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Effect of Daming Capsule on mRNA expression of M receptor‘s different isoforms on cardiac muscle of hyperlidemic rats

大明胶囊对高脂血症大鼠心肌M受体各亚型mRNA表达的影响



全 文 :·1362· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月
可能是通过抑制MAO—B来实现的[6J]。有研究证明
nNOS基因缺陷突变小鼠可以抵抗MPTP的神经
毒性,表现为纹状体和黑质的损伤明显减轻[7]。抑制
nNOS可以减轻MPTP的毒性作用[8]。这些研究为
NO参与PD的发病机制提供了证据。还有研究发
现NO促进MPP+对多巴胺能神经元和培养的星
型胶质细胞的毒性作用[9]。给予单剂量MPTP4~
12h后,nNOS活性在纹状体增高,MPTP的毒性
作用表现为NO及ONOO一增高口0|。
本研究发现小鼠SCMPTP20mg/kg连续
8d,与NS+NS组比较,MPTP+NS组尾核内的
NoS免疫反应阳性神经元数目明显增加(户<
0.01),脑内黑质致密部的多巴胺能神经元数目明显
减少(P<0.01)。同时MPTP+NS组小鼠运动协
调能力降低。而MPTP+SVHRP与NS+NS组比
较没有明显变化。MPTP+SVHRP组动物黑质致
密部多巴胺能神经元受损程度明显减轻,动物的运
动障碍明显改善,这可能与SVHRP明显抑制尾核
内nNOS的过度表达有关。前期体外实验证实
SVHRP有明显的抗氧化和清除自由基作用,但体
内抗氧化机制尚不清楚。本研究还发现SVHRP一
方面可以保护中脑黑质致密部多巴胺能神经元;另
一方面通过降低纹状体nNoS的表达改善MPTP
引起的运动协调性降低,有良好的治疗作用。逆转
MPTP引起的尾核nNOS免疫反应活性增强。NO
是学习记忆中的重要信号转导分子,参与学习记忆
的功能调控。所以NO很可能参与其保护机制。
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大明胶囊对高脂血症大鼠心肌M受体各亚型mRNA表达的影响
邢妍,岳朋,李 惠,张勇,林道红,董德利,吕延杰,杨宝峰。
(哈尔滨医科大学药理教研室,黑龙江省生物医药工程重点实验室一省部共建国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150086)
摘要:目的通过检测M受体各亚型在心肌上的mRNA表达量,研究大明胶囊对高脂血症大鼠降血脂作用的
分子机制。方法制备高脂血症大鼠模型,尾静脉取血测血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白
(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、游离脂肪酸(FFA)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等血脂指标;Trizol
法提取心肌总RNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)测定M。、Ms、Mt、Ms4种M受体亚型mRNA的表达,
观察其在高脂、正常和给药3种条件下的差异。结果 高脂血症时血清中的TC、TG、LDL、FFA及MDA水平升高
(PHDL与SOD水平上调(P<0.05)至近正常水平}比较高脂模型组与正常组M受体各亚型mRNA表达,结果
M。、M“M。受体亚型表达减弱,M。受体亚型表达增强,差别有统计学意义(P比较M。受体亚型mRNA表达增强,Mz受体亚型表达减弱,且具有显著差异伊<0.05),Mt、Ms受体亚型mRNA
收稿日期:2006一01—27
基金项目:重大基础研究前期专项(2004CCA06700)
作者简介:邢妍(1981一),女(蒙古族),辽宁阜新人,硕士在读,研究方向为心血管药理学。Tel:(0451)86671354
*通讯作者杨宝峰Tel:(0451)86671354E—mail:yangbf@ems.hrbmu.edu.ca
万方数据
中草焉CMn鹤eTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月·1363·
表达元显著差异(P>O.05)。结论高脂血症大鼠模型建立成功,大明胶囊具有降血脂作用,并且M。受体的水平
上调是大明胶囊降血脂作用的分子机制之一。
关键诩:大明胶囊}M受体;高脂血症;RT—PCR
中田分类号:R286.26 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2006)09—1362—05
EffectofDamingCapsuleonmRNAexpressionofMreceptor
