全 文 ：雪隆胶囊的质量标准研究
魏立新 ,张宝琛 ,陶燕铎 ,杜玉枝
(中国科学院西北高原生物研究所 ,青海 西宁 810008)
摘 要: 目的 制订雪隆胶囊的质量标准。方法 对雪莲花进行了薄层色谱鉴别 ;用分光光度法测定了 L -羟脯氨酸
的含量。结果 含量测定平均回收率 101. 1% (RSD= 1. 7% ,n= 6)。结论 该方法稳定 ,专属性强 ,可作为该制剂的
质量控制方法。
关键词: 塞隆骨 ;雪莲花 ;薄层色谱鉴别 ; L-羟脯氨酸 ;胶原蛋白
中图分类号: R927. 11 文献标识码: B 文章编号: 0253 2670( 2001) 06 0510 02
Studies on quality control of XUELONG CAPSULE
*
WEI Li-x in, ZHAN G Bao-chen, TAO Yan-duo , DU Yu-zhi
( Bio lo gy Institute o f No r thwest Pla teau, Chinese Academy o f Sciences, Xining Qinghai 810008, China )
Key words: Sailonggu; Saussurea involucrata Kar. et Kir. ; T LC; L -oxoproline; co llag en;
* XUELOGN CAPSULE is a recipe of Chinese medicine used against o steoa rthritis.
雪隆胶囊由雪莲花和塞隆骨组成 ,功能为散寒
除湿 ,补益肝肾 ;主治骨关节炎、寒湿阻络、肝肾不足
症、关节疼痛、肿胀、屈伸不利、遇寒加重和腰膝酸软
等 ,收载于卫生部部颁标准。方中的塞隆骨为新发现
的国家一类动物新药材 ;雪莲花为常用藏药。为控制
质量 ,保证其疗效 ,我们对雪莲花进行了薄层色谱鉴
别 ;并用准确、方便的 Woessner第Ⅰ 法 [1, 2 ]测定了
L-羟脯氨酸的含量。
1 仪器与试药
724微机型分光光度计 (上海第三分析仪器
厂 ) , CSF-1A超声波发生器 ,微量毛细管 ,硅胶 G
板 , IM PACT 400傅立叶变换红外光谱仪 (美 ) ,
BRUK ER AM-500核磁共振仪。
雪莲花对照药材: 采自青海省玉树地区 ,经本所
吴玉虎研究员鉴定为水母雪莲 Saussurea medusa
Maxim。L -羟脯氨酸 (含量> 98. 5% ,购自 Sigma,经
结构确证后作为对照品 )。雪隆胶囊为三河方大药业
有限责任公司生产。其它化学试剂均为分析纯。
2 薄层鉴别
雪花莲鉴别: 取雪隆胶囊内容物 3 g ,加水 20
m L,置沸水浴中加热提取 30 min,滤过 ,滤液置分
液漏斗中 ,加氨试液调 pH值 9以上 ,加氯仿 20 mL
萃取 ,取氯仿液挥干溶剂 ,残渣加氯仿 0. 5 mL使溶
解 ,作为供试品溶液。另取雪莲花对照药材 5 g ,加水
100 mL微沸 1 h ,滤过 ,滤液浓缩至约 10 mL,加氨
试液调 pH值 9以上 ,同法制得对照药材溶液。再按
1-阴性对照 2-供试
品 3-雪莲花对照药
材
图 1 雪隆胶囊中
雪 莲 花 的
TLC图
处方取不含雪莲花的其它药材 ,
按本品工艺及上述供试品制备
方法 ,制成阴性对照溶液。 吸取
上述供试品、阴性对照液和雪莲
花对照药材溶液各 10μL,分别
点于同一硅胶 G薄层板上 ,以环
己烷 -醋酸乙酯 ( 1∶ 1)为展开剂 ,
展开 ,取出晾干 ,喷以碘化铋钾
试液。 供试品色谱中 ,在与对照
药材色谱相应的位置上 ( Rf值约
0. 45) ,显相同的橙红色斑点 ,而
阴性对照无干扰 ,见图 1。
3 含量测定
3. 1 含量测定方法的选择: 药
