全 文 ：中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月·893·
三七皂苷对泡沫细胞形成的影响及其信号机制
樊继山，李晓辉+，李淑慧
(第三军医大学基础部新药研究室，重庆400038)
通常认为冠脉疾病的发生与脂肪沉积造成动脉
狭窄有关，近年来的临床流行病学调查提示炎症因
素在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发病中可
能具有更重要作用[1]。基于这一新的认识，本室率先
建立了炎症免疫性AS动物模型，并利用先进的抗
体芯片技术发现炎症免疫反应引发的AS形成过程
中存在大量细胞因子的整体变化[2]。c—Jun氨基末端
激酶(c—Junamino—termtinalkinase，JNK)和p38
丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen—activated
proteink nase，p38)作为信号转导分子可被多种
应激刺激活化，进而通过对各自底物的磷酸化调节
炎性细胞因子的基因表达，参与免疫炎症反应。因此
磷酸化激活的JNK、p38在AS的免疫炎症机制中
可能具有重要作用。含大量脂质的泡沫细胞的形成
是AS初期的特征性病理变化，也是AS发病的核
心环节，因此本研究在氧化型低密度脂蛋白
(oxidizedlowdensitylipoprotein，ox—LDL)诱导
泡沫细胞形成的过程中叠加炎症刺激剂酵母多糖
(zymosanA，Zym)探讨炎症刺激对泡沫细胞形成
的影响及其信号机制。三七总皂苷(Pannax
notoginsengtotalsaponin，PNS)对AS具有良好
的防治作用，但通常认为其机制与降血脂、抗血栓形
成有关[3]。既往研究发现PNS对急、慢性炎症均具
有显著治疗作用[4’5]。提示PNS除具有调节血脂等
作用外，还具有很强的炎症调节作用。因此，本研究
在既往的研究基础上进一步探讨PNS对泡沫细胞
形成的影响及其作用机制是否涉及JNK和p38信
号通路，为临床上探寻既具有降血脂效应又具有抗
炎活性的抗AS的良好候选药物奠定理论基础。
1材料
1．1动物：雄性昆明小鼠，18～20g，购于第三军医
大学实验动物中心。
1．2 试剂：Zym粉剂购于Sigma公司，OX—LDL
(1．8mg／mL)购于北京协和医科大学，PNS(质量
分数99％)购于中国科学院昆明植物研究所。无酚
红RPMI一1640培养基购于Gibco公司，胆固醇酶
比色法(CHOD—PAP法)测定试剂盒购自上海荣
盛生物制品公司，磷酸化JNK(Phospho—JNK，P—
JNK)、磷酸化p38(Phospho—p38，P—p38)兔抗小
鼠双磷酸化位点抗体购自Cellsignaling公司。
2方法
2．1 巨噬细胞的分离：每只小鼠ip无血清无酚红
RPMI一1640培养液2mL，20min后颈椎脱臼处死，
75％乙醇浸泡10min，剖腹收集腹腔内液，750r／
min离心5min后收集细胞，用含10％胎牛血清的
无酚红RPMI一1640培养液调整细胞浓度至5×
106／mL。培养板中各孔加入细胞悬液(24孔板稀释
lo倍)，置5％CO。、37℃孵箱培养2h后去上清
液，用PBS洗去未贴壁细胞。
2．2分组：6孔板分为单纯OX—LDL对照组、
Zym+ox—LDL组、PNS干预(低、高剂量)组。每孔
加入细胞5×106／mL、含10％胎牛血清无酚红
RPMI一1640培养液2．5mL及ox—LDL80ug／mL。
Zym+ox—LDL组加入Zym50lag／ L，PNS组加
入Zym50／19／mL后分别加入PNS50、100ug／
mL。24孔板细胞爬片分为阴性对照组、OX—LDL对
照组、Zym+ox—LDL组、PNS干预组。每孔加入细
胞5×105／mL、含10％胎牛血清无酚红RPMI一
1640培养液1mL及ox—LDL80ug／mL。Zym+
ox—LDL组加入Zym50／19／mL，PNS组加入Zym
50gg／mL后再加入PNS100／-g／mL。各组培养板
置5％CO：、37℃孵箱培养48h。
2．3油红O染色：24孔板细胞爬片染色观察泡沫
细胞，弃去培养液，漂洗固定后，依次用0．3％油红
O和苏木精染色，光学显微镜下观察。
2．4 细胞内胆固醇的测定：6孔板细胞吸去培养
液，用Folch法[63抽提泡沫细胞中脂质，按试剂盒说
明进行。
收藕日期：2006—12—30
