全 文 ：中草喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月·1869·
药材与资源
巴戟天遗传多样性的RAPD研究
f
丁平，刘瑾，仰铁锤，邱金荚
(广州中医药大学中药学院，广东广州 510405)
摘要：目的应用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)标记技术对广东产5个
类群的栽培巴戟天进行遗传多样性研究。方法 应用15种引物对64个个体进行检测，应用Popgen32软件分析群
体的遗传多样性。结果共得到224条带，其中多态位点112个，多态百分率为50．oo％。种群内多态位点百分率
在37．05％～53．13％，平均为45．86％。Shannon指数和Nei指数均反映出巴戟天各类群遗传多样性有一定的变
化。Shannon指数为0．2876，各类群的Shannon指数在0．1033～o．2 62，Nei指数为0．1756，各类群的Nei指
数在0．0745～0．1540。结论 目前栽培巴戟天居群间有一定的分化，并产生了多种农家类型，其中小叶巴戟天
(POP2)遗传多样性明显高于其他类型，这些可能是导致目前栽培巴戟天质量产生变异的主要原因。
关键词：巴戟天；遗传多样性；RAPD分析
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)12—1869—04
Geneticd versityofMorindaofficinalisbyRAPD
DINGPing，LIUJin，YANGTie-chui，QIUJin—ying
(CollegeofChineseMateriaMedica·GuangzhouU iversityofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510405，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatethegeneticd versityoffivepopulationsofcultivatedMorinda
officinalisinGuangdongProvinceusingrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)．MethodsSix y-
fourindividualsinfivepopulationsofcultivatedM．officinaliswereanalyzedbyRAPDmarkersto
determinetheg neticvariationsamongthepopulations．Thedataofgeneticd versitywereanalyzedwith
Popgen32software．ResultsThelevelsofgeneticvariationandpatternsofpopulationstructureinM．
officinaliswereinvestigatedusingRAPDmarkers．Ofthe100primersscreened，15primersp oduced
highlyreproducibleRAPDbands，usingtheseprimers，224discernibleDNAfragmentsweregenerated
with112(50．00％)polymorphicfragments，indicatingconsiderablegeneticvariationatthespeciesl vel．
Incontrast，therewerrelativelyhighlevelsofpolymorphismatthepopulationlevelwiththepercentage
ofpolymorphicbandsrangingfrom37．05％to53．13％，andthemeanpercentageofpolymorphicloic(P一
45．86％)．GeneticvariationamongpopulationswasdetectedbasedonNei’Sgeneticd versityanalysis
(0．1756)，Shannon’Sdiversityindex(0．2876)foreverypopulationwithShannon
7
Si dex0．103—
0．2362andNei
7
Sindexes0．0745一O．1540．ConclusionThereiSa littleg neticd fferentiationamong