7
sdifferentisoforms
oncardiacmuscleofhyperlidemicrats
XINGYan,YUEPeng,LIHui,ZHANGYong,LINDao—hong,
DONGDe-li,LUYan-jie,YANGBao—feng
(DepartmentofPharmacology,Bio—pharmaceuticalKeyLaboratoryofHeilongjiangProvince-Incubator
ofStateK yLaboratory,HarbinMedicalUn versity,Harbin150086,China)
Abstract:ObjectiveToseekthmolecularmechanismofdecreasingbloodlipideffectofDarning
CapsuleonhyperlipemicratviastudyingthemRNAexpressionofthesubtypesofMreceptorinthe
myocardium.MethodsHyperlipemicratodelwasmadefirstly,thebloodwasobtainedviavena
caudalis,theindexesintheserum,~suchasTC,TG,LDL,HDL,FFA,MDA,andSOD,were
measured,themyocardialtotRNAwasextractedbyTrizolmethod,thedifferenceofthfoursubtypes
ofMreceptorM2,M3,M4,andM5mRNAexpressioninthreegroupsofhyperlipemia,normal,anddrug
administrationw scomparedbyRT—PCR.ResultsTheconcentrationsofTC,TG,LDL,FFA,and
MDAinserumincreased(P<0.05),whilethelevelsofHDLandSODdecreased(P<0.05).Afterthe
treatmentbyDarningCapsule,theconc ntrationsof heprecedingfourindexescutdown,whilethe
concentratinsoftheposttWOoneswentuptonearlynormallevel.ThemRNAexpressionsofeachubtype
ofMreceptorbetweenthehyperlipemiagroupandnormalgroupwerecompared,theexpressionofM2,
M4,andM5receptorsdecreased(Psignificantst tisticaldifferencesamongthem.Thelev lofM3receptorincreased(Preceptordecreased(P<0.05)aftergivingDamingCapsulecomparingw thyperlipemiagroup.
Moreover,thedifferenceshavstatisticals gnificance.theexpressionofMtandM5receptormRNAhave
nosignificancedifference(P>0.05).ConclusionHyperlipem cratmodelissuccessfullyestablished.
DamingCapsulehastheffectofloweringbloodlipid.Furthermore,theincreasingthexpressionofM3
receptoriS neofthemechanismsthatDarningCapsuledecreasesthblood1ipid.
Keywords:DarningCapsule;Mreceptor;hyperlipemia;RT—PCR
大明胶囊是本室研制已经上市的降脂新药,有
明确的降血脂作用。除降血脂作用之外,本室研究还
发现大明胶囊具有治疗心肌缺血、心肌梗死、脑梗
死、降血糖的作用,但是缺乏对其分子机制的深入研
究。药物的作用机制是通过药物与机体生物大分子
之间的相互作用完成的,而生物大分子中的受体是
药物作用的关键环节之一,因此受体结构与功能的
研究成为近年来探索药物作用机制的重点。而心肌
上存在M。~M。5种受体亚型,在心肌许多重要的
生理和病理生理过程中发挥重要的作用,是药物作
用的靶点c1],其中M。受体在缺血心肌保护方面具有
重要意义[2矗],大明胶囊作为一种新型降血脂药物其
作用机制是否与心肌上的受体有关尚未得到证实。
因此,本实验通过检测M受体各亚型mRNA表达
变化揭示高脂血症时M。~M。受体发挥的作用,进
而阐明大明胶囊的降血脂作用与心肌M受体之间
的关系。
