全 文 ：·588· 中革葫ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月
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利用RAPD分析13种石斛属植物的遗传多样性和亲缘关系
王慧中，卢江杰，施农农，应奇才
(杭州师范学院生物化学与分子生物学杭州市重点实验室。浙江杭州 310036)
摘要：目的通过对18种石斛属植物进行遗传多样性和亲缘关系分析．为更好地开发利用石斛资源奠定基础。
方涪随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析遗传多样性，UPGMA类平均法进行聚类分析。结果利用筛选出
的lO个随机引物对供试材料DNA进行随机扩增，共得到188条带．其中多态性带有180条，多态性百分率为
95．74％。采用uPGMA类平均法对扩增出的谱带进行遗传聚类分析，得出反映各种间亲缘关系的树状图。在遗传
距离(D)一0．63处，可将供试材料分为3类，RAPD对基因组的分析结果与传统分类学的结果差异不大。结论该
标记技术对石斛属植物的遗传多样性和分类研究是可行的。
关键词：石斛属；RAPD；遗传多样性；亲缘关系
中图分类号：R282．7 文献标识码：B 文章编号：0253—2670(2006)Od一058805
Analysisofgeneticd versityandaffinityrelationshipsamong13 pecies
ofDendrobiumSw．byRAPD
WANGHui—zhong，LUJiang—jie，SHINong—nong．YINGQi—eai
(KeyLaboratoryofHangzhouCityforBiochemistryandMolecularBiology，HangzhouNormalCo lege，
Hangzhou310036，China)
Abstract：ObjectiveG neticd versityandaffinityrelationshipsamong13speciesofDendrobiumSw．
wereanalyzed．theresult1aida solidfoundationforthebetteruseofthisresources．MethodsRandom
amplifiedpolymorphieDNA(RAPD)techniquewasusedtoanalyzegeneticd versity，andthedendrogram
wasconstructedbyUPGMA．ResultsTenRAPDprimerswereappliedtodorandomamplification．A
totalof188DNAbandswasdetected，180amongwhichwerepolymorphic，theaveragerateof
polymorphiebandswas95．74％．TheresultofclusteranalysisbyusingUPGMAmethodshowedthat13
genotypescouldbeclassifiedintothreetypesingeneticd stance0．63．Thisoutcomewascorrespondingto
theresultbyusingtraditionalclassification．ConclusionItisconcludedthatRAPDmarkerscanbeused
onthestudiesofgeneticrelationshipsandcla sificationofspeciesofDendrobiumSw．sensitively．
Keywords：DendrohiumSw．；RAPD；geneticdiversity；geneticrelationships
兰科(Orchidaeeae)石斛属(DendrobiumSw．)
植物除了观赏之外，不少还是珍贵的药用植物。国内
外学者已对石斛属37种植物进行了化学成分分析，
从中分离鉴定出生物碱类、多糖类、倍半萜类、菲醌
类、联苄类、芴酮类、香豆素类以及挥发油等多种化
学成分，并对其药理活性进行了研究⋯。目前有关石
鉴量是警i筹翌善誓朵科学摹金(3。【4。6)，浙江省。】5】．和抗期市。131，A才基金资助项目
作者简介：王慧中(1962)，男．教授，博士，主要从事植物分子生物学研究。Tel：(0571)28865198Email：whz62@163．c。m
