全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·729·
银杏苦内酯B对重症急性胰腺炎大鼠p38丝裂原活化
蛋白激酶活性的影响
刘丽荣，夏时海+，赵志玲，邸瑶
(武警医学院附属医院消化内科胰腺中心，天津300162)
摘要：目的观察银杏苦内酯B(BN52021)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠胰腺组织p38丝裂原活化蛋白激酶
(p38MAPK)活性的影响。方法Wistar雄性大鼠随机分为阴性对照组(NC组)、SAP模型组(SAP组)、
BN52021治疗组(BN组)，每组按术后不同时相点(1、2、3、6、12、24h)分为6小组，用Westernblotting法分别检
测胰腺组织p38MAPK表达与激活情况，同时对胰腺组织进行病理学观察和测定血清淀粉酶活性的变化。结果
血清淀粉酶和病理学结果显示SAP造模成功，BN52021能降低SAP大鼠的血清淀粉酶活性，病理学评分在3、6、
12h较SAP组显著降低(P各时相点均较NC组显著升高(尸<0．05)，BN组在6、12、24h较SAP组显著降低(P<0．05)。结论BN52021
可部分抑制SAP大鼠胰腺组织p38MAPK的活化，从而发挥其治疗作用。
关键词：胰腺炎；银杏苦内酯B(BN52021)；p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2067)05—0729—04
EffectofginkgolideBonp38mitogen—activatedproteink aseactivity
inratpancreaswithevereacutepancreatitis
LIULi—rong，XIAShi-hai，ZHA0Zhi-ling，DIYao
(DepartmentofGas roenterology，PancreasCenterofAffiliatedHospitalofMedicalCo legeofthe
ChinesePeople
7
SArmedPoliceForces，Tianjin300162，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheffectsofginkgolideB(BN52021)onp38mitogen—activated
proteink ase(p38MAPK)activityinratpancreaswithevereacutepancreatitis(SAP)．MethodsOne
hundredaneightyWistarmaleratswererandomlydividedintothreegroups，whichincludednegative
contrastgroup(NC)，SAPmodelgroup(SAP)andBN52021treatinggroup(BN)．Theratsofeachgroup
werefurtherrandomlydividedintosixsubgroupsatdifferenttimepointsincluding1，2，3，6，12，and24
h．Theactivitiesofserousamylaseweredetectedintheratsofeverysubgroups，andthexpressionand
activationofp38MAPKinpancreastis uew redetectedbyWesternblotting。andthepathologicchange
ofpancreasw observedbymicroscopeafterHEdyeing．ResultsThere ultsofdetectionofserous
amylasendpathologyshowedthatSAPmodelsweresuccessfulandBN52021candepresstheactivitiesof
serousamylaseinSAPgroupandamelioratepathologicalscoreofpancreas(3，6，and12h 尸<0．05)
comparedtoSAPgroup．IntheratpancreasoftheNCgroup，theslightphosphorylatedp38MAPKcanbe
detected．ComparedwiththeNCgroup，theactivationofp38MAPKweresignificantlyhigheratevery