1材料
1.1 动物:选用Wistar雄性大鼠40只,体重
180~200g,购自哈尔滨医科大学动物学部。
1.2 药物:大明胶囊(大黄、明子、陈皮、人参、茯
苓),为哈尔滨伊达药业有限公司产品,国药准字Z
20030085,产品批号20040702;丙基硫氧嘧啶购自
上海复兴朝晖药业有限公司,国药准字H
31021082,产品批号20041203;戊巴比妥钠购自上
海化学试剂采购供应站。
1.3 试剂:总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯
(TG)试剂盒、低密度脂蛋白(LDL)试剂盒、高密
度脂蛋白(HDL)试剂盒购自浙江东瓯生物工程有
限公司,游离脂肪酸(FFA)试剂盒、丙二醛
(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购
自南京建成生物工程研究所。总RNA提取试剂盒
万方数据
·1364· 中单菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月
是Invitrogen试剂公司产品,RT—PCR试剂盒从
Invitrogen试剂公司和宝生物工程(大连)有限公
司购买。
1.4 仪器:PCR仪(美国BIO—RAD公司),低温高
速离心机(BECKMAN公司,CS一15R),水平电泳
仪(美国BIO—RAD公司),紫外分光光度仪(美国
BIO—RAD公司,SmartpecTM3000),天能GIS凝
胶图像处理系统(上海天能科技有限公司)。
2方法
2.1 高脂动物模型的制备[4]:用脂肪乳(胆固醇
1%、动物大油20%、丙基硫氧嘧啶1%、丙二醇
30%、聚山梨酯一8020%、其他20%)按照10mL/
kgig14d。
2.2分组:健康雄性Wistar大鼠40只随机分成5
组:正常组,高脂模型组,大明胶囊大、中、小剂量组,
每组8只。高脂组ig脂肪乳,大明胶囊组ig脂肪乳
和大明胶囊Ezoo、100、50mg/(kg·d)]。正常组ig
同等体积生理盐水。给药剂量参见文献方法口]。
2.3样品采集及测定:第14天ig给药后禁食,不
禁水。第15天尾静脉取血。3000r/min离心5min
分离血清,按试剂盒方法测定TC、TG、LDL、HDL、
FFA、MDA、SOD。
2.4 半定量RT—PCR
2.4.1总RNA的提取:尾静脉取血测定血清指标
确定模型制备成功之后,1%戊巴比妥钠ip麻醉(4
mL/kg),取下心脏,左心室剪成0.5mm×0.5mm
大小的组织块液氮冻存,一80℃保存组织块;一步
提取法提取心室肌总RNA。各总RNA样本A。。。/
A。8。的比值为1.8~2.0。
2.4.2扩增引物设计与合成:根据Genebank的序
列,并参考相关文献方法曲],用Primer5.0软件分
别设计M。、M。、M。、M。、pactin,并由上海申能博彩
物:57TACCCTCTACACTGTGATTGGC37,M。下
游引物:57ATGATGACAGGCAGATAG37(364
bp);M3上游引物:57GTGGTGTGATGATTGG—
TCTG3’,M。下游引物:57TCTGCCGAGGAGTT—
GGTGTC37(790bp);M4上游引物:57AGTGCTT—
CATCCAGTTCTTGTCCA37,M4下游引物:5
7
CA—
CATTCATTGCCTGTCTGCTTTG3’(510bp);M5
上游引物:57CTCATCATTGGCATCTTCTC—
CA3’,M5下游引物:5’GGTCCTTGGTTCG—
CTTCTCTGT37(451bp);口一actin上游引物5
7
CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA37,下游引物
5’CGGACTCATCGTACTCCTGCT37(250bp)。
2.4.3PCR反应条件:94℃、2min,首次循环
94℃、30S,55℃、30S,72℃、30S。各引物均做循环
梯度选择平台期之前的最适宜的循环数,M。29个
循环、M。31个循环、M。34个循环、M。31个循环、p_
actin28个循环,PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电
泳,以BIO—RAD多媒体凝胶成像系统照相,并进行
半定量分析。
3结果
3.1模型制备结果:造模第1~5天高脂模型组和
给药组体重普遍减轻30~50g,进食少,活动情况
差,正常组无变化,直到第14天给药组体重明显恢
复,活动情况改善,而高脂模型组无明显改变。
3.2血清指标测定结果
3.2.1对血脂指标的影响:如表l所示,三组间单
因素方差分析正常组与高脂模型组,高脂模型组与
大明胶囊大剂量组和中剂量组TC、TG、LDL、
HDL、FFA均有显著性差异,而大明胶囊小剂量组
与高脂模型组无统计学意义。高脂模型组血脂代谢
紊乱表明高脂模型建立成功,大明胶囊大剂量、中剂
量组血脂恢复接近正常,而小剂量组无变化,表明大
