全 文 ：中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第3期2007年3月·445·
相似度计算结果显示，16批三七剪口药材指纹
图谱相似度均大于0．92。不同产地之间相似度有差
异，如文山平坝镇地区与文山平坝小街地区；而在同
一产地差异较小，如文山平坝镇、文山苗乡(马鞍
山)、砚山县水泥厂旁和邱北县腻脚地区。相似度分
析结果说明本实验建立的指纹图谱方法可以作为三
七剪口的质量评价手段。
3讨论
3．1提取条件的选择：三七药材中的有效成分除了
皂苷类外，还有三七素及黄酮类，在测定其指纹图谱
时，这些成分应在图谱中得到反映。如采用甲醇作为
提取溶剂，得到的三七指纹图谱只能表达皂苷类成
分，无法表达在甲醇中溶解性较差的化学成分[5]，因
此最终选定以水为提取溶剂。
3．2色谱条件的确定：比较了水一甲醇和水一乙腈不
同体系下，色谱峰的分离情况。结果表明选择水一甲
醇体系的基线波动较大，而水一乙腈体系则可以得到
较好的分离结果。分别对水一乙腈体系的不同洗脱梯
度进行了试验，结果以本实验中所列梯度出峰较多
且色谱峰分离度较好。同时对三七药材供试品溶液
进行了120min的HPLC测定，结果65min后无色
谱峰出现，所以选定指纹图谱记录时间为65min。
典型的三七剪口药材指纹图谱见图2一A，指纹图谱
中20min之前的色谱峰紫外吸收最大值为254
nm，为黄酮类成分[6]，35rain后色谱峰的紫外吸收
与对照品的色谱峰(2一B)的紫外吸收对照后，确认为
皂苷类成分。
L一 一，． i．蠢 ii
0．00 10．87 21．74 32．6l 43．48 54．35 65．21
t／min
1一三七皂苷Rl2一人参皂苷R913-人参皂苷Re
4一人参皂苷Rbl5一人参皂苷Rd
1一notoginsenosideRl 2-ginsenosideRgl3-ginsenosideRe
4一ginsenosideRbl5-ginsenosideRd
图2三七剪口(A)和对照品(B)HPLC色谱图
Fig·2HPLCFingerprintof hizomefP·notoginseng
(A)andreferencesubstance(B)
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广西地不容组培快繁研究
黄宁珍，唐凤鸾，付传明，李锋，赵志国
(广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西桂林541006)
摘 要：目的 研究广西地不容的组培快繁技术，为大量生产种苗提供方法和技术。方法 以嫩茎节段为外植体，
以MS为基本培养基，通过不同的激素种类和浓度配比，选择出最佳的诱导、继代增殖和生根培养基配方。结果
MS+NAA0．1mg／L+BA1．0mg／L利于诱导出芽，可用于初代培养。继代增殖则以MS+IBA0．4mg／L+NAA
0．2mg／L+GA0．5～1．0mg／L、MS+NAA0．1mg／L+GA1．0mg／L和MS+IBA0．2mg／L+BA0．4～O．8
mg／L+GA0．5～1．0mg／L3种培养基交替培养，繁殖系数6．0倍／50d。1／2MS+IBA0．8mg／L适宜诱导生根获
得再生植株，生根率75％。生根苗春夏之交移栽最好，成活率90％。结论本研究得出的方法可用于工厂化生产广
西地不容种苗。 、
关键词：广西地不容，组培快繁f种苗
中图分类号：R282．13 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)03—0445—05
收稿日期：2006—05—12
基金项目：广西壮族自治区科技攻关项目(桂科攻0322024—3B)
作者简介：黄宁珍(1968一)，女，广西大化县人．副研究员，从事药用植物生物技术研究工作。
E—mail：huangnz@gxib．cnhnzhen68@yahoo．com．cn
万方数据
·446· 中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第3期2007年3月
TissuecultureandrapidproliferationofStephaniakwangsiensis
HUANGing—zhen，TANGFeng—luan，FUChuan-ming，LIFeng，ZHAOZhi-guo
(GuangxiInstituteofBotany，GuangxiZhuangzuAutonomousRegionandChineseAcademy
ofSciences，Guilin541006，China)
Abstract：ObjectiveTooptimizethetissuecultureandrapid—proliferationt chniquesfStephania
kwangsiensisforproducinglar e-scaleeedlings．MethodsThetendertemswereusedasexplantsand