populationsofcultivatedM．officinalisandresultindifferentcul ivatedtypes，thegen ticd versityw th
M．officinalis(POP2)ishigherthanthatofotherpopulations．Itmaybethemainreasonofthedifference
ofcultivatedM．officinalisqu ity．
Keywords：MorindaofficinalisHow；geneticdiversity；RAPDanalysis
巴戟天Morinda彬；cinalisHow是茜草科植
物巴戟天属多年生灌木，其根具有温补肾阳、强筋壮
骨、祛风除湿等功效u]，系“四大南药”之一，其主产
地为广东肇庆、高要等地区。目前由于市场需求量的
增大，野生资源逐渐减少并趋于濒危状态[2]，药材市
场上出售的多为栽培的巴戟天。自20世纪60年代
栽培种植成功以来，巴戟天已具有50多年的栽培历
史，但由于常年的扦插繁殖，巴戟天遗传多样性受到
较大的影响，再加上生态环境的影响造成了许多遗
传分化，笔者在研究过程也发现在巴戟天的类群中
存在较多外观和化学成分的变异[3“]，为此，本研究
利用RAPD(随机扩增多态性DNA)技术对广东
收稿日期：2008—06—25
基金项目：广东省自然科学基金项目(04010057)及重点项目(06105061)。国家科技支撑计划子课题(2006BAl06All--02)
作者简介：丁乎(1965)，女，教授．博士生导师，主要从事中药资源和药材质量评价的研究。
E—mail：dingpinggz@126．corn
万方数据
·1870· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
不同区域栽培巴戟天5个类群64个个体的遗传多
样性进行研究，并对种群间的遗传关系进行初步探
讨，为这一药用植物的物种保护、品种选育和质量评
价研究提供实验遗传学依据。
l材料与方法
1．1实验材料：实验材料分别采自于2007年6～9
月，采集幼嫩的叶片置于硅胶中快速干燥后，用于
DNA提取。样品经鉴定均为巴戟天M．officinalis
How，凭证标本存于广州中医药大学中药资源研究
室，采样原则均按文献记载的方法[5]，样品均来自不
同的居群，共64份(表1)。
表l 巴戟天取样的居群及取样位置
Table1 PopulationandsamplingsitesofM．officinalis
1．2 仪器和试剂：PE9600型PCR仪，RNA／DNA
测定仪(GENEQUANT一80一2103—98，英国)，电
泳凝胶图像成像分析系统(EDASl20，美国)，高压
垂直电泳仪(PAC3000，BIO—RAD)；TaqDNA聚合
酶，BSA等均由大连宝生物工程有限公司提供。随机
引物由上海生工生物工程技术公司合成。
1．3 DNA提取：用CTAB法提取样品DNA，并参
照文献E63，取样品适量，加入已灭菌的石英砂适量，
研磨成细粉，将粉末转入1．5mL离心管中，加入预
冷的提取介质1mL(含0．2mol／L的Tris—HCI，
50mmol／L的EDTA，0．25mol／L的NaCl，pH
8．O)，混匀，在0。C下放置10min，在7000r／min
下离心10min，收集沉淀；加入预热的
2×CTAB1mL(含1．4mol／L的NaCl，1tool／L
的Tris，20mmol／L的EDTA，20g／I。的CTAB，
pH8．0；65‘C)，混匀；在65℃下保温30～60min
(中间摇匀几次)，7000r／min下离心10min；取上
清液至灭菌离心管中；加入等体积氯仿一异戊醇
(24：1)，摇匀；在1000r／min下离心10min；取
上清液至灭菌离心管中；加入2倍体积的预冷异丙
醇，摇匀；在一20，c下放置30min或者过夜；离
心，弃上清液。沉淀用70％乙醇冲洗沉淀3次，超
净台内风干。沉淀用DEPC处理水溶解，取DNA溶
液10弘L，用RNA／DNA测定仪测其浓度及纯度。
并根据其质量浓度将其稀释至50ng／gL并分装，
置一20C冰柜中保存备用。并取适量用0．8％琼
脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
1．4 PCR扩增：从100个RAPD随机引物中筛选
出15个具有较高多态性的引物进行PCR扩增。参考
文献E73确定其扩增反应总体积为20弘L。其中含：模
板DNA为50ng，10XLoadingBuffer2．0pI。，BSA
1．0弘L(20g／L)，M92+1．0pL，dNTP混合物0．8
弘L(各2．5mmol／L)，乳q0．2弘L(5U／tA。)，弓I物
