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蒺藜皂苷对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用
关欣，纪影实，李红，杨世杰’
(吉林大学基础医学院药理学教研室，吉林长春130021)
缺血性脑血管疾病是心脑血管疾病中的常见
病、多发病，是危害人类健康的三大疾病之一，严重
影响了人们的正常生活和身体健康。蒺藜皂苷
(grossaponinsfromTribuluserrestrlsL．，
GSTT)是从蒺藜地上部分中提取，临床主要用于
心脑血管疾病的治疗。本课题组研究I“o表明，
GSTT可减轻心肌缺血损伤，抑制心肌细胞凋亡，
减轻脑缺血神经功能缺损，改善生化指标。本实验在
此基础上进一步研究GSTT对脑缺血再灌注损伤
后神经细胞凋亡的保护作用并探讨其可能的机制。
1材料
l，1药品和试剂：GSTT，质量分数>90％，吉林敖
东洮南药业股份有限公司提供，批号20030218；尼
奠地平，天津市中央药业有限公司生产，批号
050306；红四氮唑(TTc)，中国医药上海化学试剂
总厂，批号20031103；TUNEL试剂盒，北京中杉金
桥生物技术有限公司生产；DNAladder提取试剂
盒，北京鼎国生物技术发展中心产品；免疫组化试剂
盒．北京中杉金桥生物技术有限公司产品。
1．2动物：Wistar大鼠，由吉林大学实验动物中心
提供。
1．3仪器：倒置显微镜，日本Olympus公司；水平
电泳仪，江苏海门市麒麟医用仪器厂；GIs一2008天
能凝胶成像分析仪，上海天能科技有限公司。
2方法
2，1 分组及给药：60只雄性w商ar大鼠，体重
300～350g，随机分为6组。假手术组、模型组(注
射等体积生理盐水)、阳性对照药尼莫地平组(11
mg／kg)、GSTT高、中、低剂量(30、10、3mg／kg)
组，各组均|p给药，连续给药5d，每天1次。
2．2大鼠脑缺血再灌注损伤模型制备：于末次给药
后30rain，动物ip水合氯醛(350mg／kg)麻醉。仰
卧位固定，行颈正中切口，分离暴露右侧颈总动脉、
右侧颈内动脉、右侧颈外动脉；结扎颈总动脉近心端
和颈外动脉，用动脉夹夹闭颈总动脉，并在颈总动脉
剪开一小口，将直径0．175mnl的尼龙线插入颈总
动脉约18．5mm，遇阻即止，阻塞大脑中动脉起始
部，然后逐层缝合肌肉和皮肤，单笼饲养。术后自由
进食、饮水，2h后拔出栓线使血流再灌注22h，假
手术组仅分离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，
其余同上。参照文献方法[s,4J将大鼠于术后24h进
行行为学评分，满分4分，得分高者，运动障碍明显，
选择神经功能评分1分及以上者进行下述实验。
2．3脑梗死面积测定：实验结束后，将大鼠快速断
收稿日期：200b—1210
基金项且：国家自然科学基金资助嘎且(30472020)；高校博士点基金支持资助项目(20050183029)
作者简介：关欣(1981)，女．吉林省吉林市人．硕士，主要从事心脑血管药理学研究。
Tel：(9431)5619799Email：guanxinyaoli@126com
*通讯作者杨世杰Tel：(0431)5619483Email：】cyao[i@slna．c。m
万方数据
中草蒋ChineseTraditionalandHerl№lDrugs第37卷第6期2006年6月
头取脑，分离去除嗅球、小脑和低位脑干后，保留大
脑部位，行冠状切片，切成厚约2mm的脑片。将切
片置于2％TTC磷酸盐缓冲溶液中，37℃温孵10
rain。染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而梗死组织
呈白色，用透明玻璃纸包裹后，以扫描仪描记标本的
肉眼形态学变化，根据图像分析法，计算出梗死区域
面积占大脑半球面积的百分比。
2．4 DNA琼脂糖凝胶电泳：取缺血部位脑组织
(假手术组取相同质量的手术侧大脑中动脉供血区
组织)，液氮研磨，按DNA提取试剂盒要求提取
DNA。每个泳道的上样量为10“L，用16g／L琼脂
糖凝胶电泳，电压为4V／cm，EB染色，紫外灯下观
察拍照。
2．5 TUNEL法检测神经细胞凋亡：脑组织切片常
规脱蜡至水，按试剂盒操作说明进行TUNEL染
色，成色反应后，常规脱水，二甲苯透明，封片，光学
显微镜下观察胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞。在
400X显微镜下，于缺血侧大脑皮质随机采集5个非
重叠视野检测TUNEL阳性细胞数。
2．6免疫组化染色检测Bax蛋白的表达：脑组织
切片常规脱蜡至水。按免疫组化SABC试剂盒要求
操作，成色反应后，常规脱水，二甲苯透明，封片，光
学显微镜下观察在胞浆中有棕色颗粒者为阳性细
胞。在400X显微镜下，于缺血侧大脑皮质随机采集
5个非重叠视野检测阳性细胞数。
2．7 统计学处理：结果以z±s表示，组间采用t
检验。
3结果
3．1 GSTT对脑缺血再灌注损伤大鼠梗死面积的
影响：假手术组脑组织TTC染色呈均匀的玫瑰红
色。模型组脑组织可见局灶性的白色拒染区域即梗
死灶(尸量组及尼莫地平阳性药组梗死面积与模型组比较明
显缩小(P低剂量组亦有一定作用，但无统计学意义(P>
0．05)．结果见表1。