效学和化学成分研究都表明了
塞隆骨中的胶原蛋白的重要性 ,文献资料和我们的
研究都证明 L -羟脯氨酸是胶原蛋白中的特征性氨
基酸 ,含量约为 13. 4%。 因此选用测定雪隆胶囊中
的 L -羟脯氨酸含量作为含量测定指标。
3. 2 L -羟脯氨酸对照品的结构确证: L -羟脯氨酸
( C5H9NO3 ) ,经红外、13 CNMR、 1HNMR图谱分析并与
Sadt Ler相应图谱比较后 ,确定为反式-4-羟基-L -脯氨
酸 ( t rans-4-h ydroxy-L-proline,简称 L-羟脯氨酸 )。
3. 3 L -羟脯氨酸测定波长的选择:取 L-羟脯氨酸
对照品溶液及样品溶液 ,按标准曲线制定项下的方
法进行吸收波长的扫描 ,提示在波长 561 nm处为
·510· 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2001年第 32卷第 6期
收稿日期: 2000-08-07基金项目:国家“八· 五”科技攻关计划资助项目“抗风湿新药塞隆骨及其制剂的开发研究”
最大吸收 ,故确定最大吸收波长为 561 nm。
3. 4 空白试验: 按处方取不含塞隆骨的其它药材 ,
照本品制备工艺和含量测定项下方法测定阴性样品
中的 L -羟脯氨酸的含量 ,结果为零 ,说明本品中其
它药材及辅料并不干扰 L -羟脯氨酸含量的测定。
3. 5 线性范围的考察:精密称取 L -羟脯氨酸对照
品 50. 0 mg , 2 mL浓盐酸溶解后 ,蒸馏水定容至 500
m L,配制成 0. 1 mg /mL的对照品母液。吸取上述对
照品母液 1. 0, 2. 0, 3. 0, 4. 0, 5. 0 mL分别用蒸馏水
定容至 100 mL,配成系列溶液。分别吸取上述系列
溶液 1. 0 mL(以 1. 0 mL蒸馏水作空白对照 )于试
管中 ,分别各加柠檬酸 -柠檬酸钠缓冲液 ( pH= 6)
1. 0 mL;再各加氯胺 T氧化试剂 1. 0 mL,摇匀 ,室
温氧化 10 min。然后加 3. 15 mo l /L高氯酸 1. 0 mL,
摇匀后室温静止 10 min终止氧化 ;然后再各加对二
甲胺基苯甲醛显色液 1. 0 mL,于 65℃水浴加热显
色 8 min;冷却至室温后照分光光度法 (中华人民共
和国药典 1995年版一部附近 V B) ,在 561 nm处测
定吸光度。以 L-羟脯氨酸浓度 (μg /mL)为横坐标 ,
吸光度 ( A )为纵坐标 ,绘制标准曲线。以浓度和吸光
度进行回归分析 ,得回归方程 Y= 12. 114 5X -
0. 090 3, r= 0. 999 5,L -羟脯氨酸浓度在 0. 5～ 5. 0
μg /mL范围内 ,吸光度呈良好的线形关系。
3. 6 稳定性试验: 精密量取上述对照品溶液 L-羟
脯氨酸 ( 3μg /mL) 1. 0 mL,按 3. 5项下步骤进行操
作 ,间隔 30 min进行吸光度测定 ,连续 5 h ,计算每
次测定的减色率百分数 ,结果表明 1 h减色率
0. 2% , 2 h减色率 2. 8% ,因此 ,显然完毕后在 1 h
内测定稳定可靠。
3. 7 重复性试验: 精密称取同一批样 ( 950802) 5份
各约 30 mg,按含量测定项下的方法测定 L-羟脯氨
酸的含量 ,重复 6次 ,测定结果经数据处理 , RSD=
1. 6% ,说明本测定方法的重复性良好。
3. 8 回收率试验: 采用加样回收法 ,取批号为
980402的雪隆胶囊 20份各 15 mg左右 ,其中的 15
份用来做添加 L-羟脯氨酸对照品的回收试验 ,另外
的 5份用来做不加对照品的随行含量测定。前 15份
样品分成 5组 (每组 3份 ) ,分别添加 L -羟脯氨酸对