timepointsintheSAPandBNgroup(P<0．05)．IntheBNgroup，thechangeofp38MAPKexpression
andactivationsynchronizedwiththatoftheSAPgroup，butat6，12，and24hpoints，thelev lofp38
MAPKwasignificantly10wer(PMAPKinratpancreaswithSAPandexerts+itstherapeuticeffect．
Keywords：pancreatitis；ginkgolideB(BN52021)；p38mitogen—activatedproteinkinase(p38
MAPK)
重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，
SAP)病情凶险，致病因素复杂多样，发病机制迄今
尚未完全明了，仍系临床难治性疾病。随着对信号转
导通路在其发病机制中的作用的深入研究，近年发
收稿日期：2006—07—31
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30300465)
作者简介：刘丽荣(1974一)，女，辽宁盘锦人，主治医师，在读硕士研究生。
*通讯作者夏时海Tel：(022)60578765Fax：(022)24370605E—mail：xshhcx@sina．corn
^
万方数据
·730· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月
现，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen—activated
proteink nase，MAPK)信号通路在SAP病程中
的作用不容忽视，其中p38MAPK作为应激激活的
MAPK信号转导通路，在机体炎症反应调控过程中
发挥极其重要的作用，该信号通路在炎性反应过程
中的主要功能是在转录后水平控制炎症介质基因表
达D,z]。已有大量体外实验和体内实验证明，胰腺炎
时p38MAPK活性明显升高。针对血小板活化因子
(plateletactivatingfactor，PAF)在SAP发病机制
中的作用，以及PAF的信号转导机制，本实验选用
天然的PAF受体拮抗剂银杏苦内酯B(BN52021)
治疗SAP大鼠，主要探讨其对SAP大鼠胰腺组织
p38MAPK活性的影响，为其治疗SAP提供一定
的理论依据。
1材料与方法
．
1．1 主要试剂与仪器：BN52021(质量分数90％)、
牛磺胆酸钠(Sigma公司)，淀粉酶试剂盒(北京科
美试剂公司)，抗p38MAPK抗体、磷酸化p38
MAPK抗体(SantaCrus公司)，聚偏二氟乙烯
(PVDF膜)(Millipore公司)，ECI液(Santacruze
公司)，预染marker(北京天为时代生物技术有限
公司)。DYY一12电泳仪、电转印仪(北京六一仪器
厂)，凝胶扫描成像系统(Bio—Rad公司)，垂直电泳
仪(Brad—boid公司)。
1．2实验动物分组与模型制备：雄性Wistar大鼠
(军事医学科学院实验动物中心)180只，随机分为
阴性对照组(NC，，z=60)、SAP模型组(SAP，n一
60)和BN52021治疗组(BN，咒一60)，3组按术后
不同时相点又随机分为1、2、3、6、12、24h6个小
组，每小组为10只。参照Aho等口1方法制备SAP
模型，Wistar大鼠称重，标记，术前24h禁食，自由
饮水。0．4％戊巴比妥钠(40mg／kg)ip麻醉，仰卧
位固定后，于上腹正中做2am切口进入腹腔，找到
大鼠的十二指肠和胆胰管后，用无创血管夹夹住胆
胰管肝端，用钝头针头经十二指肠浆肌层行胆胰管
逆行穿刺术，穿刺成功后，微量注射器逆行胰胆管内
注射5％牛磺胆酸钠(o．1mL／100g)，推注速度
0．20mL／min。推药后用无创血管夹夹住胰胆管人
十二指肠处，观察10min，去除血管夹，确认腹腔内
无活动性出血后，两层关腹并用无菌纱布覆盖伤口，
NS组开腹后仅翻动十二指肠并触摸胰腺数次关
腹。BN组于术后15min股静脉ivBN52021(5
mg／kg)，BN52021用二甲基亚砜(DMSO)溶解，
NC组、SAP组股静脉iv等量生理盐水。
1．3标本的采集与保存：各组大鼠分别在术后1、
2、3、6、12、24h6个时相点麻醉大鼠，经右心房取静