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30470465，30371768)
作者简介：樊继山(1972一)，男，河北省邯郸市人，博士，研究方向为心血管药理学。
Tel：(023)68753397—8lE—mail：river080@163．com
*通讯作者李晓辉
万方数据
·894· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
2．5 P—JNK、P—p38蛋白表达水平的测定：培养的
细胞用4℃预冷的PBS轻洗2次，加入预冷的细
胞裂解液(50mmol／LB一甘油磷酸pH7．3，1．5
mmol／LEGTA，1mmol／LEDTA，2mmol／L
DTT，0．2mmol／LNa3V04，lmmol／LNaF，1％
Triton—X100，2mmol／LPMSF，10mg／L抑肽酶，
10mg／L亮抑酶肽，10mg／L胃蛋白酶抑制剂A)
100肛L，冰浴5rain，将细胞从培养板上刮下，
14000×g离心10min，吸上清液一80℃保存。以
上操作步骤均在4℃下进行，蛋白质定量后加等量
2×样品缓冲液，100℃水浴5min，5000r／min离
心10S，取上清液上样。取样品每孔60pg，用10％
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；分离的蛋白转膜至
硝酸纤维膜后，室温封闭液封闭1h；与一抗(浓度
1：1ooo)4℃过夜；洗膜3次后，与二抗
(1：1ooo)室温下摇育2h；洗膜3次后，用化学发
光显色系统显示蛋白条带。用quatityone4．4软件
进行图像分析，测定各条带面积×吸光度值，目的蛋
白的表达水平即相对表达量用目的条带邝一actin的
值计算。
2．6统计学分析：数据以z±S表示，组间用SPSS
10．0统计软件行单因素方差分析。
3 结果
3．1泡沫细胞形态观察：光镜下，经显示中性脂肪
的油红O法染色后，脂质呈红色，细胞核呈蓝色。阴
性对照组细胞未吞噬脂质，胞浆呈淡蓝色。加入ox～
LDL培养48h后，与阴性对照组相比，OX—LDL组
及Zym+ox—LDL组可见胞浆内含有大量红染的脂
质颗粒，细胞体积明显增大，表明泡沫细胞已经形
成。与OX—LDL组相比，Zmy+OX—LDL组细胞胞浆
内红染脂质颗粒明显增多，大量红染颗粒重叠使胞
浆着色明显加深。PNS组细胞胞浆内脂质明显减
少，体积较炎症刺激明显减小。
3．2 PNS对泡沫细胞内胆固醇量的影响：与ox～
LDL组比较，Zmy+OX—LDL组细胞内胆固醇水平
明显升高，与Zmy+OX—LDL组相比，PNS组细胞
内胆固醇水平明显降低(P<0．01)，且呈现剂量依
赖性(P<0．05)，见表1。
3．3 Westernblotting测定P—p38、P—JNK的表
达：结果显示，p-actin在各泳道表达量基本一致，说
明各组上样量基本一致，实验系统稳定。在相对分子
质量43000和55000处，各泳道分别出现P—p38
和P—JNK目的条带，比较蛋白的相对表达量发现，
ox—LDL对照组少量表达P—p38、P—JNK，Zym+ox～
LDL组的表达明显高于OX—LDL组(P<0．01)，
PNS低、高剂量组表达量较Zmy+ox—LDL组减少
(P表1 PNS对泡沫细胞内胆固醇水平及P—p38、P—JNK
蛋白表达的影响(x±J，n一6)
Table1 EffectofPNSoncholesteroll veand
proteinxpressionofP--p38andP-‘JNK
infoamcells(；±s，露=6)
!H日I
剂量／ 胆固醇“g P—p38／ P—JNK／
一～(vg·mL一1)(5×100cells) 8-actin 8-actin
ox—LDL 80
Zym+ox—LDL80+50
PNS 50
i00
与OX—LDL组比较：一P44P<0．01；与PNS50弘g／mL组比较：△△P’’P<0．01WSOX—LDLgroup：。4P<0．01口sZym+ox—LDL
group：△△P<0．01VSPNS50p．g／mLgroup
4讨论
含大量脂质的泡沫细胞的形成是AS初期的特
征性病理变化，也是AS发病的核心环节，巨噬细胞
源性泡沫细胞更是AS病变初期主要的泡沫细胞类
型，ox—LDL在泡沫细胞形成中起到至关重要的作
用，是体外诱发巨噬细胞泡沫化的经典方法，因此，
本研究应用炎性刺激剂Zym叠加传统的ox—LDL
刺激小鼠腹腔巨噬细胞性泡沫细胞的形成，结果表
明Zym在体外可以明显促进ox—LDL诱发的巨噬
