全 文 ：图 3 胭脂树橙对 PPARC蛋白表达的影响
Fig. 3 Effect of bixin on expression of PPARCprotein
表 1 胭脂树橙对 PPARC蛋白表达相对强度的影响
Table 1 Relative intensity of bixin on expression
of PPARCprotein
组 别 质量浓度/ ( mg # L- 1) 条带强度
对照 - 11 000 ? 01 050
胭脂树橙 01 4 11 150 ? 01 058
21 0 11 311 ? 01 066
41 0 11 779 ? 01 089*
81 0 21 511 ? 01 126* *
与对照组比较: * P< 0105 * * P< 01 01
* P< 01 05 * * P < 01 01 v s cont rol group
橙处理后的细胞 PPARC蛋白的表达量为 11 779 ?
01 089 ( P < 01 05) ; 81 0 mg/ L 为 21 511 ? 01 126
( P< 01 01) ,与对照组相比差异显著,说明经胭脂树
橙处理后, PPARC蛋白的表达量随药物浓度的增加
而增加;胭脂树橙可上调 PPARC蛋白的表达, 并呈
明显的剂量依赖性。
3 讨论
有关 PPARC在胭脂树橙诱导 K562 细胞凋亡
过程中的作用, 国内尚研究较少。本研究表明,经胭
脂树橙处理的 K562 细胞, 采用台盼蓝拒染法和
MT T 法检测显示, 胭脂树橙对 K562细胞的抑制作
用同其浓度和作用时间呈依赖性关系, 即使小剂量
的胭脂树橙 ( 01 2 mg/ L ) 作用 K562 细胞 3 d后, 仍
能较显著地抑制细胞增殖。荧光显微镜观察形态学
显示,对照组呈弥漫性均匀荧光,核/质比例大; 给药
组细胞核变小,浓缩,荧光加强, 并观察到有大量细
胞碎片, 呈现典型凋亡细胞的特征性变化。在此基
础上,进一步研究了胭脂树橙诱导 K562 细胞凋亡
的机制, 通过 Western-blot t ing 检测 PPARC基因
的表达产物,显示胭脂树橙显著上调 PPARC基因
的蛋白表达, 并呈剂量依赖性, 提示胭脂树橙诱导
K562细胞凋亡和 PPARC基因的表达有密切关系。
提示胭脂树橙可能是通过上调 PPARC基因的表达
来促进 K562 细胞的凋亡和抑制其增殖的, 其中,胭
脂树橙起着 PPARC非特异配体的作用。
PPARC具有调控细胞因子生成, 调节体内糖平
衡,控制炎症形成和影响肿瘤生长等作用。最近有
研究显示, PPARC配体抗肿瘤作用不需激活
PPARC或 PPARC激活与其他途径共同起作用[ 5]。
可见有关胭脂树橙诱导细胞凋亡及 PPARC表达的
分子机制有待进一步研究和证实。
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生当归、酒当归和油当归体外清除自由基活性研究
邓红娟,郭延生,曲亚玲,杨小虎,秦 亮,魏彦明*
(甘肃农业大学动物医学院,甘肃 兰州 730070)
摘 要:目的 研究生当归、油当归和酒当归的水提取液体外对羟自由基 ( # OH ) 和氧自由基 ( O A2 ) 的清除作用。
方法 应用分光光度法测定生当归、油当归和酒当归水提液对 Fenton 反应产生的# OH 和邻苯三酚自氧化产生的
O A2 的清除率。结果 生当归、油当归和酒当归水提液在 5~ 80 mg/ mL 的质量浓度内对# OH 有明显的抑制作
用,随着当归及其炮制品水提液质量浓度的增加 ,抑制率明显升高。生当归、油当归和酒当归水提液对 # OH 清除
#784# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
* 收稿日期: 2008- 10-06 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30671541)作者简介:邓红娟( 1981 ) ) ,女,山东潍坊人,在读硕士,从事中药药理及中药免疫研究。 E-m ail : diaopengfeiluky@ 163. com