脉血，37℃水浴10min后，3000r／min离心10
min，取上清液于消毒过的EP管中，一20℃冰箱保
存，以备测定血清淀粉酶。同时取一部分胰腺组织放
在液氮中过夜后置于一80℃冰箱冻存备用，再取
一部分胰腺组织，用40g／L中性缓冲甲醛固定，石
蜡包埋切片后HE染色制片，进行病理学观察和
评分。
1．4血清淀粉酶的检测和胰腺病理学观察与评分：
血清淀粉酶的测定，按全自动生化仪和淀粉酶试剂
盒检测。对胰腺组织标本进行胰腺病理学观察与评
分(表1)，每张切片随机选10个高倍镜视野(×
400)，按表中胰腺组织损伤病理学评分标准评分，无
表中各项病理改变计0分。
表1 SAP大鼠胰腺组织病理变化评分标准
Table1 Standardofpathologicalchangescore
inpancreasofratswithSAP
1．5 p38MAPK活性检测：提取胰腺组织总蛋白，
制备等量蛋白质样品，用SDS--PAGE进行蛋白分
离，电泳结束后电转移至PVDF膜，以含5％牛血
清白蛋白的TBST溶液室温封闭1h，一抗兔来源
的磷酸化p38MAPK多抗1：1000稀释4℃孵
育过夜，再与二抗(HRP标记的羊抗兔IgG)4℃
孵育过夜。ECL化学发光试剂检测阳性信号。为校
正蛋白上样量的一致，曝光后的膜以膜解吸液(100
mmol／LpME，2％SDS，62．5mmol／Ltris—HCl，
pH6．7)于50℃洗脱30min，然后封闭，再用抗
p38总蛋白抗体检测作为内对照。照片用Bio—Rad
图像处理系统采集X线片的条带，用QuantityOne
4．5图像分析软件进行条带灰度扫描。以上实验均
重复3次，取其平均值为最终数据。
1．6统计学分析：所有数据用X±s表示，组间比较
应用统计学软件SPSSII．5单因素方差分析。
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·731·
2结果
2．1 血清淀粉酶和病理学观察：血清淀粉酶结果显
示，SAP组和BN组在各时相点较NC组显著升高
(P<0．05)，但BN组在3、6、24h较SAP组显著
降低(P时相点腹腔内未见明显异常，胰腺结构大致正常；
SAP组有血性腹水，胰腺有坏死灶，肠系膜、大网膜
上有大量皂化斑，胰腺间质和腺小叶炎症细胞浸润，
有弥漫性出血及片状坏死，随着时间后移，病变逐渐
加重；BN组在中后期较SAP组有所减轻。病理学
评分结果显示，SAP组和BN组在各时相点较NC
组显著升高(PSAP组显著降低(P<0．05)，见表3。
2．2 p38MAPK的表达与激活情况及BN52021
的影响：NC组在各时相点胰腺组织只检测到少量
磷酸化的p38MAPK(p—p38)，见图l—A。SAP组和
BN组在各时相点胰腺组织中p38MAPK的激活
均较NC组显著升高(P的p38MAPK的激活在造模后即迅速增加，3h达
高峰，6、12h仍维持较高水平，在24hp38MAPK
磷酸化水平仍高于NC组，见图1一B。BN组p38
MAPK表达与激活的变化趋势在时相点上与SAP
组一致，但在6、12、24h较SAP组显著降低(P<
0．05)，见图l—C和图2。
表2 BN52021对SAP大鼠血清淀粉酶活性的影响(；土s，n=30)
Table2 EffectofBN52021onserousamylasectivityofratswithSAP(；士s，n=30)
与NC组比较：。P<0．05；与SPA组比较：4P<0．05
。P<0．0505NCgroup：4P<0．05USSAPgroup
表3各组SAP大鼠胰腺组织病理评分(；土s，n=30)
Table3 Patho—scoreofpancreasinratswithSAPamongeverygroups(i士S，n=30)
与NC组比较：’P’P<0．05sNCgroup：4P<0．05wSAPgroup
图1 BN52021对SAP大鼠胰腺组织中p38MAPK激活的影响
Fig．1EffectofBN52021onactivationofp38MAPKinpancreasofratswithSAP
3讨论
SAP是多种致病因素使胰酶异常激活导致胰
腺自身消化，继而引起胰腺和全身性的炎症反应。应
激状态下炎性细胞因子较多，如肿瘤坏死因子
(TNF)、白细胞介素(IL)和PAF等，它们之间存
在复杂的相互作用，形成连锁式反应。其中PAF是
内源性的脂质介质。在适宜的刺激下，体内多种细胞
能够合成和释放PAF，特别是参与炎症反应的细
胞，如单核／巨噬细胞、多形核白细胞、噬酸性粒细
