全 文 ：决明子的 HPLC指纹图谱及模式识别研究
王文燕1 ,赵 　强2 ,张铁军1 3 ,朱宏吉2 ,黎 　阳3
(11 天津药物研究院 ,天津 　300193 ; 21 天津大学化工学院 ,天津 300072 ; 31 天津中医药大学 ,天津 　300193)
摘 　要 :目的 　研究决明子药材的质量控制方法。方法 　采用高效液相色谱法建立了决明子药材的 HPLC 的指纹
图谱 ,收集了 32 批样品进行测定 ,并使用聚类分析和主成分分析对指纹图谱进行了模式识别研究。结果 　建立了
决明子药材的指纹图谱。结论 　方法可用于决明子质量控制及综合评价。
关键词 :决明子 ;指纹图谱 ;主成分分析
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021638204
HPLC Fingerprint and chemical pattern recognition of Semen Cassiae
WAN G Wen2yan1 , ZHAO Qiang2 , ZHAN G Tie2jun1 , ZHU Hong2ji2 , L I Yang3
(11 Tianjin Institute of Pharmaceutical Research , Tianjin 300193 , China ; 21 School of Chemical Engineering
and Technology , Tianjin University , Tianjin 300072 , China ; 31 Tianjin University
of Traditional Chinese Medicine , Tianjin 300193 , China)
Abstract : Objective 　To establish a met hod for t he quality cont rol of S emen Cassi ae1 Methods 　A high
performance liquid chromatograp hic met hod was developed to establish t he fingerp rint of S emen Cassi ae ,
and 32 samples f rom various batches of S emen Cassi ae were analyzed1 Cluster analysis and principal com2
ponent analysis were applied to st udy H PL C fingerp rint and chemical pat tern recognition1 Results 　The
fingerp rint of S emen Cassi ae was set up1 Conclusion 　The method could be used for t he quality cont rol and
comprehensive evaluation of S emen Cassi ae1
Key words : S emen Cassi ae ; fingerp rint ; p rincipal component analysis ( PCA)
　　决明子为豆科决明属植物决明 Cassi a obt usi 2
f ol i a L1 或小决明 C1 tora L1 的成熟种子[1 ] 。目
前 ,多用大黄酚这单一成分作为决明子的质控指标 ,
但难于全面地控制决明子的内在质量 ,不能对其真
伪优劣做出判断[ 1～5 ] 。本实验通过采用 HPL C 方
法建立决明子的指纹图谱 ,并将聚类分析和相似度
分析的数据分析技术应用于决明子的指纹图谱 ,分
析、比较不同产地的决明子药材指纹图谱 ,对所得图
谱进行分析、解析 ,建立决明子指纹图谱的指标参数
评判标准 ,为全面控制决明子的质量提供了方法。
1 　仪器与材料
Waters 2695 高效液相色谱仪 , Waters 996 型
PDA 检测器 ,电热恒温水浴锅 (江苏省医疗器械
厂) , HS3120 超声波 (海卓康生物科技有限公司) ,
M ET TL ER TOL EDO PB303 —N 电子天平 (瑞士
M ET TL ER TOL EDO 公司) 。
甲醇、乙腈色谱纯 ,乙醇 (95 %) 、三氯甲烷、盐
酸、磷酸、甲酸、乙酸、无水乙醇、丙酮均为分析纯。
大黄酚、大黄素、大黄素甲醚 (中国药品生物制品检
定所) 。所用决明子药材均为决明 C1 obt usi f ol i a
L1 干燥种子 ,见表 1 ,药材均由天津药物研究院张
铁军研究员鉴定。
2 　方法与结果
211 　色谱条件 : 色谱柱为 Suntek Kromasil C18
(250 mm ×416 mm ,5μm) ;检测波长为 254 nm ;柱
温 : 25 ℃。体积流量 : 110 mL/ min ;流动相 :甲醇2
011 %磷酸 ;梯度洗脱 : 0～20 min ,61 %A ; 20～25
min ,61 %～ 70 % A ; 25 ～ 45 min , 70 %～ 85 % A ;
45～55 min ,85 %A ; 55～60 min , 85 %～100 %A ;
60～65 min ,100 %A。进样量 :10μL 。