* 通讯作者 魏彦明 T el: ( 0931) 7631077 E-mail: w eiym@ gsau. edu. cn
作用的顺序为:酒当归> 油当归> 生当归。生当归、油当归和酒当归水提液在 25~ 200 mg/ mL 的质量浓度内对
O A2 有明显的清除作用,随着当归及其炮制品水提液质量浓度的增加, 抑制率明显升高, 且呈现剂量依赖性。生当
归、油当归和酒当归水提液对 O A2 清除作用的顺序为: 酒当归> 生当归> 油当归。结论 研究表明生当归、油当归
和酒当归水提液体外均具有较好的清除自由基的作用, 且药物浓度与清除效果呈明显的量效关系。
关键词:当归; 炮制品; 水提液; 羟自由基; 氧自由基
中图分类号: R285 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2009) 05 0784 04
自由基是生物分子在体内通过共价键均裂产生
的,正常情况下,生物机体各种自由基的产生和清除
处于一种动态的平衡,如果由于某种原因,使得体内
产生的氧自由基过多,或者体内防护、清除和修复能
力下降,就会出现自由基代谢的失常,导致自由基损
伤,引起疾病的发生。由于体内已无力维持自由基
的平衡,需要补充外源自由基清除剂帮助维持体内
自由基的平衡[ 1] 。在我国中草药已经有几千年的临
床应用历史,是一个巨大的天然抗氧化剂宝库。当
归 A ng el ica sinensis ( Oliv. ) Diels 是伞形科当归属
多年生草本植物,其干燥的贮藏根是我国常用中药。
主要分布于我国甘肃、四川、云南、湖北、陕西、贵州
等地。历代多以甘肃岷县所产作为道地药材。当归
药用历史悠久, 历代本草均有记载。其性味甘辛、
温,入心、肝、脾经,具有补血活血、调经止痛、润燥滑
肠等作用[ 2]。现代药理学研究证明当归具有降血
压、镇痛、抗炎、抗菌、抗辐射作用, 以及抗损伤、增强
免疫功能、抗氧化和清除自由基作用,另外还有利胆
保肝、松弛平滑肌、美容等作用 [ 3]。当归的炮制方法
历代各有不同, 文献记载有不同的炮制品,目前临床
常用的炮制品有生当归、酒当归、土当归和当归炭
等,对其炮制品的研究也以上述 4种炮制品为主 [ 4]。
当归属甘肃道地药材,习用油当归,传统认为可增强
其润肠通便的作用, 主要用于血虚肠燥便秘[ 5] ,并被
载入5甘肃省中药炮制规范6。有关当归不同炮制品
抗氧化活性及其作用机制的研究报道不多, 尤其关
于油当归清除自由基的报道更是少见。油当归作为
地方炮制品在甘肃中医和中兽医临床用药中属常用
品,且作用明显。为此,本实验以生当归及其两种不
同炮制品油当归和酒当归为研究对象, 对其体外清
除自由基的有关指标进行测定, 旨在为当归及其炮
制品药理作用及其作用机制的进一步研究提供科学
依据。
1 材料
生当归采于甘肃岷县, 经甘肃中医学院中药学
系龙全江副教授和甘肃农业大学动物医学院中兽医
教研组鉴定。取原药材, 除去杂质,洗净,润透,切成
薄片,晒干或低温干燥。油当归、酒当归由甘肃中医
学院中药学系龙全江副教授指导炮制加工。三(羟
甲基)氨基甲烷 ( T ris) 为进口上海中秦化学试剂有
限公司分装 (批号 070308) ,其他试剂均为国产分
析纯。OPPON ) 3000 型紫外-可见光分光光度计
(韩国)、AL104 电子分析天平 (德国)、CW ) 2000
超声-微波协同萃取仪 (上海新拓)。
2 方法
21 1 当归水提液的制备: 取生当归、油当归和酒当
归各 100 g, 加水 300 mL, 85 e 超声-微波协同提取
2次, 每次 30 m in。合并两次提取液,减压浓缩至质
量浓度 1 g/ mL。4 e 保存备用。
21 2 羟自由基( # OH)体系: 参照 Fenton 反应的
方法建立反应体系模型[ 6, 7] , 采用固定反应时间
法[ 8 , 9] ,在相同体积的反应体系 ( 6 mmol/ L H 2O2 1
