全 文 ：中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第31I卷第8期2007年8月·1235·
药材与资源
白藜芦醇合酶基因的克隆及丹参的转化
陈海敏1’2，徐妙云2，李刚强2，郝雯静1，魏昭荣2，艾铁民H，刘德虎2
(1．北京大学药学院，北京100083；2．中国农业科学院生物技术研究所，北京100081)
摘 要：目的 为探索利用分子生物学技术培育新型药用植物的新途径，将外源的白藜芦醇合酶(RS)基因导入
到丹参中表达，以改善或增加丹参的效用。方法 根据已公布的核苷酸序列，利用引物悬挂延伸法，经过3次扩增，
最终从葡萄基因组DNA中获得完整的RScDNA基因序列；以质粒pBin438为基础，构建含有RS目的基因的组
成型植物表达载体。在根癌农杆菌介导下，利用叶盘法转化丹参，进而通过PCR、PCR—Southern杂交对不同的转基
因植株进行筛选与检测。结果总共得到了45棵卡那霉素抗性植株，经PCR和PCR—Southern杂交检测，确定葡
萄RS基因已整合到部分转基因丹参苗的基因组中。结论成功建立了白藜芦醇合酶基因转化丹参的体系，并获
得了转基因植株。
关键词：白藜芦醇合酶(RS)基因；丹参；根癌农杆菌；白藜芦醇；PCR—Sounthern杂交
中图分类号：R282．2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)08—1235—04
CloneofresveratrolsynthasegeneandtransformationofSalviamiltiorrhiza
CHENHai—minl’2，XUMiao—yun2，LIGang—qian92，HAOWen—jin91，
WEIZhao—ron92，AITie—minl，LIUDe—hu2
(1．SchoolofPharmacy，PekingUniversity，Beijing100083，China；2．InstituteofBio echnology，
ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100081，China)
Abstract：ObjectiveToexploreanewmethodofproducingnovelmedicinalpl ntsbymolecular
biologicaltechnique．Aresveratrolsynthase(RS)genewasfirstlyxpressedinSalviamiltiorrhizafor
improvementandincreaseofthepotentialofS．miltiorrhiza．MethodsBas donthepublishednucleotide
sequences，theintacteDNAsequenceofRSwasobtainedaccordingtoover—hangextensionPCRprotocol
withgrapeg nomicDNAastemplatethroughthreetimesofamplifications．Aplantcomponentexpression
vectorcontainingtheRSgenewasconstructed，whichwasderivedfromplasmidpBin438．TheRSgene
wastheni troducedintoS．miltiorrhizawitht e1eafdiscmethodme iatedbyAgrobacteriumumefaciens．
TheregeneratedplantswereassayedbyPCRandPCR—Southernblottinga alysis．ResultsTheto al45
Kanamycin—resistantplantswereobtainedfromthistransformation．TheresultsofPCRandPCR—
SouthernanalysisconfirmedthattheRSgenehadbeenintegratedintothegenomeofsomeregenerated
plantsofS．miltiorrhiza．ConclusionAnefficienttra sgenicsystemofS．miltiorrhizabyRSgeneis
establishedandsometransgenicplantsareobtainedfromthistransformation．
Keywords：resveratrolsyn hase(RS)gene；SalviamiltiorrhizaBunge；Agrobacteriumtumefacien