212 　对照品溶液的制备 :称取大黄酚对照品适量 ,
置于 50 mL 量瓶中 ,用无水乙醇2醋酸乙酯 (2 ∶1)溶
解 ,稀释至刻度。摇匀 ,过 0145 μm 微孔滤膜 ,备
用。同法制得大黄素、大黄素甲醚对照品溶液。
·8361· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
3 收稿日期 :2008212215　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家科技支撑计划项目 (2006BAI06A01202)3 通讯作者　张铁军
表 1 　决明子药材产地及来源
Table 1 　Origin and source of Semen Cassiae
批号 来　源
J1 河北安国　　　
J2 河北安国　　　　
J3 达仁堂药业　　　
J4 天津协和鞍山道店
J5 天津华丰药店　　
J6 天津协和万德庄店
J7 丽江　　　　　　
J8 天津源盈药店　　
J9 天津汇仁堂药店　
　J10 天津杏春州药店　
　J11 天津平湖药店　　
　J12 天津和平药店　　
　J13 天津桐君阁药店　
　J14 吉林　　　　　　
　J15 天津福瑞祥药店　
　J16 天津华济堂药店　
批号 来　源
J17 天津源盈药店　　
J18 天津协和药店　　
J19 天津华丰药店　　
J20 天津世纪三潭药店
J21 天津本草堂　　　
J22 天津胜利药店　　
J23 河南安阳　　　　
J24 河北邢台　　　　
J25 江苏　　　　　　
J26 河北怀鹿　　　　
J27 河北平安　　　　
J28 赞皇　　　　　　
J29 山东菏泽　　　　
J30 山东　　　　　　
J31 洛阳　　　　　　
J32 石家庄　　　　　
213 　供试品溶液的制备 :精密称取决明子药材粉末
015 g ,置于圆底烧瓶中 ,加甲醇 50 mL ,称定质量。
置水浴上加热回流 30 min ,放冷 ,再称定质量 ,用甲
醇补足 ,摇匀滤过。精密量取续滤液 25 mL ,蒸干 ,
加入 10 %盐酸溶液 30 mL 置水浴上水解 1 h ,立即
冷却。用三氯甲烷萃取 4 次 ,每次 30 mL ,合并三氯
甲烷液 ,回收溶剂 ,挥干。残渣用无水乙醇2醋酸乙
酯 (2 ∶1) 溶解 ,转移至 10 mL 量瓶中定容。摇匀 ,
过 0145μm 微孔滤膜 ,备用。
214 　方法学考察
21411 　精密度试验 :取同一批供试品溶液 ,连续进
样 5 次 ,各色谱峰的相对保留时间和单峰面积大于
或等于 5 %的色谱峰的比值基本一致 ( RSD 在
310 %以下) ,符合指纹图谱的要求。
21412 　稳定性试验 :取同一批号的供试品溶液 ,分
别在 0、6、9、12、24 h 进样 ,各色谱峰的相对保留时
间和相对峰面积的 RSD 值均不大于 2198 % ,符合
指纹图谱的要求 (不大于 3 %) 。
21413 　重现性试验 :取同一批号的供试品溶液 5
份 ,进行测定 ,各共有峰的相对保留时间和单峰面积
占总峰面积大于或等于 5 %的色谱峰面积比值基本
一致 (RSD 在 310 %以下) ,符合指纹图谱要求。
215 　样品测定 :测定不同批次和产地决明子样品 ,
共获得 10 个色谱峰。其中 7 号峰为大黄素 (4215
min 出峰) ,8 号峰为大黄酚 (4715 min 出峰) ,9 号峰
为大黄素甲醚 (5517 min 出峰) 。确定 8 号峰大黄
酚为决明子主要指标成分 ,将其作为内参比峰 (代表
性色谱图见图 1) 。各色谱峰对内参比峰的相对保
留时间定性 ,计算各色谱峰相对于其内参比峰的峰
面积比。若某一指纹图谱在某相对保留时间处无
峰 ,相对峰面积为零 ,仍给相应的编号 ,以保证各色
谱指纹图谱都有相同的色谱峰数。
t/ min
图 1 　决明子液相色谱图及主要特征峰
Fig11 　HPLC Chromatogram and main characteristic
peaks of Semen Cassiae
216 　相似度评价 :利用 2004A 版《中药色谱指纹图
谱相似度评价系统》计算软件 ,对 32 批样品进行相
似度评价 ,以 J 32 批决明子药材色谱图作为参照图
谱 ,利用中位数法进行多点校正生成对照图谱 ,计算
决明子药材的相似度。由相似度评价结果可以看
出 ,各批决明子药材与对照指纹图谱间的相似度为
01994～01814 ,大部分样品相似度较高 ,但仍不能直
接建立决明子药材指纹图谱的共有模式。需对决明
子各药材进行进一步的评价样品间差异 ,进行图谱
模式识别分类 ,以便最终能够建立真实可靠的决明
子药材标准指纹图谱。
217 　主成分分析 :各决明子样本经过上述实验方法
获得各自的色谱数据 ,通过色谱工作站将图谱进行
积分后以保留时间和色谱峰面积作为数据的信息 ,
一个样本的数据为一个数据向量生成样本数据 ,32
个样本数据组成样本指纹数据矩阵。对数据矩阵进
行主成分分析 ( PCA)后 ,分别以其第一、第二主成分
建立坐标系 ,进行投影即可得到所有样本的 PCA 平
面投影图 ,样本间内在的相互关系即可较好地表现
出来进而实现样本之间的分类。决明子数据进行的
PCA 平面投影分析见图 2。
218 　系统聚类分析 :使用了欧氏距离这一化学计量
方法 ,分别对决明子色谱数据进行聚类分析 (图 3) 。