mL, 6 mmol/ L Fe
2+
1 mL, 6 mmol/ L 水杨酸-乙醇
溶液 1 mL) 分别加入不同质量浓度的生当归、油当
归和酒当归水提液 ( 5、10、20、40、80 mg / mL) 和阳
性对照药物 L-抗坏血酸 1 mL,每个浓度设 10 个平
行管。以蒸馏水为参比, 在 510 nm 处测定吸光度
( A ) , 计算清除率。
清除率= [ A i - ( A j- A d) ] / A i @ 100%
A i为空白对照液的吸光度, A j为加入药物溶液后的吸光度,
A d为不加显色剂 H 2O2药物溶液本底的吸光度
21 3 氧自由基( O A2 )体系[ 10, 11] : 采用邻苯三酚自氧
化法 [ 12~ 14]。邻苯三酚在弱碱性介质中自氧化分解
产生O A2 ,利用O A2 清除剂能使邻苯三酚自氧化产物
在 325 nm 处的吸收峰受到抑制这一特点安排实
验,实验分为对照组和加药组, 对照组设 5 个平行
管, 分别加入 50 mmol/ L 的 T ris-HCl 缓冲溶液
( pH 8. 2,含 1 mmol/ L 二乙基三氨基五乙酸) 41 5
mL,加入 41 2 mL 双蒸水, 混匀后 25 e 水浴保温
20 m in, 取出后立即加入 25 e 水浴中预热的 6
mmol/ L 的邻苯三酚 01 3 mL (以 10 mmo l/ L HCl
代替邻苯三酚作为空白) , 混匀后立即倒入比色杯,
于 325 nm 处每隔 30 s测 A 值1次,共测 5 m in,以
空白管调零。计算对照组溶液吸光度随时间的变化
率。加药组设 5个平行管,在加入邻苯三酚前先加
入 11 0 mL 当归提取液 ( 25、50、100、200 mg / mL)
#785#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
对照药物 L-抗坏血酸, 再加入 31 2 mL 双蒸水, 混
匀后 25 e 水浴保温 20 m in, 取出后立即加入在
25 e 水浴中预热的 6 mmol/ L 邻苯三酚 01 3 mL,
混匀后立即倒入比色杯, 于 325 nm 处每隔 30 s 测
A 值 1次,共测 5 m in, 以空白管调零, 计算当归及
其炮制品水提取液吸光度随时间的变化率。
清除率= ($A - $A 0 ) / $A @ 100%
$A 表示对照管邻苯三酚自氧化变化速率, $A 0 表示加药管
邻苯三酚自氧化变化速率
21 4 数据统计处理: 用 SPPS 131 0 统计软件进行
方差分析和回归分析,测定结果以 x ? s 表示。
3 结果与分析
31 1 生当归、油当归和酒当归对 # OH 的清除作
用:由表 1可知不同质量浓度生当归、油当归和酒当
归水提液对 Fenton 反应体系产生的 # OH 均有一
定的清除作用, 随浓度增加,抑制率明显升高, 且呈
现剂量依赖性。其中,生当归、酒当归在 5和 10, 40
和 80 mg / mL 两个浓度梯度差异不显著; 油当归只
有 40 和 80 mg/ mL 差异不显著, 其他质量浓度梯
度均差异显著 ( P< 01 01)。在 5~ 80 mg / mL 的质
量浓度内,随生当归、油当归和酒当归水提液质量浓
度的增加, 抑制率呈明显的上升趋势。在 5 ~ 10
mg/ mL,生当归、油当归和酒当归对 # OH 清除作
用的上升趋势几乎无差别, 但从 10 mg/ mL 开始,
随质量浓度的增加, 酒当归对 # OH 清除作用的上
升幅度要大于生当归和油当归; 80 mg/ mL 之后, 生
当归、油当归和酒当归对 # OH 的清除作用接近相
同, 趋势趋于平缓。拟合曲线, 计算回归方程, 生当
归水提液: Y= - 1. 710+ 3. 706 X- 01 046 X 2 ; 油当
归水提液: Y= - 1. 691+ 3. 878 X- 01 051 X 2 ; 酒当
归水提液: Y = - 6. 145+ 4. 349 X - 01 06 X 2 ; L-抗