照品溶液 ( 100μg /mL) 1. 0, 0. 8, 0. 6, 0. 4, 0. 2 mL
和相对应的蒸馏水 0. 0, 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8 mL。后 5
份样品不加 L -羟脯氨酸 ,也不加蒸馏水。用作回收
率测定的 15份样品加 12 mo l /L的盐酸各 1. 0 mL;
用作随行含量测定的 5份样品加 6 mol /L的盐酸
20 m L后全部的 20份样品在 120℃酸解 2 h。按含
量测定项下的方法测定含量 ,计算回收率。结果平均
回收率为 101. 1% , RSD= 1. 7%。 提示该方法操作
损失小 ,方法可靠。
3. 9 样品含量测定: 精密称取雪隆胶囊内容物约
30 mg于 5 mL安瓿中 ,加 6mol /L盐酸 2. 0 mL,熔
封后 120℃烘箱中酸解 2 h。酸解液用 NaOH调 pH
至 6. 0,定量滤纸过滤 ,滤液用蒸馏水定容至 100
mL。取 1. 0 mL定容液于硬质试管中 ,加柠檬酸缓
冲液 ( pH6) 1. 0 mL,再加氯胺 T氧化液 1. 0 m L,摇
匀 ,室温氧化 10 min。 然后加 3. 15 mo l /L高氯酸
1. 0 mL,摇匀后于室温下静置终止氧化 10 min。 最
后加对二甲胺基苯甲醛显色剂 1. 0 mL后 ,于 65℃
水浴加热显色 8 min。冷却后于 561 nm处测定吸光
度值。从标准曲线上读出供试品溶液中 L -羟脯氨酸
的含量 (μg /m L) ,然后算出胶囊中 L -羟脯氨酸的百
分含量。 结果见表 1。
表 1 雪隆胶囊 L-羟脯氨酸含量 (n= 3)
批号 L -羟脯氨酸含量 (% ) R SD (% )
950801 1. 38 2. 02
950802 1. 36 1. 50
950803 1. 36 2. 21
960901 1. 29 1. 80
960902 1. 32 2. 14
960903 1. 37 2. 01
980401 1. 40 1. 60
980402 1. 38 1. 70
980403 1. 33 1. 02
980404 1. 35 0. 80
4 讨论
4. 1 采用薄层色谱法对雪隆胶囊中雪莲花生物碱
进行鉴别 ,经不同温度、湿度及展开条件的摸索 ,以
及对不同来源的药材平行对照 ,表明该方法条件重
复性好 ,斑点清晰 ,分离完全 ,与对照药材的斑点大
小和位置相同。
4. 2 采用分光光度法对雪隆胶囊中的 L-羟脯氨酸
作含量测定 ,具有方法简便 ,重复性好 ,专属性强的
优点 ,但需注意氧化剂氯胺 T需新鲜配制 [3 ]及氧化
温度的固定 ( 25℃左右 )等。 并对 10批样品进行了
L -羟脯氨酸的含量测定 ,结果各批次含量较稳定。
从而为雪隆胶囊的质量控制提供了有效的方法。
参考文献:
[ 1 ] Woessner J F. The determination of hyd rox yp roline in tis sue
and p rotein s omples containing small proportions of thi s imino
acid [ J] . Arch Bioch em Biophys 1961, 93: 440-447.
[2 ] 刘平译 . 胶原蛋白实验方法学 [M ] . 上海:上海中医学院出版
社 , 1992.
[ 3 ] 关 静 ,叶 萍 ,武继民 .胶原海绵的羟脯氨酸含量测定 [ J ].
氨基酸和生物资源 , 2000, 22( 1): 52-54.
·511·中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2001年第 32卷第 6期