万方数据
中革葫ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月·589·
斛属植物的系统分类和进化研究，其主要根据是宏
观形态学性状、尤其是花粉块的数目以及唇瓣与蕊
柱的愈台程度，是基于形态学和地理分布而建市起
来的一“。由于单纯依据形态学和地理分布分类法的
局限性，比如在石斛属中存在着一些物种，它们除在
花被片上表现出一定的差异外，其他形态特征卜1分
相似，并且在地理分布上也是重叠的，对于这样一些
物种，由于尚不清楚颜色差异的遗传背景，只能作为
单独的种处理“。总之，由于形态分类学方法划分物
种是建立在个『本性状描述和宏观观测水平基础上t
因此，得到的结论往往不完善，易引起争论。
与形态学鉴定相比，1-)NA分子标记技术鉴定具
有直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、
发育时期均可检测。数量多、遍及整个基因组·遗传
稳定．表现为“中性”，有一些分子标记为共显性，检
测迅速等优点。
有关分子标记技术在右斛属植物品种鉴定的研
究，国内外已有一些报道。彭锐等”利崩RAPD技
术对石斛属植物进行了基因组DNA多态性分析，
初步构建聚类树状图并设计1对能鉴别铁皮右斛的
特异性引物。罗玉明等“3根据细叶石斛及其他37种
枫斗类和黄草类石斛的rDNAITs序列，设计r位
点特异性PCR鉴别引物xYJBOIS和xYJB01x，对
细叶石斛进行了，成功的DNA分子鉴别。I。t等一6o报
道利用SSH杂交和DNA微阵法对兰科石斛属的5
个物种进行鉴定。Lau等：1报道16个不同的石斛种
间ITS2序列平均有12．4％差异，而与非兰科植物
以及拟石斛之间平均有29，8％和i8．8％的序列不
同，并认为ITS2序列可以用于鉴别药用石斛的真
假。虞弘⋯等采用AFt，P技术对石斛属4种植物进
行了遗传多样性分析，得出该技术可用于药用石斛
DNA指纹研究的结论。
虽然DNA分子标记技术在百斛属植物鉴定等
方面已有一些研究报道，但目前分子标I己应川干右
斛属植物研究的种类和数量都还十分有限，还只是
局限在部分标记技术和部分物种。本试验所选的石
斛材料多数还未见有RAP[)研究报道。奉毋f究的口
的是利用RAPD(随机扩增多态性DNA，random
amplifiedpolymorphismicDNA)技术研究右斛属
植物的遗传多样性，构建亲缘关系图谱，确立属下分
类系统，为更好地开发利川石斛资源服务。
J材料和方法
1．I材料：实验所用的13种材料见表1。均经开花
鉴定，鉴定人为杭州师范学院何业琪教授。
表l材料名称
Table1 Materialstestedinexperiment
编号 材料名称 编号 材料名称
i 美花石斛(穗．援自) 7玫瑰右斛D．crcpidatum
DeHdrab，umi{}ddtⅡF、n8晶帽石斛D．crvstallin“，”
2 球{匕h触D．thyr,’}mmm9美花石斛(花．浅红)
3 滇佧石斛力．guangzien．、e10细叶右斛』j．^“小rJ(kii
4 撤春打斛D p，imu／inum11广东百斛Dwilsr，nil
5 鼓槌石斛D ch(vsot03um12 铁皮石斛，)n，矗“⋯l
6 重唇石斛D．^PHoghzsum13串珠石斛D^ztn卅，i
1．2方法
i．2．1基冈组DNA提取：取保存于一70C新鲜嫩
叶片约1g，用液氯研碎，加入5ml，CJI、AB提取缓
冲液(100mmol／g|lrisHCI，20mmol／t。EDTA．
1．4mol／I，2％巯基乙醇，2％CTAB)，65C水浴
30rain；加入等体积氯仿异戊醇(24：])抽提．离心
取上清液加入等体积异丙醇，静置lh或 2《)(过
夜；用玻璃钩捞出絮状沉淀，转入Eppendor[,管中．
』JⅡ入70％的乙酵漂洗3次；弃乙醇，风干DNA沉
淀，加入适量TE缓冲液溶解，再加人RNaseA，37
C15rain；用等体积苯酚一氯仿异戊醇(25：24：
1)、氯仿异戊醇各抽提一次，离心吸上清液于
Eppendor[,管中，加入1／10体积的NaAC(3mmol／
I。。pH5．2)和_二倍体积冷的无水乙醇，混匀，20
c放置1h以上，离心得沉淀，用70％的乙醇漂洗
DNA沉淀2～3次，风下后溶于400pLTE(含1
mol／I．NaCI)缓冲液中；重复上步骤，风十后DNA
沉淀溶于100pI。TE。用0．8％琼脂糖凝胶电泳检
