低、药理作用
不显著、不良反应大、水溶性差等原因极大地限制了其广泛
应用[ 5]。大多数的天然活性物质都具有极其复杂的结构, 其
理化性质和生物活性都与其分子的立体构型有关 ,尤其是生
物活性对结构要求很严格。而应用通常的化学方法进行人
工合成或结构修饰改造都是比较困难的。生活转化反应几
乎包括所有的体外有机化学反应:羟基化、氧化、脱氢、氢化、
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* 收稿日期: 2009204202 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30770073, 30500066)作者简介:王 宇( 1986 ) ) ,男,江苏南京人,硕士研究生,主要从事内生真菌与宿主植物相互关系方面研究。 T el : 13770541582
E2mail: wycarl@163. com
* 通讯作者 戴传超 T el: ( 025) 85891382 13951722479 E2mail: daich uan chao@njnu. edu. cn
还原、水解、水合、酯化、酯转移、脱水、脱羧、酰化、胺化、异构
化和芳构化等,而且生物转化还可以合成化学上难以合成的
物质,特别是复杂的天然活性物质, 在药物合成上具有重要
的应用价值[6]。
若将生物催化技术引入天然化学成分的快速筛选研究,
通过生物转化对从已发现具活性的天然化合物进行结构修
饰,以期发现新的高活性、高可溶性、低毒副作用的优质药物
先导化合物具有重要意义。因此,余伯阳等[ 7]提出将天然药
物的生物转化研究与组合化学理论相结合建立生物组合化
学( bio2combinatoria l chemist ry)的研究方法。通过筛选高转
化效率的活性微生物, 提供微生物生长代谢最适环境, 实现
对药用活性成分的生物转化, 以期达到增强中药疗效、产生
新的活性、提高活性成分的量、降低药物不良反应和浓缩活
性成分等效果[8]。
生物转化在新药研制方面有广泛的应用,马晶等[5]在国
内首次利用刺囊毛霉对甘草次酸进行微生物转化,优化了转
化条件,得到主产物 7B2羟基甘草次酸, 解决了甘草次酸及其
水解产物长期服用产生的不良反应,为进一步研究甘草次酸
的代谢及新药开发提供理论指导。董玫等[9]研究发现, 六味
地黄丸全成分生物转化液对小鼠肝癌 H22 细胞的生长抑制
率达到 33% ,而等量的六味地黄丸煎剂则无明显抑瘤作用。
陈有根等[10]利用灰色链霉菌 S trep tomyces g riseus在转化培
养基中首次得到了一个新的青蒿素转化产物 9A2羟基青蒿素
( 9A2hydroxyartemisinin, QH S21) , 该化合物的结构与用化学
改造方法所得到的生物结构不同, 即羟基取代位置不是在
12 位,而是在 9 位。体外抗疟活性研究表明, 9A2羟基青蒿素
具有较强的抗疟活性,从而改变了以往半合成青蒿素的衍生
物都是在双氢青蒿素的羟基上进行取代反应,需引入其他基
团的状况。
综上可见微生物转化具有诸多优势,但以往的生物转化
体系大都是利用筛选到的真菌或细菌对已有活性成分进行
结构改造,具有一定的盲目性, 缺乏相关的选择性,而植物内
生真菌由于其特定的生活环境,经过长期进化使其在活性物
质代谢转化方面具有一些特殊的作用。
3 内生真菌对生物活性成分代谢转化作用的研究
3. 1 内生真菌对宿主体内有毒物质的降解转化作用:为了应
对微生物病原体的入侵,植物将产生一系列的防御机制,包括
产生各种毒性代谢产物。这些次级代谢产物同样也产生于健
康植物中以随时应对病原体的入侵。内生真菌生活在植物体
内, 必需应对植物体产生的毒性防御产物,各种适应性的生物
降解能力及一系列的特殊酶系使得它们能够生存在这种特殊
环境下[ 11]。内生真菌对植物组成型次生代谢产物的生物转
化能力在一定程度上也决定了其宿主的范围,而内生真菌作
为目前未被广泛研究转化类群越来越受到广泛重视。
苯甲酰喹( benzoxiquine)是一种独特的代谢产物, 出现
于禾本科、爵床科、玄参科植物中,其作为一种防御物质应对
各种虫害包括细菌、真菌或昆虫的侵入,这在禾本科谷类作
物中已广泛证实。当细胞的完整性被破坏时异羟氧酸
( hydroxamic acids)迅速转化为 22苯并噻唑啉酮 ( 22benzox2