o．5弘L(20pmol／t比L)，其余用DEPC处理水补足至
20弘L。其PCR扩增程序为：预变性：94‘C，2rain；扩
增循环(40循环)：94C、30S，37。C、2rain，72C、
2rain；延伸：72‘C、5min。扩增后于4’C保存。
扩增产物在1．5％琼脂糖凝胶上电泳，EB染
色后，在凝胶成像系统上观察并照相记录。
1．5数据处理：RAPD为显性标记，同一引物的扩
增产物在电泳中迁移相同的条带被认为是同源性
的，按条带的有无分别赋值，有带记为1，无带记为
0，形成二元数据矩阵。用Popgen32软件进行数据
分析。采用算术平均数的非加权成组配对法
(unweightedpairgroupmethodwitharithmetic
mean，UPGMA)进行聚类分析。
2结果
2．1引物筛选：实验所用100个10碱基随机寡核
苷酸引物，购置上海生工生物工程技术公司。取两个
模板DNA，对所有引物做初步筛选，从中选出15个
扩增条带清晰、重复性好的引物，筛选出引物的碱基
序列(表2)。
表2用于RAPD的15个随机引物序列
Table2 Sequenceof15randomprimers
usedinRAPDanalysis
2．2多态位点百分率：利用15个引物对5个巴戟
天种群64个个体的DNA样品进行RAPD分析
(图1)，共扩增出224个条带，各种群的多态位点百
分率有较大差异(表3)，小叶巴戟天(PoP2)种群
最高，为53．13oA；其次是大叶巴戟天(POPl)
(50．27％)；长叶巴戟天(POP4)最低(37．05％)；
平均为45．86％。5个种群64个个体共产生224个
多态位点，多态百分率为50．00％。
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月·1871·
1～13一POPl14～31-POP232～44一POP345～53-POP454～64-POP5
图1引物0450对POPI～5类群的扩增结果
Fig．1Amplifiedpro uctsfromPoPl一5samplesofM．officinalisusingPrimer0450
2．3 Nei指数、Shannon信息指数：由Nei指数和巴戟天是在同一地区经常出现的相近的巴戟天。而
Shannon信息指数估计的巴戟天5个类群的基因长叶巴戟天与圆叶巴戟天是两类较少见的类型，并
多样性见表3，两者估计的不同种群的遗传多样性 且常常分布在不同的区域。
的高低是一致的，Nei指数遗传多样性的变动范围 表4巴戟天不同种群的遗传相似度(对角线上方)
为0．0745一--0．1540，Shannon信息指数的变动范 与遗传距离(对角线下方)
围为0．1033～O．236 。Table4
Genetics milarity(abovedi g nal)andgenetic
表3 巴戟天种群内多态位点比率及种群间遗传多样性distance(belowdiagonaI)among
diffe。。n‘
Table3 Percentageofpolymorphiclociandgenetic
diversityw hinpopulationsofM．officinalis
类群揪总数嚣徽嚣蒿
POPl13 224 113 50．27 0．1540 0．2362
POP218 224 119 53．13 0．1425 0．2235
POP313 224 107 47．77 0．120l 0．1764
POP49 224 83 37．05 0．0745 0．1033
POP511 224 92 41．07 0．1014 0．1447
璺生 !! 坐 !!! !!：竺 !：!!!!!：!!!1
2．4种群间的遗传一致度和遗传距离：按Nei方
法计算巴戟天种群间的遗传距离和遗传相似度结
果，见表4。结果表明，5个种群的遗传相似度在
0．8919～0．9872。其中大叶巴戟天种群POPl与
小叶巴戟天POP2种群遗传相似度最高，长叶巴戟
天种群POP4与圆叶巴戟天种群POP5遗传相似
度最低。种群间的遗传距离最高为0．1144(POP4
与POP5)，最低为0．0129(POPl与POP2)。
2．5种群的聚类分析：通过Popgen软件按Nei7S
的遗传距离，对5个种群进行聚类(见图2)，结果表
明，种群间遗传距离与地理距离有一定的相关性。同
一地区，地理相隔很近的种群间，存在着广泛的基因
交流，遗传分化最小。根据聚类结果，大叶巴戟天与
小叶巴戟天种群聚在一起，在调查中也发现，这两类
populationsofM．officinalis
类群POPlPoP2PoP3POP4 PoP5
+一POPl+⋯⋯l
+----I 4---POP2
1 1+-----I+----⋯⋯POP3
i !