测片段大小，UV一2401PC(岛津)紫外分光光度计检
测A：。A。值并定量。由表2可看出，提取的基因组
DNA的A。／A。值大部分在1．7～1．9，说明蛋白
质量较少，RNA基本上被完全降解，能够满足
RAPD反应对DNA的质量要求。
表2供试材料基因组DNA的紫外分析结果
Table2 UVAnalysisofopticaldensityDNA
andconcentrationofmaterials
材料 n洲． ^。8。 A26。／^28。质量浓度／(Jlg-mI，
0 3224
O2351
01437
0．2894
0 2756
O 2206
0 2298
O 1572
o．2162
0】843
0 1 542
0 3576
0．2043
0 19R0
O．1351
(，．084O
0．1556
0 1482
0，l239
0 l 336
0 0836
0 1280
0 1047
O，08Zd
a．2067
0 1202 瞄|薹㈣m㈣抛Ⅲ㈣l||}删撕枞Ⅲ卵M利％舶豫他g蓦∞州钾访邢
万方数据
中革喃ChineseTraditionalandHerbDrugs第37卷第4期2006年4月
1．2．2RAPD方法：将DNA溶液稀释成80～100
ng／pI．，作为RAPD反应的模板。Taq酶购自上海生
工生物工程技术服务有限公司，RAPD反应体系见
表3。RAPD反应程序：94C变性1min，36(、复性
1min，72C延伸反应2min，35个循环。
表3 RAPD扩增反应体系
Table3 RAPDAmplificationreactionsystem
成分 体积／pI。
10×缓冲液
dNTPn0mmol／L)
MgCI2(25mmol／L)
Taq酶(5U／pL)
DNA(80～100ng／pl，)
双蒸水
引物
总体积
2．50
0．25
1 50
0 20
1．00
18．55
1 00
PCR扩增结束后，加入适量上样缓冲液
(V#g：Vt#口n＆一5l 1)，混匀。于1．2％琼脂糖凝
胶电泳，制胶时在胶中加入500ng／mI．澳化乙锭。
电泳条件：100V恒压，电泳时间2．5h，电泳结束
后，在zF一90暗箱式紫外透射仪上观察，用Epson
数码相机拍照。
1．2．3RAPD随机引物筛选：lobq寡核苷酸随机
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，
s20—s119，共100个RAPD引物。用一种材料做完
100对引物后，去除只扩增出3条带以下或没有条
带的引物，再用另一种材料依次筛选下去。筛选出多
态性较强、重现性好的引物10个，见表4。
裹4 10个RAPD引物的名称和序列
Table4 Nameendsequenceoft nRAPDprimers
引物名称 序列(5037) 引物名称 序到(5’一3’)
S50 GGTCTACACCS5l AGCGCCATTG
$53 GGGGTGACGASS9 CTGGGGACTT
S65 GATGACCGCCS69 C1、cA【1CGl、c【：
S71 AAAGCTGCGG$80 ACTTCGCCAC
S90 AGGGCCGTCTS92 CAGCTCACGA
1．2．4数据分析方法：电泳图谱中根据分子迁移率
及其有无进行统计：有带计为1，无带或模糊不能辩
认计为0。用NTSYS软件计算出遗传相似性系数，
用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。
2结果
2．1 10个随机引物对石斛属13种植物基因组
DNA的扩增：运用筛选出的lo个引物对供材料
DNA进行随机扩增，共得到188条带，其中多态性
带有180条，多态性百分率为95．74％。扩增出的
DNA带的分子大小在loo～2000bp，见表5。文中
只选出4个多态性最好的引物扩增出的代表性图，
见图1。
表5 10个随机引物对石斛材料的扩增结果
Table5 Amplificationresultsoftenrandomprimers
onmaterialsnDendrobiumSw
M—lkbDNAladder1～13供试材科编号(表1)
M1 kbDNAladder1--13—experimental
samplenumbersthata⋯ameasinTable1
圈1引物$65、$80、$90和$92扩增结果
Fig-1Amplificationresultsbyprimer$65，$80，
$90，and$92