cultivatedindifferentMSmedia．Theoptimumediaforinducingbuds，subproliferation，androo ng
weres lectedbyadjustinghevariouskindsandconcentrationsofpla thormones．ResultsThemedium
MS+NAA0．1mg／L+BA1．0mg／Lwasuitableforbuds7 inducinga dcouldbeusedinthefirst
generativecultivation．Subpr01iferationneededtobecultivatedlternatelyinthefollowingthreem dia：
MS+IBA0．4mg／L+NAA0．2mg／mL+GA0．5—1．0mg／L，MS+NAAO．1mg／L+GA1．0mg／L，
andMS+IBA0．2mg／L+BA0．4—0．8mg／L+GA0．5—1．0mg／L；propagationcoefficientwas6．0
times／50d．Themedium1}2Ms+IBA0．8mg／Lwasaptoinducerootinga dtherootingratewas
75％，SOitcanbeusedasrootingmedium．Rootingplantletsweretransplantedbe weenspringand
summerandits urvivingratewasupto900A． ConclusionTherapid—pr01iferationt chn queofS．
kwangsiensiscabeu edforproducinglar e-scaleeedlings．
Keywords：StephaniakwangsiensisH． S．Lo；tissuecultureandrapid—pr01iferation；seedlings
广西地不容StephaniakwangsiensisH．S．Lo
属防己科千金藤属多年生草质藤本落叶植物，生长
于石灰岩地区山地灌丛，主要分布在广西百色地区
靖西、凌云等县，为广西石山特有濒危物种[1]。其植
株单性、雌雄异株、异交，种子小、种壳坚硬，自然条
件下萌发困难，因此，繁殖能力极差。加上近年来人
为的破坏及各种环境因素的影响，其种群及个体数
量急剧减少，物种生存受到威胁。在《广西中药材标
准》中，广西地不容收载为金不换的植物来源品种之
一，是壮族等少数民族民间常用草药，具清热解毒、
散瘀消肿之功效，用于胃、十二指肠溃疡疼痛，上呼
吸道感染，急性胃肠炎，牙痛，神经痛，痈疮肿毒，跌
打肿痛等。其块根中含有多种生物碱，是生产中药颅
痛定的重要原料，在临床上用于镇痛、镇静、解
热[2~43等。最近，除了陆续分离到一些新的生物碱成
分外，还发现其中的Z一罗默碱对褐飞虱有触杀作用，
为化学杀虫剂马拉硫磷触杀毒力的7．48倍[5]，是一
种很有前景的低毒植物农药。随着相关各项研究的
深入，越来越多的生物功效被发现，广西地不容的应
用前景更为广阔，开发应用和物种资源紧缺的矛盾
也显得日益突出，因而通过组织培养和快速繁殖对
广西地不容进行繁育意义十分重大。目前，除了地不
容毛状根诱导培养外[6]，组织培养与快速繁殖研究
尚未见有报道，因此，本实验以种质繁育保护和生产
为目的，对广西地不容进行组培快繁研究。
1材料与方法
1．1材料和处理：供试材料来源于广西靖西、凌云
等县，采集其块根并种植于广西植物园内，剪下新长
出的嫩梢，用自来水冲洗干净，然后在超净工作台上
剪成节段，用70％乙醇浸泡30S，再用0．1％HgCI。
溶液浸泡6min，取出后用无菌水浸洗5次，以消毒
过的吸水纸吸于水，剔去可能残留有HgCI。的两端
伤口，将材料剪成1．5～2．0cm的节段(每一节段带
一个腋芽)，接种于诱导培养基上。
1．2培养基：以MS为基本培养基，根据实验目的
和材料的生长情况添加不同种类和质量浓度的植物
激素，包括6一BA、IBA、NAA、BR、2，4一D及GA3，并
附加2．O％～3．o％蔗糖、0．5％琼脂，pH值为5．8。
分装后，于121℃、压力为105Pa的条件下灭菌25
rain。
初代培养：以MS为基本培养基(蔗糖3％)，按
不同的质量浓度组合添加：(1)BA：0．5、1．0、2．0
mg／L；(2)NAA：0．05、0．1mg／Ll(3)IBA0．1mg／
L。外植体消毒后接人装有相应培养基的试管中，培
养，2周后定期观测材料的生长情况，筛选出适用于
初代培养的激素种类、质量浓度和组合。
继代培养：以MS为基本培养基(蔗糖3％)，根
据需要按不同的质量浓度和组合加入下列植物激
素：(1)6-BA：0、0．1、0．2、0．4、0．8、1．0mg／L；(2)
NAA：0．02、0．005、0．1、0．2、0．5mg／L；(3)IBA：
