全 文 ：·274· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
广藿香茎的发育，类似于一般草本双子叶植物。
在不同发育阶段，挥发油的分布场所有所不同，这与
器官的生长发育节律和不同时期植株对挥发油的需
求有密切的关系。在茎的原生和初生分生组织阶段，
光镜下未观察到有挥发油分布。由于分生组织幼嫩，
易受病虫害侵袭，因此非腺毛和含有刺激性气味挥
发油的腺毛明显地具有保护幼嫩组织的作用[9]。在
初生结构和次生结构中，其组成细胞功能逐渐分化，
此间挥发油可能逐渐分解，为这些细胞的分化提供
所需的能量，同时为另一些代谢活动提供前体物质。
在皮层薄壁细胞中，依然有大量的挥发油。究其原
因，是因为这些细胞内含有丰富的质体，而它们则正
是挥发油的主要合成场所。一部分挥发油分解，同时
又有新的挥发油合成，从而分解与合成形成一种动
态平衡关系。这样，皮层与周皮一起协同作用，对植
物体起到了化学和机械的双重保护作用。广藿香茎
的次生结构中，特别是在周皮发生后，木栓层以外部
分的营养和水分供应被隔断，表皮毛逐渐死亡，已无
挥发油分布。但在残存的皮层中，却有大量的挥发油
滴，残存的皮层薄壁细胞成了此阶段挥发油分布的
主要部位。
实验结果表明，在广藿香茎发育的各个时期，其
内的挥发油都主要分布在茎皮内。如前所述，广藿香
的有效成分主要是其挥发油。因此，在选育和评定广
藿香的品种是否优良时，可以把广藿香茎皮的厚薄
作为一个重要指标。另外，考虑在以广藿香的茎枝入
药时，是否可以仅取广藿香茎枝的皮部(新鲜材料的
茎皮容易剥离)。这样即可大量节省药材运输、翻晒、
贮藏、炮制等工序的人力和物力，又不会造成有效成
分的流失、浪费。当然，这可能与传统饮片用药习惯
不相符，但笔者认为，如果进一步根据有效成分的使
用量来量化用药量，这不失为一种可尝试的用药方
式。同时，也可为使用中药标准提取物提供量化方法
上的参考和帮助。
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康定冬虫夏草与人工虫草的RAPD指纹图谱比较研究
于超1，何俊琳2，曾 纬1，邓斌2
(1．重庆市中药研究院，重庆400065；2．重庆医科大学，重庆400046)
摘要：目的 用RAPD方法对康定虫夏、人工虫草及虫草发酵菌丝体进行指纹图谱的研究，为不同虫草的品质
和药效差异提供分子依据。方法从65个随机引物中筛选出7个引物，以这7个引物进行PCR扩增，电泳得到其
指纹图谱。结果没有发现任何两个样本拥有完全相同的RAPD标记，康定冬虫夏草和人工虫草具有较高的遗传
多态性，而与虫草发酵菌丝体相比差异较大。结论来自不同产地冬虫夏草群体均表现出其独特的RAPD标记，
其差异可能系虫体的不同所致。随机扩增的DNA片段的差异是否预示其药效的不同，有待进一步研究。
关键词：冬虫夏草；RAPD；指纹图谱
中图分类号：R282．71 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)02—0274—04
收稿日期：2004—04—24
基金项目：重庆市科委基金资助项目(6962)
作者筒介：于超(1963一)，男，山东人，副研究员，博士，长期从事中药化学、中药物质基础和中药分子生物学研究，研究方向为药物分
析化学和新药开发。Tel：(023)62466269E—mail：yuchaom@163．corn
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月·275·
FingerprintcomparisononC rdycepssinensisandartificialonesbyRAPD
YUCha01，HEJun—lin2，ZENGWeil，DENGBin2
(1．ChongqingAcademyofChineseMateriaMedica，Chongqing400065，China；
2．ChongqingUniversityofMedicalSciences，Chongqing400046，China)
Keywords：Cordycepssinensis(Berk．)Sacc．；RAPD；fingerprint
虫草属Cordyceps(Fr．)Link是一大类昆虫病
原真菌，其特定的菌感染特定的昆虫后就会成为具