PCA 投影中所组织数据集对其进行系统聚类分析 ,
采用类内平均锁链法 (average linkage) 、欧氏距离
法作为样品的测度。
219 　决明子药材标准指纹图谱的建立 :经上述分
析 ,参考主成分分析和系统聚类分析结果 ,取其中
10 批投影距离最近的决明子药材建立决明子药材
的标准指纹图谱 ,10 批决明子批号为 :J 7、J 13、J 15、
J 18、J 23、J 26、J 29、J 30、J 31、J 32。
·9361·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
将上述 10 批样品数据导入《中药色谱指纹图谱
相似度评价系统》(2004A 版) ,经选峰 ,设定 J 7 批决
明子药材色谱图作为参照图谱匹配模板 ,将谱峰自
动匹配 ;然后设定标准模板 ,利用中位数法进行多点
校正生成对照图谱 (图 4) ,进行谱峰差异性评价和
整体相似性评价 ,得出决明子指纹图谱的共有模式
见图 5 ,相似度计算结果见表 2。
　　相似度计算结果表明 ,10 批样品均在 01980 以
上 ,符合国家药典委员会的要求。可为决明子药材
的品质评价、质量标准的制定提供科学依据。
3 　讨论
311 　流动相的选定 :经比较 ,甲醇和 011 %磷酸水
溶液一起组成流动相进行梯度洗脱分离效果较好 ,
能较好地使样品中各色谱峰分离且出峰最多。试验
后得到的最合适梯度下全部物质在70 min内被洗
表 2 　10 批样品相似度评价结果
Table 2 　Similarities for ten batches of samples
批号 参照图谱 对照图谱 批号 参照图谱 对照图谱
J7 　 11 000 01 996 J26 01986 01996
J13 01 981 01 988 J29 01991 01992
J15 01 999 01 998 J30 01991 01992
J18 01 998 01 997 J31 01976 01990
J23 01 974 01 986 J32 01991 01991
脱完毕 ,检测出 10 种主要物质色谱峰 ,其中大黄素
4215 min 出峰 ,大黄酚 4715 min 出峰 ,大黄素甲醚
5517 min 出峰 ,芦荟大黄素、大黄酸未被检出。各
物质分离良好 ,并且在图谱中分布较均匀。
312 　检测波长的选择 :取供试品溶液 ,进样 5μL ,
进行 200～400 nm 的全波长扫描 ,并对各波长下的
色谱图进行分析比较。结果表明 ,检测波长过低 ,产
生紫外末端吸收 ,检测波长过高 ,不能有效检出色谱
峰 ,在 254 nm 下 ,各峰分离良好 ,特征峰明显且峰
型较好 ,从图谱中可以尽可能地获取色谱组分信息
以反映体系组成的全貌 ,因此选定 254 nm 为指纹
图谱测定波长。
313 　聚类分析与主成分分析 :应用了 PCA 投影法
和系统聚类分析法两种化学计量学方法对决明子色
谱积分数据进行了模式识别的初探。从整体分类效
果上来看 ,PCA 投影法更为直观 ,能一目了然地看
出各个决明子药材分类样本之间的聚类关系。决明
子色谱数据的 PCA 投影没有十分明显的区分 ,各样
品分布均匀 ,不能明确地分类 ,说明各决明子之间既
存在明显的差异又存在一定程度的相关性。在
·0461· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
PCA 投影分析中 ,以数据所做的投影图基本没有达
到分类的效果 ,并且 PCA 投影图也未能全面体现出
决明子样本之间内在的联系。采用聚类分析方法 ,
结果表明决明子样品的确存在差异 ,但分类并不
明显。
参考文献 :
[ 1 ] 　中国药典 [ S]1 一部1 20051 [2 ] 　王清华 , 纪　玲 , 丛保忠1 高效液相色谱法测定决明子中大黄酚的含量 [J ]1 中医药学报 , 1996 , 20 (5) : 482491[3 ] 　冯晓冰1 决明子药材中大黄酚含量的反向 HPL C 法测定[J ]1 分析测试学报 , 1999 , 18 (4) : 801[4 ] 　裴妙荣 , 贾宏伟 , 王世民1 生、炒决明子蒽醌含量比较 [J ]1中国中药杂志 , 1990 , 15 (8) : 291[5 ] 　张启伟 , 阴　健 , 张 　俊 1 生、炒决明子及其煎剂中部分活性成分的比较 [J ]1 中草药 , 1996 , 27 (2) : 792811
不同产地巴戟天中糖类成分 HPLC2ELSD 指纹图谱研究
刘晓涵 ,陈永刚 ,林 　励 3 ,肖凤霞 ,刘 　征 ,赵红英
(广州中医药大学中药学院 ,广东 广州 　510006)
摘 　要 :目的 　建立巴戟天中糖类化学成分 HPLC 指纹图谱的分析方法 ,研究不同产地的巴戟天药材的质量。方
法 　采用 HPLC 法。色谱柱为 Inert sil N H2 (250 mm ×416 mm ,5μm) ;流动相 :乙腈2水梯度洗脱 ;柱温 :室温 ;体积
流量 :112 mL/ min ,以蒸发光散射检测器 ( EL SD)检测 ,检测条件 :漂移管温度 100 ℃;N2 气流速度 212 L/ min ; He
在线脱气 ,气流速度 20 mL/ min。使用计算机辅助相似度评价软件进行数据处理。对不同产地的巴戟天药材指纹