0．05、0．1、0．2、0．4、0．8mg／L；(4)BR：0．05、0．1
mg／L；(5)2，4一D：0．01、0．02、0．04mg／L；(6)GA3：
万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第3期2007年3月·447·
0、0．5、1．0、2．0mg／L。将初代培养得到的材料接种
到继代培养基中，每瓶接种3--．5个外植体，培养，可
得丛生芽或小苗。将形成的丛生芽分割，或将小苗切
成小段，转入新鲜的继代培养基中进行增殖培养。材
料接种3周后定期观测，根据材料的生长情况，调整
培养基中植物激素的种类、质量浓度和组合，探索出
合适的继代培养基配方及培养方法。
生根培养：以I／2MS为基本培养基(蔗糖
2％)，加入下列不同的激素及质量浓度：(1)NAA：
0．05、0．1、0．2、0．5mg／L；(2)IBA：0．05、0．1、0．2、
0．4、0．8、1．6rrtg／L；(3)BR：0．05、0．1、0．2、0．4、
0．8、1．6mg／L。将生长健壮、带叶的芽苗分成单株，
接人培养基中诱导生根。如果芽苗过高，可剪成4～
5am的小段后再接种。每瓶接种3～5株，培养，30d
后观测并统计生根率，选出合适的生根培养基。
1．3培养条件：材料接种后，在平均照度2000Ix
的光照下培养，光照时间12h／d；温度(28±3)℃。
1．4生根苗的移栽：根据广西地不容原来的分布生
境，将腐质土和堆沤发酵好的猪粪按4：1均匀混
合，用800倍托布津可湿性粉剂消毒，装入营养杯中
作为移栽基质。将生好根的试管小苗，移出培养室
后，在室外炼苗5d，洗净根系上的培养基，移栽至装
好基质的营养杯中，在荫蔽度70％的大棚中培养，
40d后统计成活率。
2结果与分析
2．1外植体的选择与消毒：在采样及消毒过程中发
现，广西地不容嫩茎节比茎尖对消毒剂HgCI：的耐
受能力要强得多，用同样的方法消毒，嫩茎节的成活
率为70％，而茎尖为0。茎尖较嫩，在消毒后1---2d
内全部褐变并死亡。因此，通常情况下，外植体的选
取以嫩茎节为主。综合污染率、死亡率等因素，用
0．1％的HgCl2消毒6min效果最好。
2．2初代培养与诱导出芽：观测不同质量浓度的
BA(O．5、1．0、2．0mg／L)与NAA(O．05、0．1rag／L)
共6个组合的试验发现，培养基MS+NAA0．1mg／
L+BA1．0mg／L上的培养材料出芽率最高，达
70％以上，芽苗生长最快，经过35d培养，平均苗高
9．8cm(表1)。若是以0．1mg／LIBA代表NAA，出
芽率相差不大，但芽苗节间短、矮壮，经37d培养后，
平均苗高4．7cm(表1)。可见，在合适的质量浓度下，
NAA和IBA对出芽率没有大的影响，但前者的芽苗
生长速度较快。因此，MS+NAA0．1mg／L+BA
1．0mg／L和MS+IBA0．1mg／L+BA1．0mg／L
均可作为初代培养的培养基，但前者更好。
●
表1 NAA和IBA对出芽率和芽苗生长的影响
Table1 EffectofNAAandIBAonbudding
rateandshootgrowth
(慧拳型) 甏季灌肾韵／cmL 1 黼苗的形态mg·～) 数／d ／管 ／％ 1”⋯。
MS+NAA0·l+队1·035 25 72·0 9·8 爵，中等壮
坚!±!坠!：!±坠!：!!! !! !!：! !：! 壁：竺
2．3继代培养与增殖：继代增殖是广西地不容组培
侠繁成功的关键环节。在实验过程中发现，如果把初
代培养得到的材料直接转接到含细胞分裂素6-BA
的培养基上，不论如何调整其质量浓度、或改变与其
他各类激素的配比，材料生长及繁殖效果均不理想。
接种30--40d后观测，仅长成0．1～1．0cm长的小
芽，芽黄化、萎缩、细弱，即使在培养基中加入促使细
胞伸长的激素GA。也不起任何效果。根据材料生长
情况，通过不断调整培养基中激素的种类、质量浓度
和组合，得以下结果：
(1)材料不宜连续两代以上在含BA的培养基上
培养。若连续继代到含BA的培养基上，培养初期虽
能诱导出多个芽点，但新形成的芽细弱、萎缩，茎节不
能伸长，叶小甚至退化成只剩叶柄(图1—1)，生长和
增殖速度下降，这种现象并不随BA质量浓度的降低
或GA质量浓度的增高而有所缓解。因此，继代增殖
的关键是以含BA和不含BA的培养基交替培养。
(2)在不同激素种类、质量浓度和组合的继代培养
基中，筛选出材料生长较好的5个组合：①Ms+IBA
0．4mg／L+NAA0．2mg／L+GA0．5～1．0
mg／L；②MS+NAA0．1mg／L+GA1．0mg／L；③
MS+NAA0．05～0．1mg／L；④MS+BR0．05～
0．1mg／L和⑤MS+IBA0．2mg／L+BA0．4～0．8
mg／L+GA0．5～1．0mg／L。将材料接种在这5种培
养基上，观测并统计芽苗的生长数据(表2)。结果表
明：①号培养基芽苗的高度、粗壮度及外观最好(图1—
2)；⑤号培养基材料的增殖和生长速度最快(图1—3)。