azolinone, BOA) 及 62甲氧基2苯并噻唑啉酮 ( 62methoxy2
benzoxazolinone, MBOA) , 因此入侵的病原菌或真菌便被具
有毒性的 BOA 和 MBOA 所抑制。
Zikmundova 等[ 11] 从爵床科植物 Ap helandra tetr agona
(Vahl)分离到 4 株内生真菌, 通过 H PLC、MS、NMR分析, 接
骨木镰刀菌 Fusar ium sambucinum 能将 BOA、HBOA 降解为
N2( 22羟苯基)丙酰胺酸; P lectospor ium tabacinum、Gliocladium
cibotii、Chaetosphaer ia sp1 能将 BOA、HBOA 降解为 22羟基2
N2( 22羟苯基)乙酰胺、N( 22羟苯基)乙酰胺等无毒物质, 体现
了内生真菌对宿主体内有毒物质的脱毒过程。
3. 2 内生真菌模拟药物在哺乳动物体内代谢的转化过程:
白桦脂酸( betulinic acid)是存在于许多植物体中的萜类化合
物, 具有抗癌、抗 HIV 等药理活性。桦木酮酸 ( betulonic
acid)是其结构类似物, 也具有相似的特性。为了获得潜在
药理活性, Denise 等[ 12] 从法国梧桐 P la tanus or ienta lis L1
的树皮和叶片中分离到 3 株内生真菌 Ar throbotrys、Chaeto2
p homa 和Dema tium, 它们分别能将桦木酮酸转化为 32oxo2
7b2hydroxylup220 ( 29)2en2282oic acid、32oxo2252hydroxylup2
20 ( 29)2en2282oic acid 等, 并且 Chaetop homa 和 Dema tium
都能将白桦脂酸转化为桦木酮酸。而整个转化过程及产物
很可能与白桦脂酸、桦木酮酸在哺乳动物体内代谢相似, 为
研究药物代谢提供了很好的依据。
3. 3 内生真菌对手性化合物的转化作用 :内生真菌生物转
化体系具有诸多优势, 不仅仅因为它们生长迅速,极容易产
生大量胞内、胞外酶,更因为在很多情况下, 它们对对映异构
体具有选择性, 能够从外消旋混合物中获得手性化合物。
Keyller 等[ 13]研究了内生真菌对药物活性成分的立体
选择性转化。甲硫达嗪 (T HD)是一种神经阻滞剂, 对于治
疗精神分裂症及其他神经性扰乱具有很好的疗效。THD 的
立体异构性十分重要, 右旋结构通常显示其神经方面的药
效, 它在体内能转变为 THD222SO 结构, 随后继续被氧化成
THD222SO2 , T HD222SO和 THD222SO2 是具有药理活性的
代谢产物;而另一种经硫氮杂苯环氧化作用形成的 THD252
SO 则具有毒性。实验证明, 从肿柄菊 Tithonia diver sif olia
A1 Gray、Viguier a ar ena r ia 及 Viguier a robusta 3种植株中
分离得到的 4 株内生真菌拟茎点霉属(P homopsis sp1 )、Di2
apor the phaseolorum、烟曲霉 Aspergillus f umiga tus, 炭疽
菌 Glomerell a cing ula ta 都具有立体选择性的转化作用。它
们分别能将 THD 最大限度转化为 ( S, R )2THD222SO、( R,
R)2THD222SO、(R, S)2THD222SO 及( R)2THD252SO( SE) +
( S)2THD252SO( FE)。这种由相同的前体物质经代谢转化
后产生多种不同结构类型的相似产物, 体现了内生真菌立体
选择性转化作用, 也是生物转化体系相对于化学合成法最大
的优势之一。
黄烷类化合物是一种自由基清除剂, Agusta 等[ 14]从茶
树叶片中提取了 5 种不同结构的化合物, 均属于黄烷类化合
物。从山茶中分离的内生真菌腐皮壳菌 Diaporthe sp1 可立
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体选择性的氧化黄烷类化合物结构中第 4 位 C原子,提供一
个 32OH 的结构。随后的实验证明腐皮壳菌的生物氧化作
用依赖于胞内酶利用外界分子氧进行的。
目前影响微生物(内生真菌 )转化的因素主要包括高转