I +一一⋯一⋯一一POP5
1+-_一一一一一⋯一_一一一一POP4
图2 巴戟天居群间Nei’S遗传距离的UPGMA聚类图
Fig．2UPGMADendrogramfopopulationsofM．
officinalisb sedonNei
7
Sgeneticd stance
3讨论
巴戟天为“四大南药”之一，20世纪60年代末，
由于野生资源破坏，产量急剧下降，导致巴戟天大面
积种植，在广东德庆巴戟天基本上以扦插繁殖为主。
植物的遗传多样性与其生物学特性、生境、分布范
围、生活型以及花粉和种子传播方式影响较大[8]。
6
8
1
9
9
8
6
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2
2
4
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万方数据
·1872· 中革焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12,El
Popgene软件计算所得的Nei
7s多样性分析结果、
Shannon7s信息指数表现出的分化系数表明，从总
体上来看，巴戟天的不同农家类型间虽存在较大的
遗传分化，但各类群的多态位点百分率较高
(50．00oA)，有研究表明，对于植物物种水平和居群
水平上的遗传多样性而言，多态条带比率在50％
左右被认为遗传多样性是丰富[9’1引，由此看出，巴戟
天各类群间具有较高的遗传多样性。物种保护的主
要内容中其遗传多样性及进化潜力的保护，种群遗
传多样性或变异越丰富，物种对环境变化的适应能
力越强，其进化潜力也愈大，因此，遗传多样性对于
物种的生存和发展具有决定性作用，物种保护策略
的制定必须建立在对种群遗传结构及多样性分析了
解的基础上，基于巴戟天种群遗传结构分析，建议采
取下列措施进行保护：(1)由于种群间遗传分化程度
较高，任一种群遗传多样性的丢失均会导致遗传变
异的降低，因此，需就地保护所有种群，并在此基础
上恢复各种群规模，并保护其生境，促进其更新。
(2)迁地保护取样时，应考虑等位基因的丰富度，避
免近交衰退，根据自然种群的遗传结构取样，防止栽
培种群的遗传均一化。另外，可考虑建立种质资源
库，最大限度地保护巴戟天不同类群的遗传多样性
资源。 ．
在巴戟天的主产地广东德庆实地调查中还发
现，另外一种假巴戟天(当地名为“巴戟公”，巴戟天
的混伪品)，该植物叶型较大，地下根部皮部较薄，木
心较粗；而同属的植物鸡眼藤也是在巴戟天种植基
地中经常发现的近缘植物，外型与巴戟天极其相似。
巴戟天是多年生的藤本，世代周期长，且雌雄同花，
自然条件下主要靠花粉来传播，这在一定程度上影
响了基因的流动，在种植过程中巴戟天是否与这些
植物花粉杂交而产生目前不同的农家类型，有待进
一步深入探讨。
在前期的研究中发现，不同种质资源的巴戟天
在药材的外形及化学成分指纹图谱等方面均存在较
大的差异[3“]，其中与巴戟天在栽培过程中发生的遗
传分化有直接的关系，因此，为了保证药材的质量，
应结合化学成分研究，对巴戟天不同类群的种质资
源进行优选，以保证药材的质量。
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不同水分和氮素条件对栽培绞股蓝生物量和皂苷量的影响
龙云-，杨睿2，钟章成t，谈锋p
(1．西南大学生命科学学院，三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆市三峡库区植物生态与
资源重点实验室，重庆400715；2．西南大学化学化工学院，重庆400715)
摘 要：目的 研究人工栽培条件下水分和氮素对绞股蓝Gyno盯emmapentaphyllum生物量和皂苷量的影响。方法
对野生绞股蓝扦插苗进行水分和氮素控制实验。结果在干旱和缺氮逆境下，整株植株生物量减少，但由于p-糖苷
酶活性降低，导致单位干质量叶片中绞股蓝皂苷的量增加。由于干旱使生物量减少的速率大于对皂苷积累的促进
作用，表现为干旱使总皂苷产量降低，与之相反，缺氮对生物量减少的速率小于对皂苷积累的促进作用，但是氮素
浓度过低也不利于皂苷积累。结论这意味着在人工种植的情况下，必须保证充足的水分供应和适度的氮肥供应
才有利于绞股蓝生长，保持较高的生物量和总皂苷产量。
收稿日期：2008—05—03
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30370279，30670334)；西南大学科技基金资助项目(2001一Q12)
作者简介：龙云(1973)，男．四JII成都人，讲师，博士研究生．主要从事植物种群生态学与药用植物生理生化研究与教学工作。
Tel：(023)68367060Fax：(023)68252365E—mail：longyr@SWU．edu．cn
*通讯作者谈 锋Tel：(023)68252698Fax：(023)68252365E—mail：tanfeng’@SWU．edu．cn
万方数据
巴戟天遗传多样性的RAPD研究
作者： 丁平， 刘瑾， 仰铁锤， 邱金英， DING Ping， LIU Jin， YANG Tie-chui， QIU Jin-
ying
作者单位： 广州中医药大学中药学院,广东,广州,510405
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(12)
被引用次数： 3次

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