细胞源性泡沫细胞的形成，泡沫细胞内脂质沉积量
也显著升高，并且PNS对其有明显的抑制作用。提
示PNS能够抑制炎症刺激促进的泡沫细胞的形成。
本实验结果显示OX—LDL组少量表达P—JNK、
P—p38，表明ox—LDL在体外可以刺激巨噬细胞源性
泡沫细胞中JNK、p38的磷酸化。Zmy+OX—LDL组
中P—p38、P—JNK的表达明显高于ox—LDL对照组，
表明Zmy对ox—LDL刺激巨噬细胞源性泡沫细胞
中JNK、p39的磷酸化具有显著的增强作用。有研
究证实p38和JNK的激活是巨噬细胞产生肿瘤坏
死因子一a(TNF—d)所必需的，JNK的激活是诱导
TNF—a和白细胞介素一6(IL一6)所必需的[7]。p38通
路和JNK通路激活后能上调IL一1B诱导的环氧合酶
(COx) 达，使在促进炎症的过程中起重要作用的
前列腺素E。(PGE：)合成增加。激活的p38能促进
白细胞的聚集和活化。抑制p38活性可减少或阻断
多种细胞因子，如TNF—q、IL一1、IL一6等的产生。提示
磷酸化激活的JNK、p38在细胞因子和炎性介质产
生中起着重要的调节作用。结合前期研究结果：免疫
△△
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4+一±+一±；5；8i1i3
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月·895·
炎症反应引发的AS形成过程中存在大量细胞因子
的整体变化，提示在巨噬细胞泡沫化过程中，JNK、
p38的磷酸化激活后，通过相应转录因子的磷酸化对
多种炎性相关因子及炎症介质的调节，可能是免疫炎
症反应促进泡沫细胞形成的原因之一。
本实验在检测JNK磷酸化的结果中发现，仅检
测出相对分子质量为54000的JNK2，却没有发现
相对分子质量为46000的JNKl。Ricci等[83在
ApoE一／一小鼠AS模型中也得出类似的结果，提示
在泡沫细胞形成中JNK2比JNKl的作用更为重
要。虽然目前更多的学者关注JNKl的特异性抑制
剂，但是至少在AS等免疫炎症相关性疾病的治疗
中，JNK2的特异性抑制剂更有前途和价值。
本研究观察到，PNS可以剂量依赖性地抑制巨
噬细胞受到炎症刺激后JNK、p38的磷酸化水平，
并能减少泡沫细胞内脂质沉积的增加。该结果提示，
抑制JNK、p38的磷酸化可能是PNS抗泡沫细胞
形成的又一重要机制。本室前期研究发现升高细胞
内cAMP和降低[Ca2+]i水平，是PNS发挥炎症调
节效应的重要机制[4’5]。Xia等[9]观察到cAMP在
PCI2细胞中可抑制p38和JNK活性。
Schwarzschild等口印发现提高细胞外Ca抖水平，可
抑制JNK通路激活。应用钙离子螯合剂降低细胞内
[Ca2+]i水平能够抑制地鼠V79细胞中由H：O：诱
导的JNK激酶的激活，提示PNS可能通过影响
cAMP水平、细胞内外Ca2+平衡等机制作用于
JNK、p38的转导通路中上游分子的某一环节从而
阻断或部分阻断了其磷酸化的作用。但其具体机制
尚需进一步的深入研究。
综上所述，炎症反应是促进AS的一个重要原
因，JNK、p38的磷酸化是其中一个重要环节，PNS
对JNK、p38异常激活的抑制作用进而从整体上调
控多种细胞因子的表达，可能是其有效防治AS的
分子机制之一。
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系统性红斑狼疮(systemiclupuserythema—
tosus，SLE)是人类较常见的一种典型的自身免疫
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病。现在认为SLE是由自身免疫紊乱、病毒感染、遗
收稿日期：2006—08—19
基金项目：天津市自然科学基金项目(023613211)
作者简介：张京玲，女，副教授，硕士，毕业于天津医科大学f临床药理专业，主要从事中药新药的药理研究。
Tel：(022)23504374E—mail：zhangjll00@eyou．com
万方数据
三七皂苷对泡沫细胞形成的影响及其信号机制
作者： 樊继山， 李晓辉， 李淑慧
作者单位： 第三军医大学基础部,新药研究室,重庆,400038
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(6)
被引用次数： 2次

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