生物科技有限公司合成。引物序列如下:M。上游引 明胶囊具有降血脂作用并且有剂量依赖性。
表1大明胶囊对高脂血症大鼠血清血脂指标的影响(i土s,席一8)
Table1 EffectofDarningCapsuleonbloodlipidndexesinserumofhyperlipemicrats(;±s,n=8)
与模型组比较:。P<0.05~P<0.01⋯P‘P3.2.2对MDA和SOD的影响:如表2所示,正常和大明胶囊中剂量组有显著性差异,而大明胶囊小
组与高脂模型组,高脂模型组与大明胶囊大剂量组 剂量组无统计学意义。表明高脂血症时SOD活力
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月·1365·
显著减弱,MDA水平显著升高,产生氧自由基损伤
心肌组织。经大明胶囊治疗后血清SOD、MDA恢复
并接近正常水平,证明大明胶囊的降血脂作用是通
过清除体内氧自由基实现的。
农2大明胶囊对高脂血症大鼠血清MDA水平和
SOD活性的影响G士s,咒一8)
Table2 EffectofDamingCapsuleonMDAlevel
andSODactivityinserumofhyper—
lipemicrats(膏±s,一=8)
与模型组比较:’P<0.05~P<0.01
+P<0.05。。P<0.01795modelgroup
3.3 RT—PCR结果:以总RNA为模板分别扩增出
M2、M3、M4、M5、p-actin,然后以pactin为内参照调
节加样量使其达到亮度(丰度值)一致,再按p-actin
的加样量加各组M。~M。的PCR产物,琼脂糖凝胶
电泳结果如图1所示。从结果看出高脂血症时M。、
M。、M。受体mRNA表达减弱,M。受体mRNA表达
增强,证明M。受体参与了受损心肌的保护作用,给
药后M。、M。、M。受体表达减弱或无变化,M。受体表
达增强,表明高脂血症时大明胶囊的降血脂作用与
M。受体有关。半定量结果见表3。
4讨论
高脂血症,特别是血清TC升高是动脉粥样硬
化性心血管病的主要危险因素之一。高血脂不仅造
成血管壁的病理变化,而且能引起超氧阴离子o。7自
由基的增多,大量氧自由基能严重损伤心肌组织[7],
M—Marker1-正常组2一模型组3~5-大明胶囊(200、100、50mg/kg)组
M—Marker1-normalgroup2-modelgroup3 5一DamingCapsule(200,100,and50mg/kg)group
图l 大明胶囊对M:(A)、M,(B)、M。(C)、M。(D)受体mRNA表达及p—actin(E)的影响
Fig.1EffectofDamingCapsuleonmRNAexpressionofM2(A),M3(B),M4(c),andM5(D)receptorsandB—actin(E)
表3大明胶囊对心肌M受体mRNA表达的影响@±S,露一8)
Table3 EffectofDamingCapsuleonmRNAexpressionsofcardiacmuscleMreceptor(x士s,抖一8)
与模型组比较:’P+P<0.05。’P连锁引起机体脂质过氧化物的增多,分解产生大量
的MDA。自由基是机体代谢过程中连续不断产生
的损害自身的物质,但是机体有一系列清除自由基
的途径,如体内的SOD在正常情况下保持体内自
由基的平衡。MDA和SOD可以间接反映心肌细胞
损伤程度。本实验结果显示,高脂血症时产生过多的
MDA,而SOD活力降低则自由基反应失去平衡,大
量O。7损伤心肌组织形成恶性循环,同时利用梯度
PCR技术得出高脂血症时M。受体mRNA表达增
强,M:、M。、M。受体mRNA表达减弱的结果。PCR
反应属于酶促化学反应,酶促反应速度与底物浓度
有关,底物浓度增加反应速度随之增加,当底物浓度
达到一定程度使酶的活性中心饱和时,增加底物浓
度反应速度不再增加,酶促反应进入平台期,而
PCR反应进入平台期之后不同组织中各蛋白表达
均一致。本实验根据这一原理做梯度PCR,在平台
期之前每次增加3个循环数,得出随循环数的增加
条带亮度依次增加的实验结果,选择最适宜的亮度,
以此时的循环数作为最终结果。最后,平台期前每个
循环均无任何非特异杂带产生,每个亚型与预扩增
碱基数一致,证实了各亚型的特异性,避免了反应进
入平台期而造成的各组mRNA表达均一致的实验
误差。本实验成功扩增出M:~M。4种亚型的M受
体,打破了传统的认为“只有M。受体是支配心脏功
万方数据
·1366· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月
能的唯一受体”的观点,证实M受体各亚型共同存
在于心肌上调节心脏生理功能,尤其是M。受体在
高脂血症时表达增强,发挥着防御疾病、保护心肌不
可或缺的作用。
另一方面高脂血症时产生的大量脂质过氧化物
对细胞器和细胞膜以及细胞内酶与核酸都有损害作
用,并增加心律失常的发生[8]。本室建立的抗心律失