化能力菌株的筛选、培养基组成的优化配置, 及外界转化影
响因子的干扰, 如转化时间、投料时间、金属离子、pH、温度
等。针对上述问题,多数研究者认为今后微生物转化的研究
发展方向应致力于优良菌种的选育、转化培养基的优化、转
化条件的优化和控制、多菌种混合转化的研究、新型发生器
的设计及转化产物纯化条件的优化和新剂型的研究等几方
面[15]。由于内生真菌具有特殊的生活史, 它与植物长期共
存形成了相互依赖的关系,在分离出植物体后是否还具有显
著的代谢转化能力,怎样模拟植体环境,让其保持高效的转
化能力是今后研究的主要方向。
4 内生真菌通过自身代谢产生前体物质或活性成分的研究
宿主植物与其内生真菌由于长期共生, 关系十分密切,
相互影响很大。很多实例已证实,它们之间具有相同次生代
谢产物合成的途径,获得了相关基因的直接传递, 生活在共
同环境中经长期直接接触而传递吸收遗传物质。因此, 植物
体内的内生真菌在生长代谢过程中能够产生与宿主细胞相
同或相似的生理活性物质[16]。植物的多样性、复杂性和特
殊性使源于其中的内生真菌也同样具有多样性、复杂性和特
殊性,因而内生真菌所产生的次级代谢产物化学结构特殊、
生物活性多样,活性化合物的结构类型远超出其植物代谢产
物的范围,已成为寻找新生物活性物质的重要新资源[ 3] , 在
农业和医药工业中具有重要的应用潜力。近年来,随着我国
药用植物资源的日益匮乏,植物内生真菌及其活性物质的研
究成为了药物研发的重要课题,对植物内生真菌的研究将有
利于我国微生物药物的开发和珍稀植物资源的保护[ 16]。
自从 1993 年, Stier le 等[ 17] 从药用植物太平洋红豆杉
Taxus brevif olia Nutt1 树皮中分离到 1 株具有合成与宿主
相同抗癌药物紫杉醇的内生真菌 T axomyces andreanae, 内
生真菌的研究逐渐成为热点。Barbara等从草本和木本植物
中分离了 6 500 多株内生真菌, 以寻找生物活性物质, 并通
过实验研究认为多数活性物质都最初始于几种不同的生物
合成途径,如类异戊二烯、多聚乙酰等,并属于几种不同结构
类型的化合物或其衍生物,如萜类化合物、固醇、醌、酚类、细
胞公弛素及恩镰孢菌素等。
内生真菌在生长过程中会产生各种各样的酶,如纤维素
酶、蛋白酶、酯化酶等。酶是一类具有高效率的生物催化剂,
可以使复杂的化学反应在常温、常压下迅速完成。丰富而强
大的酶系可以将植物内的成分分解转化形成新的活性成分,
产生新的药效。内生真菌代谢转化生物活性物质可通过下
述途径来生产: ( 1)内生真菌以某种有效成分为前体物质, 自
身代谢形成新的化合物; ( 2)内生真菌在生长过程中产生丰
富的次生代谢产物,有些次生代谢产物自身就是功效良好的
药物; ( 3)内生真菌的次生代谢产物和某些活性物质发生化
学反应生成新的化合物; ( 4)在特殊环境中内生真菌也有可
能改变自身的代谢途径, 产生新的活性成分或改变各活性成
分的相互比例; ( 5)内生真菌的分解作用有可能将有毒物质
进行分解, 从而降低药物的毒副作用[19]。
植物内生真菌代谢产物的类型与其宿主植物息息相关。
从植物内生真菌代谢所产生的各种活性成分来看 ,不同属的
植物因其内环境不同, 所需要的能够帮助其生长的化合物也
不同, 因此寄生在不同属植物中的即使同属的内生真菌所产
生的化合物也不相同。而同属植物一方面其内环境是相同
或相近的, 另一方面所需要的有助于其生长的化合物是相同
或相近的, 因此即使寄生在其体内的不同属内生真菌也能够
产生相同或相近的化合物。植物内生真菌与寄主植物之间
的化学生态学关系即体现在植物内生真菌为其寄主植物提
供生长所需要的化合物[ 20]。植物内生真菌产生的生理活性
物质中, 生物碱是最重要的一类。从香港红树 Avicennia
ma r ina ( Forsk1 ) Vierh1 种子中分离出的内生真菌 2524 号,
在其发酵液中分离到 2 个神经酰胺: ( 2, 32dihydroxytet raco2
sanolyamino)21, 32dihydroxy2octadecane 和 ( 2, 32dihydroxy2
docosanoylamino)21, 32dihydroxy2octadecane, 二者均为细胞
内重要的第二信使[ 21]。长春花 Ca tha r anthus roseus ( L1 )