坏血酸: Y= 1511 459+ 581 772 lnX。由回归方程求
得半数抑制率 ( IC50 )分别为: 生当归 IC50为 181 00
mg/ mL,油当归 IC5 0为 171 20 mg/ mL,酒当归 IC50
为1 61 8 0mg / mL , L-抗坏血酸 IC50为01 1 8mg /
表 1 生当归、油当归、酒当归水提液对羟自由基的
清除作用 (x ? s)
Table 1 Effect of water extract solution from dif ferent pro-
cessed products of Radix Angelicae Sinensis ( raw,
oil, and wine) on scavenging # OH ( x ? s)
组别
清除率 / %
5 mg# mL- 1 10 mg# mL- 1 20 mg # mL- 1 40mg # mL- 1 80 mg # mL- 1
生当归 161 89 ? 31 47 301 11 ? 51 01 531 53 ? 141 45 871 67 ? 01 76 971 77 ? 01 35
油当归 171 21 ? 31 82 311 39 ? 51 30 561 64 ? 01 88 871 39 ? 11 65 981 95 ? 01 44
酒当归 161 08 ? 81 37 281 40 ? 41 42 601 02 ? 81 55 891 71 ? 31 29 991 07 ? 01 70
mL。因此, 生当归、油当归和酒当归水提液对 #
OH 清除作用顺序为:酒当归> 油当归> 生当归。
31 2 生当归、油当归和酒当归对 O A2 的清除作用:
由表 2可知,不同质量浓度生当归、油当归和酒当归
水提液对邻苯三酚自氧化反应体系产生的 O A2 均有
一定的清除作用。随质量浓度增加, 抑制率明显升
高,且呈现剂量依赖性。生当归、油当归和酒当归只
有 25 和 50 mg/ mL 两个浓度梯度之间差异不显
著,其余各浓度梯度之间均差异显著 ( P< 01 01)。
在 25~ 200 mg/ mL 内, 随生当归、油当归和酒当归
水提液质量浓度的增加, 抑制率呈上升趋势。其中
油当归和酒当归对 OA2 清除作用的上升幅度要大于
生当归。100 mg/ mL 时, 油当归和酒当归两者之间
差异显著 ( P< 01 05) ,酒当归对 OA2 的清除作用要
明显的好于油当归。浓度达到 200 mg/ mL 时, 生
当归和酒当归之间差异呈显著性 ( P< 01 05) ,此时,
油当归和酒当归对 O A2 的清除作用接近相同, 且效
果要明显的好于生当归。各炮制品不同质量浓度之
间差异显著 ( P< 01 01)。200 mg/ mL 之后清除作
用的趋势趋于平缓。拟合曲线计算回归方程,生当
归: Y= 61 815+ 01 497 X - 01 001 X 2 ; 油当归: Y =
01 320 + 01 275 X + 01 001 X 2 ; 酒当 归: Y =
- 21 406+ 01 699 X - 01 001 X 2 ; L-抗坏血酸: Y =
- 81 602+ 5641 92 X。由回归方程求得的半数抑制
率 ( IC50 ) 分别为: 生当归 IC50为 1121 50 mg/ mL,
油当归 IC50为 1241 50 mg/ mL,酒当归 IC50为 851 50
mg/ mL, L-抗坏血酸 IC50为 01 11 mg/ mL。因此,
在生当归、酒当归和油当归水提液对 O A2 清除作用
的顺序为:酒当归> 生当归> 油当归。
表 2 生当归、油当归、酒当归水提液对氧自由基的
清除作用 ( x? s)
Table 2 Effect of water extract solution from different
processed products of Radix Angelicae Sinensis