胞、噬碱性粒细胞、血小板、肥大细胞、血管内皮细胞
和淋巴细胞等[4’5]。PAF具有广泛的生物活性。体外
实验表明，PAF能够促进白细胞的趋化、聚集、分泌
颗粒和产生氧自由基，促进白细胞与内皮细胞黏附；
参与变态反应、创伤愈合、动脉粥样硬化、血管发生、
细胞凋亡、生殖和长时程增强等病理生理过程[4~6]。
PAF的生物学活性是通过与其受体特异结合，激活
多条细胞内信号转导途径而后产生的。PAF受体属
于G蛋白偶联受体(GPCR)家族。结合了PAF的
万方数据
·732· 中革莴ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月
与NC组比较：。P<0．05，与SAP组比较：4P<0．05
’P<0．057d$NCgroup；。P<0．05wSAPgroup
圈2 BN$2021影响SAP大曩胰腺组织中p38MAPK
激活的时效关系
Fig．2Time—effectrelationshipofBN$2021onactivation
ofp38MAPKinpancreasofratswithSAP
受体可激活磷脂酶C(PLC)，通过激活百日咳毒素
不敏感性Gaq蛋白、腺苷酸环化酶，提高cAMP水
平，进而激活蛋白激酶A(PKA)，还能够激活
MAPK信号通路中的细胞外信号调节激酶
(extracellularsignal—regulatedkinase，ERK)、p38
MAPK和c—Jun氨基末端激酶(c—JunN—terminal
kinase，JNK)途径[7]。其中p38MAPK信号通路
在炎性反应过程中发挥重要作用，其主要功能是在
转录后水平控制炎症介质基因表达。已有大量体内
外实验证明，胰腺炎时p38MAPK活性明显升高，
同时伴随多种细胞因子基因表达的上调和血清水平
的增高。在本实验中，也检测到SAP大鼠胰腺组织
中p38MAPK的激活明显增强，SAP组胰腺组织
的p38MAPK的激活在造模后即迅速增加，3h达
高峰，6、12h仍维持较高水平，在24hp38MAPK
磷酸化水平仍高于对照组。
在本实验应用BN52021治疗SAP大鼠，目的
是探究阻止PAF信号向下游传递，能否对p38
MAPK的激活起到抑制作用，从而揭示BN52021
治疗SAP的分子机制。银杏苦内酯是银杏树叶和根
皮提取物中的双萜内酯，是天然的特异性PAF拮
抗剂，其中以BN52021的作用为最强[8]。BN52021
具颇多有益的药理作用，如抗炎、抗过敏、抗氧化和
神经保护作用等。以往研究发现，用BN52021治疗
能够阻止蛙皮素诱导的炎症反应，减轻细胞破坏程
度[9]。此外，BN52021除能够降低血清淀粉酶，减轻
胰腺水肿，改善组织学评分，降低IL一6水平外，还能
够减少细菌向远处的移位，减少感染的发生机
制[10,11]。本实验结果显示，BN52021可以减轻SAP
大鼠胰腺组织损伤，减轻腹水程度，降低血清淀粉酶
水平，与以往报道一致。本室的前期工作确定了
BN52021治疗SAP的最佳有效剂量(5mg／kg)。
本实验中观察BN52021对p38MAPK表达与激活
的影响，其结果显示BN组p38MAPK表达与激活
的变化趋势在时相点上与SAP模型组一致，但在
6、12、24h较SAP组显著降低，且在各时相点较
NC组显著升高，表明BN52021可以部分抑制SAP
大鼠胰腺组织p38MAPK的活化，以中后期为著。
总之，BN52021通过阻止PAF信号的传导，部
分抑制SAP大鼠胰腺组织p38MAPK活化。本研
究为BN52021的临床应用提供了一定的理论基础。
至于BN52021对p38MAPK活化的抑制是通过
GPCR途径，还是通过干扰其他信号传导途径，比如
通过影响GPCR与蛋白酪氨酸激酶受体间交叉对
话作用来实现的，存在哪些中间信号分子，还有待进
一步研究来揭示。
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万方数据
银杏苦内酯B对重症急性胰腺炎大鼠p38丝裂原活化蛋白激酶
活性的影响
作者： 刘丽荣， 夏时海， 赵志玲， 邸瑶， LIU Li-rong， XIA Shi-hai， ZHAO Zhi-ling，
DI Yao
作者单位： 武警医学院附属医院,消化内科胰腺中心,天津,300162
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(5)

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