2．2石斛属间的DNA聚类分析结果：实验所得的
相似系数矩阵见表6，应用UPGMA法聚类，所得聚
类图见图2。在相似系数0．63处，可将13种材料分
为I、I、Ⅲ类。I类包括：串珠石斛、美花石斛(花，
浅红)、晶帽石斛、铁皮石斛、广东石斛、玫瑰石斛、
报春石斛。其中的晶帽石斛、美花石斛(花，浅红)
万方数据
中革菊ChineseTraditionalandHerbDrugs第37卷第4期2006年4,El·591·
裹6根据RAPD标记计算的相似系数
Table6 Genetics milaritybe weenspeciesOilbasisofRAPDmarkers
0．1836 0 2278 0．Z195 0 2168 0．10380 1794 0．2500 0．25311．000
0．1012 0．1000．2220．0937 0．1034 0．2068 0 2620．0666 0．10l6 0．2500 1．000
I——q
d —L———————一一一alI— 一一 ⋯——l2
l叫 一——II『1-三三二二。三二二一{r_L————————————————— 6—L— 一——5
，—_[二二二二二二二130
【．．．——————～———．——一2
围2 RAPD标记构建的UPGMA聚类图
Fig·2UPGMADendrogramsenerated
fromRAPDmarketS
首先聚合成小组，然后与铁皮石斛聚合；同时广东石
斛、玫瑰石斛聚合成小组，然后与报春石斛聚合；这
两组再聚台后与串珠石斛聚合．形成I类。Ⅱ类包
括：鼓槌石斛、美花石斛(花，淡白)、重唇石斛。它们
的关系是美花石斛(花，淡自)、重唇石斛先聚合，再
和鼓槌石斛聚合，形成Ⅱ类。Ⅱ类包括：球花石斛、滇
桂石斛和细叶石斛。其中滇桂石斛和细叶石斛首先
聚合，再和球花石斛聚合，形成Ⅲ类。
3讨论
吉占和03在1980年首先提出我国石斛属植物
种类达57种，并将它们划分为9个组，分别为剑叶
组、圆柱叶组、禾叶组、心叶组、基肿石斛组、草叶组、
黑毛组、顶叶组和大花石斛组。以上I类的串珠石
斛、美花石斛(花，浅花)、铁皮石斛、广东石斛和玫瑰
石斛属于组9；大花石斛组。Ⅱ类的鼓槌石斛单独列
出属于组8：顶叶组。两种分类方法结果完全吻合。
但属Ⅱ类的重唇石斛和属Ⅲ类的细叶石斛按传统分
类也应归属于组9，两种不同水平的分类方法存在
一些差异。另外，两种开不同颜色花的美花石斛，学
名均为D．10ddigesii，传统分类属一个种。RAPD分
析结果表明，两者分属于I类和I类。球花石斛、滇
桂石斛和晶帽石斛由于吉占和当年没有研究，所以
分类地位有待进～步研究。
从总体上看．本实验绘制的13种石斛聚类图与
吉占和在1980年首先提出我国石斛属植物的划分
差异不大，因为I类聚合结果大多在大花石斛组中，
只有Ⅱ类中的重唇石斛和Ⅲ类中的细叶石斛不在这
组，表明该标记技术对石斛属植物的遗传多样性和
分类研究是可行的。另外，理论上两种开不同颜色花
的美花石斛实验材料在类聚结果上应该比较接近，
可是实际上没有这样。究其原因，当然是多方面的。
作者认为可以从以下几个方面加以考虑：首先，
RAPD技术本身存在多态性少和重现性差的缺点。
尽管本试验已采取了多种措施尽量加以避免，比如
挑选多态性高的引物，实验试剂及条件相对恒定等
等，但这并不能从根本上解决该技术固有的不足。其
次，由于自然杂交的结果，石斛属植物变异很大，中
间类型很多，种的界限不清楚，对有些种或品种的形
态学分类，一直以来，不同的学者持有不同的看法。
第三，对于扩增条带的拷带过程中，分析软件和操作
者存在着客观的和主观的原因。第四，所用的候选引
物数量还不够多，可以再增加，这在一定程度上可以
减少实验结果分析的误差以及种问和种群间遗传多
样性所产生的影响。
对于RAPD多态性较少和稳定性不高的缺点，
在实验设计的时候就已考虑到了。在筛选引物的时
候，笔者用了3种石斛材料的DNA对100种随机
引物进行逐一筛选，选出在3种石斛材料中均有3
条以上条带的引物进行扩增。选出的引物在一定程
度上可以作为石斛屑植物的通用引物。随着分子标
I
2
3
4
5
6
7
8
9
0
1
2
3
万方数据
·592· 中革蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第4期2006年4月
记技术的发展，各种新的技术不断产生，如果要科
学、准确地对植物的遗传多样性和亲缘关系进行研
究，还得运用多种分子标记技术，将每种标；己的结果
和传统的分类结果进行全面的比较和分析，才能获