(Smithe Townsend)Conn；resveratrol(Res)；PCR—Southernb otting
白藜芦醇(resveratrol，Res)是植物体在恶劣
环境下或遭遇到病原体侵害时产生的天然二苯乙烯
类多酚物质，不仅可抵御霉菌的感染，并对人体也具
有多种作用，如防治心血管疾病、抗肿瘤、抗病毒及
免疫调节等功能口]。白藜芦醇由白藜芦醇合酶
(resveratrolsynthase，RS)催化4一香豆酰辅酶A
和丙二酰辅酶A合成，两前体作为查耳酮合成酶底
物在植物中普遍存在[2]。因此导人白藜芦醇合酶基因
就足够在其他植物中合成需要的白藜芦醇[3]。
目前已从葡萄和花生中克隆出RS基因，并成
功导人到一些植物中，如烟草、小麦、马铃薯、水稻、
西红柿和小白菜等。据报道不仅烟草、西红柿和马铃
薯等对霉菌的抗病性得到增强[4]，通过白藜芦醇在
植物体内的产生与积累也培育出了药食兼用的蔬菜
收稿日期：2006—11-13
作者简介：陈海敏(1983一)，女，浙江温岭人，北京大学2004级硕士研究生，主要研究方向为天然药物化学。
*通讯作者艾铁民Tel；(010)82802685刘德虎Tel：(010)68919865
万方数据
·1236· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第3s卷第8期2007年8月
和水果[5“]。
丹参作为治疗心血管疾病的药物广泛应用于临
床，机制主要是通过防止H_-ATP酶水解、清除氧
自由基、扩张冠状动脉和抗血小板聚集等起到治疗
作用[73；而白藜芦醇的机制主要是通过与雌激素受
体结合来调节血液中的胆固醇水平，抑制铜介导的
低密度脂蛋白的氧化，从而达到预防心脏疾病的效
果随]。本研究利用白藜芦醇的药理活性，通过克隆葡
萄玫瑰香和巨峰中的白藜芦醇合酶基因，构建组成
型植物表达载体，并将它导入到丹参基因组中，培育
出高效表达白藜芦醇的丹参植株。不仅可以利用生
物反应器来大量生产白藜芦醇，还有可能通过白藜
芦醇和丹参在心血管防治方面的协同作用来增加丹
参的疗效，增强丹参的抗病性，改善丹参的品质。
1材料
1．1 菌种及质粒：DH5a为本室保存；pBin438质粒、
根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacien)LBA4404
和含辅助质粒pRK2031的大肠杆菌[Escherichiaoli
(Migula)CastellanietCha mers]均由本室保存；
pCFT—T载体购自天为时代生物公司。
1．2 抗生素和植物激素：卡那霉素(Kanamycin，
Kan)、链霉素(Streptomycin，Str)、头孢噻肟
(Cefotaxime，Cef)购自上海生物工程公司，6一苄氨
基嘌呤(6一BA)购自拜尔迪公司。
1．3 分子生物学试剂：Taq酶，dNTP，X—Gal和
IPTG购自天为时代生物公司；T4DNALignase，
限制性内切酶SalI、BamHI购自TaKaRa公司；
其他生化试剂均为国产分析纯试剂。
1．4植物材料：丹参SalviamiltiorrhizaBunge、葡
萄玫瑰香VitisviniferaL．CV．MuscatHamburg、葡
萄巨峰V．viniferaL．CV．Kyoho由北京大学药学
院艾铁民教授鉴定。
2方法
2．1 引物悬挂延伸法扩增RScDNA及序列分析：
CTAB法提取新鲜的葡萄巨峰和玫瑰香果皮基因
DNA[9]。根据美国生物技术信息中心(NCBI)
GenBank上所公布的RS基因序列(AFl28861、
AB046373、X76892、AABl9 87 F274281)，设计
了两组简并引物，其中R1和R2分别与白藜芦醇
合酶第1个外显子的上下游序列互补；R3和R4分
别与自藜芦醇合酶第2个外显子的上下游序列互
补；此外，为使两个外显子的扩增产物在退火时能头
尾相接，在R2和R3引物之间有16个核苷酸碱基
因是完全互补的。R1：5，_GG ATCCAACAAT
BanHI
C T
GGcTTcAGTTGAGGAAA TAG-3；R2：5
7一A—
T
TCATGATTTGTCACATATGCGATTGAAC—
G
TTCTTCTC一37；R3：57一AAGTTCAATCGCATA—
A
TGTGAcAAATc
c
ATGATcAAGAAG一37；R4：
A CG
57一CGTCGACTTAATTTGTAC AGGA一
—瓦—万一 C TA
ATGCTATG一37。
引物悬挂延伸PCR扩增巨峰和玫瑰香葡萄的
RScDNA[10|，冻融法回收RScDNA，然后与
pCFT—vector连接，转化E．coliDH5a，蓝白菌落筛
选阳性克隆[11|，碱法提取质粒，通过酶切、PCR鉴定
重组子，将正确克隆命名为pTRSJ和pTRSM
(pTRSJ由葡萄巨峰克隆得到，pTRSM由葡萄玫瑰