有重要的药用价值的冬虫夏草C．sinensis(Berk)
Sacc．。近年来，发酵培养和人工冬虫夏草成为热点，
引发了关于冬虫夏草无性型的学术争论[1]，国内已
报道与冬虫夏草有关的丝孢菌，多达10属16种[2]。
此外，人工培养的菌丝体种类也较多。这些菌种与真
正野生型菌种的关系如何?用什么样的技术手段来
证明就成为当今研究的一个难题。传统的方法一是
从菌丝体的各种生活阶段的形态学上进行比较；另一
种方法是在实验条件下，将用各种途径分离获得的假
定无性型，人工感染寄主昆虫，诱发形成具有成熟子
囊壳的虫草子实体，然后再进行比较。但由于操作等
方面的技术原因，迄今很少能完成这一程序。本实验
拟应用RAPD方法D3来区分康定冬虫夏草与人工冬
虫夏草及发酵菌丝体，并分析它们之间的相关性。
1材料与方法
1．1材料：康定虫草购自四川省甘孜州康定地区。
人工虫草及发酵菌种均为我院自行孵育和发酵的品
种，菌虫种源来自四川阿坝州。
1．2仪器与试剂：PE4800PCR扩增仪(美国PE
公司)，Power--Pac300电泳仪(美国Bio—Rad公
司)，电泳槽(北京六一仪器厂)。随机引物及PCR
试剂盒(上海Sangon公司)，EcoR—I和HindⅢ分
子量标准品(Prommiga公司)，琼脂糖(Bio—Rad公
司)，其他为市售分析纯试剂。
1．3方法
1．3．1虫草DNA提取：取虫草粗粒干品约1．0g，
用灭菌TES缓冲液浸泡4℃过夜。其中换液两次，
去除部分可溶性色素。离心去上清液，将样品及乳钵
一起于一20℃冷冻1h以上，取出后迅速粉碎成
粉。加2mL于60℃预热的抽提缓冲液[2％
CTAB，1．5mol／LNaCl，0．2％巯基乙醇，20
mmol／LEDTA(pH8．O)，100mmol／LTris～HCl
(pH8．o)]，60℃提取1～2h，其间混摇数次。离
心，去沉淀，上清液用酚和氯仿各抽提2次，取水
相，加1／10体积醋酸钠、等体积异丙醇，沉淀出白
色絮状DNA。75％乙醇洗两次，置75％乙醇中保
存，或溶于适量TE备用。
取DNA溶液100mL，加lmLRNA酶(20
mg／mL)，37℃保温1h，加3倍体积5mmol／L
NaCl，30肚L玻璃粉混匀，放置30min。随时混摇，
10000r／min离心2min。加洗液(0．2mol／L
NaCl，10mmol／LTris—HCl，pH8．0，2mmol／L
EDTA，50％乙醇)400肛L混匀，离心，弃上清液，重
复洗3次，加150pLTE缓冲液，55℃保温15min，
混摇几次，离心，取上清液于一20℃保存备用。
1．3．2模板DNA的浓度及质量检测：DNA的浓
度和质量的检测使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶
电泳的方法，测定DNA提取液在260、280nm波长
处的紫外吸光度(A)值，计算A。。。／A：∞值，估算其
纯度；电泳时用0．8％琼脂糖凝胶，0．5,ug／mLEB
染色，测定DNA样品的纯度。
1．3．3引物筛选：按引物GC含量不同随机挑选出
65个S系列引物，从提取的DNA模板液中任选一
个为模板，对所有引物进行PCR扩增，选出电泳条
带清晰、数目尽可能多的引物。重复一次，最后确定
可重复的、条带相对清晰的引物7～8条为最终的
实验用引物。
1．3．4PCR扩增反应：以不同样品所提取的DNA
为模板，在以下反应体系中扩增：25弘L的反应体系
中包括10倍量稀释的PCR缓冲液2．5肛L，25
mmol／LMgCl2为1．5弘L，4种DNTPS(各2．5
mmol／L)为2弘L，3p 引物(0．18ng)，模板DNA
为4t-tL(约5～25ng)，Taq酶4U，灭菌去离子水
12JuL。
扩增程序：95℃预变性5min，PCR循环40
次，每循环为94℃变性45S，36℃退火1min，72
℃延伸2min，最后72℃延伸7min。
PCR检测：1．2％琼脂糖电泳，加入DNA
EcoR—I和HindⅢ为分子量标准，溴化乙锭(EB)
的质量浓度为0．5弘g／mL，电压为4V／cm，稳压电
泳约2h，在紫外透射仪上观察、照相。
2结果与分析
2．1康定冬虫夏草与人工冬虫夏草比较：从65个
引物中筛选出7个，使用其中6个能够产生清晰而
万方数据
·276· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