图谱的相似度进行比较分析。结果 　除两批外 ,其余 8 批巴戟天与系统生成对照指纹图谱的相似度均在 0194 以
上 ,归纳出巴戟天 13 个共有峰。通过与对照品的保留时间比较 ,1、2 号峰分别为 D2果糖、蔗糖。不同产地巴戟天
药材中糖类化合物化学组成相似 ,但相对比例有明显的差异。结论 　所用方法稳定、重现性好 ,可突出巴戟天药材
的内在质量特征 ,为更好地控制巴戟天的内在质量提供了科学依据。
关键词 :巴戟天 ;糖类成分 ;指纹图谱 ; HPLC2EL SD
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021641203
HPLC2ELSD Fingerprint of carbohydrate constituents in Morinda of f icinalis
from different habitats
L IU Xiao2han , CH EN Yong2gang , L IN Li , XIAO Feng2xia , L IU Zheng , ZHAO Hong2ying
(College of Chinese Materia Medica , Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine , Guangzhou 510006 , China)
Abstract : Objective 　To establish HPL C fingerp rint analysis met hod of carbohydrate constit uent s in
M ori n da of f ici nal is collected f rom different habitat s1 Methods 　HPL C Method was employed and a
Columns Inert sil N H2 (250 mm ×416 mm , 5μm) wit h acetonit rile2water as mobile p hase by gradient elu2
tion was used , t he flow rate was 112 mL/ min , column temperat ure was room temperature1 Detector was
EL SD and t he temperat ure of drif t t ube was 100 ℃1 The flow rate of N2 was 212 L/ min , Helium degasifi2
cation on2line with flow rate was 20 mL/ min1 The fingerp rint s evaluating software by comp uter2assisted
for the similarity was used to process the experiment data and compare t he similarity of HPL C fingerp rint
of M1 of f ici nal is f rom different habitat s1 Results 　Except for two batches , t he fingerp rint similarity value
of ot her eight batches of herbs was above 0194 compared wit h system generation spect rum and 13 common
characteristic peaks were demonst rated1 The first and second peaks were D2f ructose and sucro se , respec2
tively compared wit h t he retention time of standard sample1 The result s showed that t he carbohydrate con2
stit utes of M1 of f ici nal is were similar among herbs f rom different habitat s , but their relative ratio s are
significantly different1 Conclusion 　The met hod in this experiment is stable and rep roducible , which could
·1461·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
3 收稿日期 :2008212212　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :刘晓涵 (1982 —) ,女 ,湖南省永州市人 ,广州中医药大学博士生 ,研究方向为中药资源开发利用与新药研究。　
Tel : (020) 39356148 　E2mail :liuxia98 @1631com3 通讯作者　林　励　Tel : (020) 39358270 　E2mail :lwyll @gzhtcm1edu1cn