G1 Don 内生真菌 CY3 可代谢产生长春新碱( vicristine) , 长
春新碱是一种有效的抗肿瘤药物[22]。内生真菌代谢产物中
萜类化合物也较多, 雷公藤 T r ipteryg ium wilf ordii H ook1
f1 中内生真菌串珠镰孢胶孢变种 Fusar ium monilif orme
va r1 subgl utinar is代谢物中存在 2 种二萜类化合物 subglu2
tinol A 和 subglutinol B, 均具有免疫抑制作用, 且无细胞毒
性[ 23]。此外,还从植物内生真菌中分离出具有生物活性的
香豆素类、木质素类化合物等。
内生真菌除了能够代谢产生药理活性成分, 从其发酵液
中提取活性物质, 也是一种重要的应用。Souwalak 等[ 24] 从
藤黄属植株中分离到 51 株内生真菌,根据 ITS序列分析, 分
别属于针尾曲霉 Asp ergil lus aculea tus、弯孢(霉)属( Curvu2
la ria sp1 )、青霉属(P enicil lium sp1 )、拟茎点霉属 (P homop2
sis sp1 )等。80%的发酵液或菌丝提取物具有生物活性, 主
要包括抗分枝杆菌、抗疟、抗病毒、抗增殖、抗氧化、清除羟自
由基的活性。H idayat 等[25] 从树状欧石南 Er ica a rborea L1
分离到一株未知的子囊菌, 其发酵液经醋酸乙酯萃取后具有
很强的抗真菌活性, 对灰葡萄孢菌( Botrytis ciner ea )特别有
效;此外对藻类也有杀灭作用, 在环境保护上极具潜力。Li
等[ 26]从几种中国传统药用植物中分离到 130 株内生真菌,
其中 9. 2%的发酵液提取物具有抗癌活性, 30%具有抗真菌
活性, 一些还具有光谱抗菌活性, 充分说明了中国传统药材
中的内生真菌具有合成、转化各种新颖的生物活性物质的潜
力。Siva等[27]从雷公藤中分离到多株内生真菌, 经醋酸乙
酯萃取其发酵产物后, 发现有多株真菌对人类外周血单核细
胞( PBMC)的增殖具有抑制作用, 且无细胞毒性, 提示真菌
提取物能够提供大量显著的免疫调节物质。
5 内生真菌作为生物诱导子的应用
内生真菌除了参与活性物质转化及自身代谢产生活性物
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质外,还可作为生物诱导子来调节植物次生代谢,从而获得人
类所需的活性产物。王剑文等[ 28]研究发现对黄花蒿 Ar temi2
sia annua L1 内生胶孢炭疽菌 Colletotr ichum gloeosp or ioides
菌丝体进行提取纯化,得到内生菌寡糖提取物,加入到黄花蒿
发根培养系统中可显著促进发根青蒿素的合成,青蒿素产量
可达 13. 15 mg/ L,比同期对照产量提高51. 63%。
但是对于诱导子的作用机制, 目前只是大体的推测, 并
没有彻底地阐明。由于控制某些次生代谢产物合成的关键
酶还没弄清楚,很难进行有针对性的筛选对其起作用的诱导
子。此外,如果清楚诱导子与代谢产物的结构和功能关系,
就可以选择特定的诱导子去刺激特定的植物次生代谢物的
合成,否则, 筛选诱导子就具有很大的盲目性。另外, 在诱导
子的纯化和结构分析方面也有待进一步研究,如果将人工合
成的较纯的诱导子用于大规模生产次生代谢物,将会使次生
代谢物的产量大大提高, 同时降低生产成本, 它所带来的经
济和社会效益将是相当可观的[29]。
6 展望
内生真菌的独特生境使其相对于其他微生物在生物转
化领域更具目的性和选择性,因此内生真菌将是微生物转化
的一个重要材料,其在合成具有生物活性的代谢产物方面将
具有巨大的潜力。今后,一方面可以从生长在极端环境的植
物中分离更加新颖的内生真菌;另一方面从众多的内生真菌
中寻找更加有效的生物活性化合物;以及对已知产生活性成
分的内生真菌进行遗传改良和代谢调控开展研究,以提高活
性成分的产量,为大规模生产创造条件。
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#1499#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40卷第 9期 2009 年 9 月