3+2琼脂糖凝胶电泳结果：DNA琼脂糖凝胶电泳
结果显示，假手术组呈现正常基因组条带。模型组和
GSTT低剂量组可见典型的DNAladder图谱，断
裂的DNA片段约为180bp或其整数倍。阳性药及
GSTT高、中剂量组未见明显凋亡特征性条带，结
果见图l。
3．3 GSTT对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋
亡的影响：TUNEl。染色结果显示，假手术组凋亡细
表l蒺藜皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤梗死面积的
影响(；士s，H一10)
Table1 EffectofGSTToninfarctionareaI cerebral
ischetniareperfusionrats(，土s，n—10)
与假手术组比较：△△6p与模型组比较：一P<0．01⋯P△△△P<0．001口5Shamgroup
。。P<0．01’～PM—MarkerA假手术组B徭型组C一尼要地平组
D～F蒺藜皂苷30，10、3mg／kg组
MMarkerA—Shaalgroupt}modelgroupC—Nemodipine
groupD FGSTT30．10，3mg／kggroup
图l GSTT对脑缺血再灌注大鼠梗死区脑组织DNA
Ladder的影响
Fig．1EffectofGSTTonDNALadderofbraintissue
jncerebralischemiareperfuslonrats
胞数为3．33±1．21，说明正常神经细胞也存在凋
亡。模型组凋亡细胞数与假手术组比较明显增加
(P亡细胞数与模型组比较明显减少(P<0．01、
0．001)，结果见表2。
3．4 GSTT对脑缺血再灌注损伤大鼠梗死区Bax
蛋白表达的影响：假手术组偶见Bax蛋白的表达。
模型组Bax蛋白的表达与假手术组比较明显增加
(P蛋白的表达与模型组比较明显降低(P<0．05、
0．01)，结果见表2。
4讨论
脑缺血再灌注损伤足指脑组织经历一定时间的
缺血后恢复血流供应，而出现缺血性损伤进一步加
重的现象。病理检查动脉供血区出现梗死灶，神经细
万方数据
中革菊ChineseTraditionalandHerbalDr“gs第37卷第6期2006年6月
表2 GSTT对TUNEL阳性细胞敞和Bax阳性细胞数的
影响“土s，H一10)
Table2 EffectofGSTTonnumberofTUNELand
Baxpositivecellsincerebralischemia
reperfusionrats(J士s，月一10)
与假手术组比较；⋯』’<0001
与模型组比较：一PAAAp<0．001wShamgroup
++P<0．01⋯P胞变性、坏死，动物则表现为不同程度的神经功能缺
损，本实验结果显示，高、中剂量组梗死面积均明显
缩小，说明其可减轻神经细胞损伤程度，改善脑功
能‘“。
脑缺血再灌注后产生大量氧自由基，超过组织
清除能力，导致自由基的堆积。由于自由基的直接损
伤或与细胞内钙超载、兴奋性氨基酸释放、NO毒性
等因素的综合作用致使细胞发生坏死或诱发凋亡。
研究证实“]，脑缺血再灌注后所发生的细胞迟发性
死亡主要表现为凋亡。细胞凋亡时，染色质浓缩并在
核小体之间断裂，形成180～200bp整数倍的寡核
苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形图谱，同时由于
DNA断裂形成黏性3，_OH，应用TUNEL染色可
以检测细胞凋亡，而且细胞凋亡的数量随时问的变
化呈曲线波动，研究表明”J，缺血再灌注2h即有细
胞凋亡出现，24h达到高峰。本实验结果显示
GSTT高、中剂量组凋亡细胞数明显减少，未见
DNAladder图谱，说明GSTT可抑制细胞凋亡，降
低凋亡比率。
细胞凋亡是一种生理性调节，不仅存在于正常
生理发育中，也发生在某些病理状态下。凋亡的发生
是细胞接受各种凋亡信号，在基因的调控下发生的
主动死亡过程[8。与凋亡有关的基因有多种，如：
13,-1—2、p53、Bax、clos、cmyc等。Bax是一种由192
个氨基酸残基组成，相对分子质量为2．1×104的促
凋亡因子，正常情况下以单体形式存在于胞质中，受
到凋亡刺激时，构象发生变化，导致寡聚体形成并整
合到线粒体外膜，触发通透性转换孔道开放，使线粒
体释放凋亡因子，从而触发凋亡。任何可以抑制Bax
表达的因素都可以不同程度地减轻细胞凋亡[⋯。本
实验结果显示GSTT各剂量组Bax蛋白的表达均
明显降低，提示其抗凋亡作用可能是通过下调促凋
亡蛋白Bax的表达实现的。
综上所述，GsTT对脑缺血再灌注损伤后神经
细胞凋亡具有保护作用，其机制可能与抑制促凋亡
蛋白Bax的表达有关。
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蒺藜皂苷对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用
作者： 关欣， 纪影实， 李红， 杨世杰
作者单位： 吉林大学基础医学院,药理学教研室,吉林,长春,130021
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(6)
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