香克隆得到)，重组子由上海生工生物工程技术公司
完成序列分析。
2．2 质粒载体构建和农杆菌培养：用SalI和
BamHI酶切含目的基因的质粒pTRSJ、pTRSM
和植物表达载体pBin438，T4DNA连接酶连接目
的基因片段和载体片段，得到重组植物表达载体，命
名为pBRSJ和pBRSM。三亲融合法[93将重组植物
表达载体克隆菌与含协助质粒pRK2013的E．coli
和含Ti质粒的根癌农杆菌LBA44043者融合，在
含50mg／LKan和50mg／LStr的YEB培养基
28。C培养，以得到融合有目的基因质粒的农杆菌。
2．3 叶盘法转化丹参：挑取融合好的农杆菌单菌落
于50mLKan／Str液体YEB中，28℃，200r／min
摇菌过夜至A。。。为1．0左右，4000r／min离心10
rain收集菌体，用MS。液体培养基洗涤一次，离心收
集沉淀后再加25mLMS。重悬，倒至小瓶中即为侵
染液。剪取一定大小的外植体(o．5cm×0．5cm左
右的幼嫩丹参叶片)，放至侵染液中浸泡5～10
rain，用滤纸吸干，转到覆盖一层滤纸的共培养基
(MS。+2．0mg／L6一BA)中暗培养4d。将共培养后
的外植体转到选择培养基(MS。+1．0mg／L6一
BA+20mg／LKan+400mg／LCef)中进行光照培
养，每2周继代一次。1～2个月，待再生芽长到2cm
左右时，将芽切下转到生根培养中(1／3MS。+15
mg／LKan+400mg／LCef)中生根。当再生苗生出
健壮的根并长至5～6am高时，将其移人蛭石中炼
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第8期2007年8月·1237·
苗，定时用1／2MS。营养液浇灌，待生长良好后，再
移入田间。
2．4转基因丹参的检测：CTAB法小量提取抗性
丹参植株和未转基因植株的基因组DNA，对RS基
因进行PCR扩增鉴定。引物为R1和R4，PCR反
应程序：94℃、5min，94。C、45S，58℃、45S，72℃、
60S，30个循环；72℃、10min。
PCR—Southern进一步确定基因整合情况，将
PCR产物经0．8％琼脂糖电泳后，经变性、中和、转
膜，并按照Roche公司的DIGNucleicAcid
DetectionK t试剂盒进行探针制备、预杂交、杂交、
洗膜。
3结果与讨论
3．1 目的基因的扩增与测序：引物悬挂延伸PCR
扩增法扩增得到巨峰和玫瑰香葡萄的RScDNA
(图1)。将扩增得到的两个基因序列与NCBI上的
RS基因序列比对，核苷酸同源性最高达98．1％，最
低93。6％，拟推导的氨基酸同源性最高达98．5％，
最低93．0％，而本研究中的两个RS基因之间的核
苷酸序列同源性为93．3％，氨基酸序列同源性为
93．3％。
泳道1、2一巨峰和玫瑰香RS基因第一外显子的扩增条带
泳道3、4一巨峰和玫瑰香RS基因的第二外显子的扩增条带
泳道5-XDNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准
泳道6、7一巨峰和玫瑰香RScDNA
Lanes1and2-PCRamplificationofextron1 ofRSgenelanes
3 and4-PCRamplificationofextron2 ofRSgenelane5-k
DNA／EcoRI+HindⅢrelativemolecularmarkerslanes6
and7-amplificationofRSeDNA
图1 RS基因的两外显子扩增产物及退火延伸结果
Fig．1PCRAmplificationoftwoextronsfRSgene
andRScDNAandresultsofannealingextension
3．2植物表达载体的构建和三亲融合结果：pBRSJ
和pBRSM质粒经SalI和BamHI双酶切所得
片段的大小与预期结果相符，表明RS基因已成功
构建到pBin438植物表达载体中。三亲融合后的农
杆菌能在含适量Kan和Str的YEB培养基上生
长，菌落PCR得到1。2kb的条带，说明pBRSJ和
pBRSM质粒已通过协助质粒pRK2013转移到根
癌农杆菌LBA4404中。
3．3 转基因植株的获得：丹参叶片外植体在选择培
养基上培养2周左右产生颗粒状愈伤组织和丛生芽，
继续培养，从愈伤组织中产生更多的丛生芽，待芽生
长20d将其移至含有抗生素的生根培养基中，转入
温室生长的转基因植株生长良好(图2一A～D)。
A一愈伤组织形成B幼芽形成C一完整植株形成D一移至花
盆中的转基因丹参植株
A—-formationofealliB—-regenerationofshootsC——regeneration
ofintactplantletD—transgenicplantletofS．miltior7’hiza