且呈现多态性条带的引物，按前述RAPD方法，得
到12个受试样本，对其进行统计分析(表1)。在供
试材料中共获得138条DNA扩增片断，每条引物
所能扩增的条带在8～14条，平均每条引物扩增的
DNA带数为11．4条，其中9．6条具有遗传多态
性，约占总数的84．o％；产生的DNA片段主要分
布在0．5～5kbp区域，少数片段小于0．5kbp或大
于5kbp。康定冬虫夏草与人工冬虫夏草的指纹图
谱相比较，两者的相似率较高(图1)，说明两者分子
基础有较大的相似之处。是否在药效方面也相似值
得进一步研究。
2．2康定虫草与发酵后返接菌种及康定虫草中分
离纯菌种比较：应用筛选出的5种引物，增加一个
$80引种，其序列为ACTTCGCCAC(57—37)；从指
纹图谱可以看出：康定虫草与发酵菌种相比(图2)，
共产生DNA片断106条，其中共有DNA片断平
表1 RAPD引物及PCR扩增结果
Table1 RAPDprimersandPCRamplification
4973bp
564bp
模板：2、4、6、8、10、12为康定虫草模板，3、5、7、
9、11、13为人工虫草模板。
引物：2、3-S74、5-SlO6、7-$238、9-$31
10、11一$3312、13-S6l
Templates：2，4，6，8，10，12aretemplatesofC．sinensis；
3，5，7，9，11，13areartificialsampleofC．sinensis
Primers：2，3-S74，5-S106，7-$238，9-$31
10，11-$3312。13一$61
图1 康定虫草和人工虫草由S7～S61产生的RAPD带型
Fig．1RAPDbandsofC．sinensisandartificial
onesamplifiedbyS7一S61
均为6．6条，多态性标记占62．3％(表2)。结果表
明虫草与菌丝体的共有标记较少，差异部分可能更
多的是来源于虫草的虫体部分的DNA。
模板：1、4、7、10、13为阿坝虫草模板，2、5、8，11、14为发酵虫
草菌丝体模板，3、6、9、12、15为康定虫草分离菌丝体模板
引物：1～3一S74～6-$317～9一$3310W12一$61
13～15一$80
Templates：1，4，7，10，13aretemplatesofC． inensis；
2，5，8，11，14aretemplatesoff rmentedmycelia；3，6，9，
12。15aretemplatesofmyceliaseparatedfromC．sinensis
Primers：1—3一S74—6一$317—9一$3310—12一$61
13—15一$80
图2冬虫夏草与不同来源菌丝体的RAPD带型
Fig．2RAPDbandsofC．sinensisandifferentmycelia
表2康定虫草与发酵菌种的PCR扩增结果
Table2 ResultsofPCRamplificationbe weenwild
C．sinensisandfermentedmycelia
引 物 康定虫草的标记数发酵菌种标记数 共有标记数
S7 7
S31 7
S33 17
S61 10
S80 14
总计 55
平均数 11
多态性／％
9
7
12
9
4
51
10．2
而发酵菌种与康定虫草中分离纯化菌种相比，
共产生DNA片断107条，共有片断平均9．6条，多
态性89．7％(表3)，表明两者之间菌种部分很可能
是同一品种，因为其DNA指纹相似率较高。但菌丝
体感染昆虫后，作为冬虫夏草的DNA提取物与菌
丝的DNA指纹相似率大大下降，说明昆虫的DNA
对菌丝体DNA有较大干扰。
3讨论
结果表明，RAPD技术显示了极好的分辨率，
没有发现任何两个样本拥有完全相同的RAPD标
记，不同来源的冬虫夏草群体表现出其独特的遗传
多态性，这种多态性可能系虫体的不同所致。由此可
见，RAPD技术是从分子水平研究虫草之间相互关
系的有效方法。不同来源的虫草或菌丝体存在着明
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月·277·
表3发酵菌种与分离纯化菌种的PCR扩增结果
Table3 ResultsofPeRamplificationbe ween
fermentedmyceliaandpureC．sinensis