1一培养基中不加BA(50d)2-培养基中加队(19d)
3一连续两代加BA(30d)
1-mediumw thoutBA(50d) 2，mediumwithBA(19d)
3-mediaw thBAfortwosuccessivegen rations(30d)
图1不同继代培养基上的芽苗
Fig．1Shootsinvariousmedia
万方数据
·448· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第3期2007年3月
衰2广西地不容在不同的继代培养基中的生长状况
Table2 GrowthofS．kwangsiensisnvar ousbcultivation
(3)材料若连续在不含BA的培养基中培养，如
上述的培养基①、②、③、④，所得的芽苗较高也比较
健壮，但诱导的芽数少，生长相对较慢，继代时间长
(表2)。因此，广西地不容虽然可以在不含BA的培
养基上连续继代，但繁殖速度较慢。
(4)在所使用的几种生长素类激素中，2，4一D诱
导的愈伤过多，易使培养材料和培养基褐变，影响芽
苗的生长，因此，不宜使用。除了2，4一D外，NAA、
IBA、BR均可用于广西地不容的继代培养，使用的
质量浓度各不相同(表2)。
综合上述结果可知，广西地不容继代增殖的最
佳方式是交替培养于含BA和不含BA的培养基
上，其中，交替于①、②、⑤中可获得健壮的芽苗和较
快的繁殖速率，平均繁殖系数6．0倍／50d。
2．4生根培养：比较不同生长素种类和组合的生根
效果，在所试的范围内，单因素的IBA(O．8mg／L)
诱导的生根率最高，为75％；NAA、BR、NAA与BR
组合、NAA与IBA组合、BR与IBA组合所诱导的
生根率都相对较低。在比较盐、糖浓度对生根的影响
时发现，1／2MS和低糖(20g／L)更利于根的形成和
生长。因此，广西地不容的生根培养基为1／2MS+
IBA0．8mg／L，通常培养35d后，每株长根3～5
条，根长1．O～3．5am(图2—1、2)。
2．5移栽：广西地不容试管小苗叶片薄，特别容易
失水萎蔫，因此，打开瓶盖后应置于半封闭的潮湿环
境中炼苗1～2d，完全敞开后再炼苗2～3d，炼苗过
程中应及时注意保湿。比较不同季节的移栽实验发
现，环境的温湿度是影响移栽成活率的主要原因，其
中，春夏之交是广西地不容最佳的移栽季节，此时移
栽，成活率可达90％，小苗生长速度也比较快，45d
长出新叶7--8片，苗高约10cm(图2—3)。
3讨论
通常情况下，顶芽分生组织是植物生长和分化
最活跃的部位，理论上是进行组织培养研究最好的
图2生根小菌(35d，1、2)和移栽成活的植株(45d，3)
Fig．2Rootingseedlings(35d，1，2)andsurvival
plantaftert ansplanted(45d，3)
材料。但广西地不容顶芽较嫩，在消毒过程中易受损
伤，细胞结构容易受到破坏，从而影响细胞内多酚氧
化酶及酚类物质的区域化分布格局，促进多酚氧化
酶将酚氧化成醌类物质，导致褐变的产生[73；同时，
顶芽本身的多酚量比侧芽高。上述两方面的原因导
致顶芽的成活率比侧芽低。这一结果与yuc阳等对葡
萄的研究结果类似。另外，外植体的生理状态、取材
的部位和时间、培养基和培养条件等都可能是影响
成活率的主要原因。对广西地不容而言，采样季节和
时间对成活率影响不大。
在继代培养中，为了达到快速繁殖的目的，通常
需要在培养基中添加一定质量浓度的激素。然而，由
于多次继代，造成激素在培养材料中累积[9’101，常导
致培养材料的异常生长，如玻璃化[111和体细胞变
异[12~1妇等。激素的累积对不同的植物材料影响不
同，有些植物，如马蹄莲，激素累积效应不明显，可在
含相同质量浓度激素的培养基上重复继代多次；而
多数植物，如草莓[1明等，激素累积效应明显，须调整
不同继代阶段的激素质量浓度(一般采取逐代降低
的办法)，以避免激素累积造成的负面影响。广西地
不容与上述两类植物有所不同，其培养材料中细胞
分裂素BA的累积和作用方式是突发式的，不论质
量浓度高低，只要连续使用两代，就会产生明显的负
面效果(新芽萎缩，难以伸长长高，添加GA不能解
除此症状)；而且，与其他激素累积效应不同的是，其
并未形成大量的丛生芽，也未见玻璃化，发生这种现
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第3期2007年3月·449·
象的内在原因有待进一步研究。
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红花RAPD和AFLP分子标记技术多态性效率比较
，
张阵阵1，郭美丽1t，张军东2，张汉明1
(1．第二军医大学药学院生药学教研室，上海200433}2．第二军医大学药学院药理学教研室，上海200433)
摘要：目的 探讨RAPD和AFLP这两种分子标记技术应用于红花不同品系多态性效率的比较。方法以河南