常最佳靶点假学说[9]强调M。受体在心肌缺血过程
中的保护性调节机制及意义,首次提出结扎大鼠冠
状动脉前降支导致心肌缺血时M。受体激动剂(胆
碱)可减轻心肌损伤,阻断剂(4一DAMP)可加重损
伤程度[9]。进一步证明M。受体激动剂胆碱可减少
H。O:诱导的心肌细胞凋亡数,并可抑制H。O。诱导
的[Ca2+]i增多,增加心肌抗凋亡信号分子Bcl一2、
ERK的表达,减少凋亡前体蛋白Fas、p38MAPK
表达,对损伤心肌发挥保护作用[3’1州。本实验在上述
理论基础上进一步在mRNA水平定量出M。受体
在高脂血症这一心律失常危险因素时的表达,使
M。受体在病理状态下的功能研究推进到分子水平。
进一步研究发现中药大明胶囊治疗后,M。受体
数目持续升高,其他亚型M受体无变化或减少,血
中MDA减少,SOD恢复正常,证明大明胶囊的降
血脂作用与M。受体有必然的内在联系。可能是通
过作用于M。受体使血清MDA减少,SOD活力增
强,清除体内氧自由基实现的。其分子机制可能与G
蛋白偶联的信号转导途径有关,具体转导机制有待
进一步的研究证实。
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表没食子儿茶素没食子酸酯下调紫外线诱导小鼠皮肤
TNF—ocmRNA及p53蛋白水平的研究
骆丹,徐丽贤,缪旭,林向飞,吉 玺,朱洁
(南京医科大学第一附属医院皮肤科,江苏南京 210029)
摘要:目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对中波紫外线(UVB)慢性辐射诱导BALB/c小鼠皮肤
TNF—UmRNA表达及p53蛋白表达水平的影响。方法EGCG局部外用于小鼠背部及耳部皮肤后给予不同强度
的UVB辐射,每日1次,连续1个月,RT—PCR法检测不同处理条件下小鼠背部皮肤组织中TNF—amR A的表
达水平,免疫组化法检测耳部皮肤组织中p53蛋白表达水平。结果经p-actin内参校正后,RT—PCR示不同剂量
UVB慢性辐射后小鼠皮肤中TNF—amRNA表达水平较对照组升高,但表达水平与UVB辐射强度间无明确的剂
量依赖关系。UVB慢性辐射诱导小鼠皮肤p53蛋白表达,且表达水平与UVB辐射强度间呈剂量依赖关系。EGCG
处理后可下调UVB辐射诱导的TNF—amRNA水平及p53蛋白表达。结论UVB辐射能诱导小鼠皮肤TNF—a
,收稿日期:2006—03—28
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号30371294)
作者简介:骆丹(1958一),女,辽宁鞍山人,医学博士,教授,主任医师,研究方向为光损伤及中药的保护作用。
E—mail:danilu02005@yahoo.corn.cn
万方数据
大明胶囊对高脂血症大鼠心肌M受体各亚型mRNA表达的影响
作者: 邢妍, 岳朋, 李惠, 张勇, 林道红, 董德利, 吕延杰, 杨宝峰, XING Yan, YUE
Peng, LI Hui, ZHANG Yong, LIN Dao-hong, DONG De-li, L(U) Yan-jie, YANG
Bao-feng
作者单位: 哈尔滨医科大学药理教研室,黑龙江省生物医药工程重点实验室-省部共建国家重点实验室
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7.Huang X C;Zhao W H;Wu H Levels of superoxide viability and malonaldehyde in serums of 84 patients
with hyperlipoidemia 2005
8.Pan Z W;Wang Z Y;Du Z M Establishment of a novel arrhythmia modol in rats[期刊论文]-药学学报
2005(07)
9.Liu Y;Xu C Q;Jiao J D M3-R/IKM3-A new target of antiarrhythmic agents[期刊论文]-药学学报 2005(01)
10.Liu Y;Sun H L;Wu H Protective effect of M3 receptor on H2O2-induced apoptosis of rat myocardial
cells in vitro[期刊论文]-药学学报 2004(11)

引证文献(2条)
1.邢妍.王秀丽.曹永刚.孙宏丽.李桂霞.宫凌涛 白藜芦醇对高脂血症大鼠心肌间隙连接蛋白43表达水平的影响[期
刊论文]-华西药学杂志 2010(5)
2.邢妍.岳朋.孙丽华.赵文晓.王莹.张勇.刘鑫.吕延杰.杨宝峰 大明胶囊对高脂血症大鼠心肌间隙连接蛋白43表达
水平的影响[期刊论文]-中国中药杂志 2007(14)


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