( raw, oil, and wine) on scavenging OA2 ( x ? s)
组 别 清除率/%
25 mg# mL- 1 50 mg # mL- 1 100 mg# mL- 1 200 mg # mL - 1
生当归 181 99 ? 111 78 291 20 ? 151 05 481 69 ? 131 46 731 98? 61 70
油当归 71 29 ? 31 24 161 99 ? 51 28 351 95 ? 101 39 901 37? 91 05
酒当归 141 95 ? 41 02 281 75 ? 51 23 561 87 ? 61 16 921 77? 11 27
4 讨论
国内外研究表明, 当归的化学成分主要有苯酞
类、香豆素类、黄酮类、挥发油类、有机酸类、多糖类
化合物及其他成分。在当归的这些化学成分中, 除
香柑内酯等呋喃香豆素外,其他类化学成分几乎都
与抗氧化有关[ 15]。目前研究表明, 当归中阿魏酸和
#786# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月
多糖是抗氧化的主要成分, 对羟自由基和氧自由基
都有较强的清除作用[ 16, 17] ,但当归及其炮制品的有
效成分及其量随着炮制方法的不同也有很大的差
异[ 18]。有实验报道当归及其炮制品中水溶性粗多
糖的量大小依次为: 酒炒当归> 生当归> 土炒当
归> 清炒当归> 当归炭[ 19]。当归饮片经油炒后水
溶性浸出物的量略有下降, 但多糖的量升高较为明
显[ 20] , 阿魏酸的量也有所提高 [ 21]。宋金春等 [ 22] 报
道,当归生品与炮制品之间,阿魏酸的量有一定的差
异,并且随着炮制温度的升高而降低,当归炮制后阿
魏酸的量高低依次为: 生当归 U酒当归> 当归炭。
从水溶性成分来看, 当归酒炒后水溶物增高, 阿魏酸
几乎无降低。李明明等[ 23] 报道, 5-羟甲基-2-糠醛
( 5-HMF)可延长小鼠在低氧状态下的存活, 具有抗
自由基活性。5-HMF 主要由己糖加热分解产生,
一般中药制剂炮制或加热后 5-HMF 量增加。如上
所述,当归随炮制方法的不同,其有效成分的量也存
在一定差别,且其水溶性的成分也有所变化。可见
仅采用一种有效成分来评判当归及其炮制品对自由
基清除能力是不完善的。所以, 本实验采用生当归
及其炮制品的水提液作为研究对象,才能全面客观
的评价生当归、油当归和酒当归水溶性成分对自由
基清除作用。
虽然当归及其炮制品对自由基的清除作用已有
相关报道,但对甘肃地方特色的油当归清除自由基
的作用未见相关报道, 因此本实验采用 Fenton 反
应体系和邻苯三酚自氧化体系检测生当归、油当归
和酒当归水提液对 # OH 和 O A2 的清除作用, 以期
阐明油当归对自由基的清除能力。实验结果表明:
油当归水提液对 Fenton 反应生成的 # OH 和邻苯
三酚自氧化反应产生的 OA2 均有良好的抑制作用,
且随药物浓度的增加,抑制率呈明显升高,剂量效应
关系显著,对# OH 清除作用的能力介于酒当归和
生当归之间; 对 O A2 清除能力比酒当归和生当归较
差,其原因有待于进一步研究。
综上所述可以推测, 生当归、油当归和酒当归水
提液中清除自由基的活性物质具有一定的热不稳定
性。且随温度和辅料的变化, 生当归、油当归和酒当
归中的化学成分可能也发生了某些变化, 同时它们
在炮制品中的分布、在水中的溶解状况以及和不同
的自由基的亲和力也不尽相同, 从而影响了当归炮
制品清除自由基能力。当归及其炮制品水提液清除
自由基的活性成分可能通过多位点、多渠道发挥作
用。随着提取工艺的不断进步以及研究的不断深
入,当归及其炮制品中清除自由基的单体、化合物以
及其作用位点和相关机制将会不断得到阐明。
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#787#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 5 期 2009 年 5 月