图2转RS基因丹参的培育过程
Fig．2RegenerationofRStransgenicS．miitiorrhiza
从pBRSJ载体转化后的丹参外植体中，总共得
到40棵卡那霉素抗性植株；而经pBRSM载体转化
的丹参外植体，由于幼芽玻璃化严重，最后只得到5
棵卡那霉素抗性植株。
在丹参转化过程中，部分幼芽会出现比较严重
的玻璃化幼苗现象，主要表现为叶和嫩梢呈水晶透
明或半透明，失绿。通过增加培养基中的琼脂粉量
(达0．75％)、降低6一BA量(由2．0mg／L降至1．0
mg／L)、增加透气性或转移到生根培养基后，部分已
发生玻璃化的植株还可以转为正常苗。
3．4转基因丹参的检测：对部分丹参的抗性植株进
行PCR检测均扩增出1．2kb的目的条带，而未转
基因植株未扩出任何带(图3)。初步表明目的基因
已经转入到丹参基因组中。
PCR扩增虽然非常灵敏，但有时会出现假阳性
扩增，因此对外源基因是否整合的最后确定需要对
扩增产物进行Southern杂交。对PCR阳性株再进
行PCR—Southern杂交检测，发现PCR阳性植株都
产生了杂交信号，阴性植株并无信号(图4)，说明白
藜芦醇合酶基因已经整合到丹参基因组中。
万方数据
·1238· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第8期2007年8月
泳道M—XDNA／BamHI+日i”d1I相对分子质量标准
泳道1一阳性质粒扩增产物 泳道2一未转基因植株扩增产物
泳道3～9-转基因植株扩增产物
LaneM一^DNA／BarnHI+HindⅢrelativemolecularmarkers
lane1一amplifiedpro uctofpositiveplasmidlane2-amplified
productofnon—transgenicpla tlanes3—9一amplifiedproduct
oftransgenicplant
图3卡那霉素抗性植物PCR检测结果
Fig．3PCRAnalysisofKan—resistantpl s
泳道1一阳性质粒扩增产物泳道2一未转基因植株
泳道3～5一部分卡那霉素抗性植株
Lane1一amplifiedpro uctofpositiveplasmidlane2-amplified
productofnon—-transgenicpla tlanes3--5——amplifiedproduct
ofsomeKan—resistantplants
图4卡那霉素抗性植株PCR—Southern杂交检测
Fig．4PCR—Southernblottingdetection
ofsomeKan—resistantpl s
4讨论
目前为止，转白藜芦醇合酶基因植物的研究多
是为了提高经济作物(如小麦)的抗菌性，或者为了
开发新的保健食品、蔬菜。白藜芦醇在心血管等方面
的防治作用显示了其在转基因药物具有极大的发展
前景。本研究通过克隆葡萄的白藜芦醇合酶基因，构
建了植物表达载体；通过根癌农杆菌介导的叶盘法
转化得到了抗性丹参植株，部分抗性植株经PCR
和PCR—Southern检测确定了白藜芦醇合酶基因在
丹参中的表达。含有白藜芦醇合酶基因的转基因丹
参有望加强丹参在心血管等方面的治疗作用，并增
强丹参自身的抗病性，本研究探索了用生物技术方
法构建新药用植物的方法。
以转基因方式导入新的外源RS基因后，下一
步将确定转基因丹参植株中白藜芦醇的表达情况。
此外，含有白藜芦醇的转基因丹参能否加强丹参在
心血管等方面的治疗作用以及能否增强丹参自身的
抗病性也是进一步研究的课题。
致谢：本研究工作主要在中国农业科学院生物
技术所完成，并得到了刘德虎研究员的悉心指导。
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白藜芦醇合酶基因的克隆及丹参的转化
作者： 陈海敏， 徐妙云， 李刚强， 郝雯静， 魏昭荣， 艾铁民， 刘德虎， CHEN Hai-min，
XU Miao-yun， LI Gang-qiang， HAO Wen-jing， WEI Zhao-rong， AI Tie-min， LIU
De-hu
作者单位： 陈海敏,CHEN Hai-min(北京大学药学院,北京,100083;中国农业科学院生物技术研究所,北京
,100081)， 徐妙云,李刚强,魏昭荣,刘德虎,XU Miao-yun,LI Gang-qiang,WEI Zhao-
rong,LIU De-hu(中国农业科学院生物技术研究所,北京,100081)， 郝雯静,艾铁民,HAO
Wen-jing,AI Tie-min(北京大学药学院,北京,100083)
刊名： 中草药
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