无刺大红袍和若羌有刺白两个红花品系为材料，应用100条RAPD引物、64对AFLP引物，对两品系进行多态性
筛选，初步确定反映品系问差异的引物。结果 筛选到RAPD特异性引物共5条，分别为AA52726、AA52729、
AA52739、AA52766、AA52785，在两品系间扩增到稳定的差异片段；筛选到AFLP特异性引物共7对，分别为
AF26356、AF26372、AF26385、AF26311、AF26396、AF26327、AF26343，在两品系间扩增到稳定的差异片段。结果
表明，平均每条RAPD引物可以扩增出红花基因组片段数目4～10条，多态性选出率为0．20％，平均每对AFLP
引物可以扩增出红花基因组片段数目为50～80条，多态性选出率为0．31％。就每条(对)引物平均可以扩增出多态
性条带的数目而言，RAPD引物为1～2条，AFLP引物组合则4～5条，AFLP的检测效率明显高于RAPD。结论
在红花的分子标记研究中，AFLP较RAPD为更有效的分子标记。
关键词：红花；RAPD}AFLP；分子标记；效率比较
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)03—0449一03
Efficiencycomparisononp lymorphisminCarthamustinctoriuswithRAPDandAFLP
ZHANGZhen—zhenl，GU0Mei—lil，ZHANGJun—don92，ZHANGHan—min91
(1．DepartmentofPharmacognosy，SchoolofPharmacy，SecondMilitaryMe icalUniversity，Shanghai200433，China，
2．DepartmentofPharmacology。SchoolofPharmacy，SecondMilitaryMe icalUniversity，Shanghai200433，China)
Keywords：CarthamustinctoriusL．；randomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)；amplified
fragmentlengthpolymorphism(AFLP)；molecularmarker；efficiencyomparison
收稿日期：2006—06—27
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30271588)}国家中医药管理局课题(02—03zp54)I上海市基础研究重点项目(043919313)
作者简岔：．张畦堕11979一)，女，山东人，硕士，研究方向为生药种质资源。E-mailtZZ—jane@163．corn．
*通讯作者郭美丽E—mail：ndguo@smmu．edu．tom
万方数据
广西地不容组培快繁研究
作者： 黄宁珍， 唐凤鸾， 付传明， 李锋， 赵志国， HUANG Ning-zhen， TANG Feng-luan，
FU Chuan-ming， LI Feng， ZHAO Zhi-guo
作者单位： 广西壮族自治区中国科学院,广西植物研究所,广西,桂林,541006
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(3)
被引用次数： 3次

参考文献(15条)
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Fei.ZU Yuan-Gang 弱光对长春花(Catharanthus roseus)幼苗中可溶性糖、生物碱及激素含量的影响[期刊论文]-
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6. 何卫中 景宁惠明白茶的繁育技术及其生物性状稳定性研究[学位论文]2009
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8. 李萌 不同处理对茶籽萌发和茶苗生长的影响[学位论文]2007
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CHEN Zong-You.LI-Feng 黄花蒿规范化生产标准操作规程(SOP)[期刊论文]-广西植物2008,28(3)

引证文献(3条)
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2.唐凤鸾.黄宁珍.付传明 植物生长调节剂对广西地不容愈伤组织诱导的影响[期刊论文]-广西农业科学 2009(4)
3.池源.田恬.李兴 山乌龟药用价值及组织培养研究进展[期刊论文]-中国民族民间医药 2008(12)


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