引物 发酵菌种标记数分离纯化菌种的标记数共有标记数
显的遗传分化，在一定数量引物的实验中，没有发现
任何两个样本具有完全的RAPD标记，但亲缘关系
较近的，则共有标记较多，而不同的标记能否作为不
同来源样本的特征性鉴定条带，以供鉴定不同来源
的虫草正在进一步的研究当中。
天然康定虫草与本院生产的人工虫草RAPD
指纹有较大的相似之处，提示两者的药用或营养价
值可能相似。说明虫草的菌种相同，虫体也一致，且
生长环境相近似时，天然冬虫夏草与人工虫草的分
子水平相差不太大；进一步比较天然虫草与发酵菌
丝体的DNA指纹，相似率并不高。但分离纯化的菌
丝与发酵菌丝体的DNA比较有较大的相似率
(89．7％)。说明虫部的DNA差异是造成相似率差
异的主要原因。提示进行DNA指纹比较时，材料来
源部位一致性很重要。
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马蹄香的生药鉴定及其与华细辛的鉴别
彭 强1，赵桦2，张国柱1
(1．汉中市药品检验所，陕西汉中723000；2．陕西理工学院陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中723000)
摘要：目的对马蹄香进行生药鉴定，并与易混品华细辛鉴别。方法原植物特征和药材性状描述，显微镜观察，
薄层色谱、高效液相色谱和荧光实验比较。结果 马蹄香和华细辛的原植物主要在是否有地上茎、叶柄是否被毛，
花的类型、颜色和果实特征方面有所不同；药材性状在形状、颜色、质地、断面以及气味上存在差异；显微特征在是
否检出油细胞或木纤维群以及横断面特征、淀粉粒形态上有区别；薄层、高效液相色谱和荧光特征也有明显差异，
并在马蹄香中检出马兜铃酸A。结论为马蹄香的生药鉴定及其与华细辛鉴别提供了依据，并提示使用马蹄香应
防止可能发生的马兜铃酸的毒性危害。
关键词：马蹄香；华细辛；生药鉴定；薄层色谱；高效液相色谱；马兜铃酸A
中图分类号：R282．71 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)02—0277—04
PharmacognosticidentificationofSarumahenryiandifferentiationofAsarumsicbodii
PENGQian91，2：HAOHua2，ZHANGGUO—zhul
(1．HanzhongInstituteforDrugControl，Hanzhong723000，China；2．Bio-ResourcesKeyLaboratory
ofShaanxiProvince，ShaanxiUniversityofTechnology，Hanzhong723000，China)
Keywords：SarumahenryiOliv．；AsarumsiebodiiM q．；pharmacognosticidentif ation；TLC；
HPLC：aristolochicacidsA
马兜铃科植物马蹄香SarumahenryiOliv．为
我国特有单种属植物，分布于陕西、四川、贵州、湖
北、江西、河南、甘肃等省。其干燥的根及根茎在民间
药用，习称马蹄香、冷水丹、高脚细辛、马头细辛。性
温，味辛、苦，有小毒，具温中散寒、理气镇痛功能，主
治胃寒痛、心前区痛和关节痛等症‘¨。马蹄香的入药
部位与陕西产的同科植物华细辛Asarumsiebodii
Miq．的入药部位相同，其名称与华细辛的别名白细
收稿日期12004—04—18
基金项目：陕西省自然科学基金资助项目(2003C102)；陕西省教育厅重点实验室科研项目(2001)
万方数据
康定冬虫夏草与人工虫草的RAPD指纹图谱比较研究
作者： 于超， 何俊琳， 曾纬， 邓斌， YU Chao， HE Jun-lin， ZENG Wei， DENG Bin
作者单位： 于超,曾纬,YU Chao,ZENG Wei(重庆市中药研究院,重庆,400065)， 何俊琳,邓斌,HE Jun-
lin,DENG Bin(重庆医科大学,重庆,400046)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(2)
被引用次数： 12次

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