得令人信服的结果。
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模式识别在白芍质量控制中的应用
冯雪松1．刘骓茹’，张克荣!，
(1中国医科大学药物分析学敦研室．辽宁沈阳 11()()()i
郭晓明。，刘俊亭。
2．沈阳药科大学药学院，辽宁沈|；口 1100161
摘要：目的 旨在通过通用性强的中药色谱数据特征的抽取和神经网络识别，建立白芍的质量评价模式。方法
首先通过实验获取同一品种小同质量29个白芍样本的高敛液相色潜数据，然后依照非线性的核主成分分析
(KPCA)进行数学特征提取．将取得的压缩数据，输人BP神经阿络进行学习，运用训练后的网络识别白芍的质量
分类。并探讨了模式识别中人工神经网络的数据预处理、网络隐含层数、隐节点数、激励函数和过拟合现象等。结果
通过改良后网络训练，已成功地识别白芍药材质量类别(识别率100％)。结论非线性特征提取K1’CA法与人工
神经网络结合适用于白芍整体质量分析。
美键词：白芍；质量；高教液相色谱；非线性的核土成分分析
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：02532670(2006)04—0592—04
ApplicationofchemicalpatternrecognitiontoqualitycontrolofRadixPaeoniaeAlba
FENGXue—son91．I。IUYarul，ZHANGKe—ron92，GUOXiao—min91，I。IUJtin—rlng。
(1．DepartmentofPharmaeeuticaIAnalysis，ChinaMed c lUniversily，Shenp≈11000i·China；
2．CollegeofPharnmcy．ShenyangPharm ceuticalUniversitytShenyang110016，China)
Abstract：ObjectiveWithgeneralizationandsteadiness，anewevaluationmodelbyIntegratingNo
I。inearFeaturesextractionalgorithmwithartificielneuralnetworks(ANN)usedforpatternrecognitionof
qualitycon{FOfofRadixPaeonlaeAlbawasproposedinthispaper，MethodsT eHPI，Cdatafrom29
sampleswithdifferentqualilywereproceededwithnonlineark rnelprincipalcomponentanalysis(KPCA)
andanimprovedBackpropagationlg rithmofANN．TheextractcharacteristicswasfedintoBPneural
networksasinputelementsforpatternrecognition．Inthemeantime，theproc ssingdata，theoptimal
numbersofhiddenlayers．thenumbersofhiddennodes，excitationfunctions，andover—fitting，etc．were
discussedwhollysothatstandardlzalionnetworkswasdesignedwithoutjamming．ResultsA recognition
ratioWaS100％，thepatternrecognitionofqualitycontrolofRadiaPaeoniaeAlbawasestablished
sueeessluIlybytrainedtworksandpredictedresults，ConclosionIntegratingKPCAalgorithmwith
ANNforpatternrecognitionofqualitycontrolofRadixP口eM如PAlbahasbeenprovedtobeavailable．
Keywords：RadixPaeoniaeAlba；quality；HPLC；kernelprincipalcomponentanalysis(KPCA)
箨萋磊羿；驽誓嚣警籍贯辽宁锦州，讲挪，硕士，毕业于沈阳曲科大学药物分析专业，研究方向为中葑质量分析
lel：13889161239Email．⋯ce山r@21cncom．feedar@sinacoHi
万方数据
利用RAPD分析13种石斛属植物的遗传多样性和亲缘关系
作者： 王慧中， 卢江杰， 施农农， 应奇才， WANG Hui-zhong， LU Jiang-jie， SHI Nong-
nong， YING Qi-cai
作者单位： 杭州师范学院生物化学与分子生物学杭州市重点实验室,浙江,杭州,310036
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(4)
被引用次数： 14次

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4. 金国虔.蔡春海.于凌杰.李萍.叶波平.Jin Guo-qian.Cai Chun-hai.Yu Ling-jie.Li Ping.Ye Bo-ping 霍山地
区4种石斛属植物的遗传多态性分析[期刊论文]-药物生物技术2006,13(1)
5. 刘石泉.李小军.余庆波.周根余.LIU Shi-quan.LI Xiao-jun.YU Qing-bo.ZHOU Gen-yu 霍山石斛及相似种的位
点特异性PCR鉴别[期刊论文]-中草药2006,37(1)
6. 白音.包英华.王文权.姜丽丽.阎玉凝.BAI Yin.BAO Ying-hua.WANG Wen-quan.JIANG Li-li.YAN Yu-ning 国产
石斛属植物亲缘关系的AFLP分析[期刊论文]-园艺学报2007,34(6)
7. 彭锐.李泉森.李隆云 石斛的分子生物学鉴定--基于RAPD分析[期刊论文]-西南农业大学学报(自然科学版)
2004,26(4)
8. 袁佐清.张建勇.刘涛.YUAN Zuo-qing.ZHANG Jian-yong.LIU Tao 石斛属植物rbcL基因序列变异和系统发育初步
研究[期刊论文]-时珍国医国药2009,20(7)
9. 魏丹红.徐红.王燕燕.王峥涛.WEI Dan-hong.XU Hong.WANG Yan-yan.WANG Zheng-tao 金钗石斛遗传多样性研究
的ISSR-PCR反应体系建立与优化[期刊论文]-上海中医药大学学报2007,21(4)
10. 虞泓.和锐.倪念春.张时刚 石斛属4种植物的AFLP分析[期刊论文]-中草药2004,35(7)

引证文献(14条)
1.仇萍.刘春林.盛孝邦.黄宇明.张光贤 菝葜RAPD扩增条件优化[期刊论文]-中草药 2010(11)
2.周玉碧.叶润蓉.卢学峰.刘洋.彭敏 牛血清白蛋白在锁阳RAPD分析中的作用[期刊论文]-农业科学与技术（英文版
） 2007(3)
3.周玉碧.叶润蓉.卢学峰.刘洋.彭敏 牛血清白蛋白在锁阳RAPD分析中的作用[期刊论文]-安徽农业科学 2007(28)
4.苑鹤.林二培.朱波.俞巧仙.斯金平 铁皮石斛人工栽培居群的遗传多样性研究[期刊论文]-中草药 2011(3)
5.樊洪泓.李廷春.邱婧.林毅.蔡永萍 石斛属几种植物遗传关系的SRAP和RAPD比较分析[期刊论文]-中草药 2010(4)
6.冯尚国.胡旭.赵红燕.王慧中 DNA分子标记在铁皮石斛研究中的应用[期刊论文]-中草药 2010(3)
7.唐铖.张铁军.刘昌孝 基于PCR技术的中药指纹图谱研究[期刊论文]-天津中医药大学学报 2007(3)
8.李戈.李荣英.高微微 药用石斛规模化种植中的病害问题及防治策略[期刊论文]-中国中药杂志 2013(4)
9.卢家仕.卜朝阳.吕维莉.何荆洲.苏建睦.黄昌艳 20份兰科植物的ISSR遗传多样性分析[期刊论文]-西南农业学报
2012(6)
10.杨春勇.李学兰.王云强.唐德英.张忠廉.高微微 人工栽培石斛的ISSR标记分析[期刊论文]-中国农学通报
2011(4)
11.刘伟.陈美霞.魏日凤 石斛属植物开发利用研究进展[期刊论文]-亚热带农业研究 2011(2)
12.刘静.何涛.淳泽 分子标记技术在石斛属植物中的应用研究进展[期刊论文]-应用与环境生物学报 2008(6)
13.宋君.雷绍荣.郭灵安.向冰 DNA指纹技术在食品掺假、产地溯源检验中的应用[期刊论文]-安徽农业科学
2012(6)
14.黄海.李劲松.曹兵 分子标记技术在石斛属植物种质资源研究中的应用[期刊论文]-生物技术通报 2010(4)


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