全 文 ：正品龙胆遗传多样性的 RAPD 及 ISSR 分析
曹雅男, 李庆章, 孙　岳, 李　璐, 王大威, 李景鹏Ξ
(东北农业大学生命科学学院, 黑龙江 哈尔滨　150070)
摘　要: 目的　用RA PD 和 ISSR 方法分析了 4 种正品龙胆的亲缘关系及遗传多样性, 为正品龙胆的品种鉴定及栽
培育种提供了分子生物学依据。方法　优化RA PD 及 ISSR 的 PCR 反应体系, 对产物琼脂糖凝胶电泳结果进行数
据统计。结果　从 100 个RA PD 引物和 32 个 ISSR 引物中分别筛选出 10 个RA PD 引物和 4 个 ISSR 引物。通过遗
传距离系数U PGM A 聚类法分析数据, 构建类聚关系树系图。结论　RA PD 及 ISSR 的 PCR 反应体系可以获得理
想的实验结果, 适用于龙胆品种遗传多样性及亲缘关系的分析。
关键词: RA PD; ISSR; 正品龙胆; 遗传多样性
中图分类号: R 282171013　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2005) 01 0100 04
Ana lysis of genetic d iversity in certif ied R ad ix Gen tianae by RAPD and ISSR
CAO Ya2nan, L I Q ing2zhang, SUN Yue, L I L u, W AN G D a2w ei, L I J ing2peng
(Co llege of L ife Science, N o rtheast A gricu ltu re U niversity, H arb in 150070, Ch ina)
Abstract: Objective　To analyze the sib ling rela t ion sh ip and genet ic d iversity of fou r cert if ied R ad ix
Gen tianae (R G) species by RA PD and ISSR m ethods1 It p rovided mo lecu lar b io logica l p roof fo r species
iden t if ica t ion and b reeding of cert if ied R G1 M ethods　PCR react ion system s of RA PD and ISSR w ere
op t im ized, and the agaro se gel electropho resis resu lts w ere analyzed in to sta t ist ic data1 Results　T en
RA PD p rim ers and fou r ISSR p rim ers w ere selected respect ively from 100 RA PD p rim ers and 32 ISSR
p rim ers1 T he sta t ist ic data w ere analyzed to con struct clu ster analysis dendrogram by genet ic d istance
U PGM A m ethod1 Conclusion 　T he PCR react ion system s of th is experim en t gets ideal RA PD and ISSR
resu lts tha t su it to the analysis of cert if ied R G species in genet ic d iversity and sib ling rela t ion sh ip 1
Key words: RA PD; ISSR; cert if ied R ad ix Gen tianae; genet ic d iversity
　　龙胆为龙胆科龙胆属多年生草本植物, 以根入
药。龙胆属全世界约有 400 种, 中国约 247 种。《中
华人民共和国药典》2000 年版[1 ]中确定正品龙胆有
4 种, 龙胆 Gen tiana scabra Bge1、条叶龙胆 G1
m anshu rica K itag1、三花龙胆 G1 trif lora Pall1、坚
龙胆G1 rig escens F ranch1。前 3 种传统上统称“北
龙胆”, 后一种称“南龙胆”, 中药中统称为龙胆, 其性
苦、寒, 主要功能是清热燥湿、泻肝胆火。
　 　 随 机 引 物 扩 增 多 态 ( radom amp lif ied
po lymo rph ic DNA , RA PD ) [2 ] , 创立于 20 世纪 90
年代。是一种以 10 b 短寡核苷酸为引物的 PCR 技
术, 由于RA PD 具有灵敏、快速, 不需要知道被检基
因组序列且对模板质量要求不高等特点, 在药用植
物系统学研究上有独到的优势。它能够通过不同的
引物给出整个基因组的多态性信息, 避免了生长环
境和发育时期不同的影响, 并从DNA 水平上对分
类群比较分析, 确定药用植物种、品种的亲缘关系,
绘制系统发育树状图[3 ]。
　　简单序列重复区间扩增多态 ( in ter2simp le
sequence repeat, ISSR ) 是 Zietk iew icz 等[4 ] 1994 年
创建的, 也是一种以 PCR 技术为基础的分子标记技
术, 其引物是根据基因组内某一重复序列设计出一
系列特异性引物, 包括双核苷酸、三核苷酸和四核苷
酸等微卫星片段。这种技术除具有RA PD 优点外,
比RA PD 技术更具有明确的针对性, 同时由于 PCR
扩增条件中的退火温度较高 (52 ℃左右) , 保证了
PCR 扩增的可重复性。
　　本实验即探讨了这 2 种DNA 分子标记技术用
于龙胆时的 PCR 反应条件, 并通过分析 PCR 反应
的结果, 对其种内及种间的遗传多样性进行了研究。
1　实验材料
　　实验样品由哈尔滨师范大学王臣老师进行了植
·001· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2004205214
基金项目: 黑龙江省教委重大资助项目 (9551Z002)
作者简介: 曹雅男 (1978—) , 女, 现在东北农业大学生命科学学院攻读硕士研究生。3 通讯作者　T el: (0451) 5190645　Fax: (0451) 5303336　E2m ail: L jingpeng@ho tm ail1com
物学鉴定。实验材料取其根, 洗净阴干备用, 样品情
况见表 1。
表 1　样品来源表
Table 1　Or ig in s of samples
序号 品种 拉丁学名 来　源
D 1～D 20 条叶龙胆 G1 m anshu rica 黑龙江省泰康 (采集)　
S1～ S10 三花龙胆 G1 trif lora 黑龙江省牡丹江 (采集)
C1～C10 龙胆　　 G1 scarbra 黑龙江省牡丹江 (采集)
N 1～N 3 坚龙胆　 G1 rig eslens 云南 (采购)　　　　　
2　方法
211 　仪器及试剂: 低温高速离心机 (Beckm an
U SA ) , U lt ro spec 1000 分光光度计 (Am ersham
Pharm acia B io tech Sw eden ) , PCR 仪 (B iom etra
Germ any ) , 凝胶成像仪 (UV P U SA )。 T aq 酶、
RN ase A、M arker DL 2000 购自宝生物工程有限公
司 (大连) , BSA、SD S (Sigm a 美国) , RA PD 及 ISSR
引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
212　总DNA 的提取: 采用 SD S 法[5 ]略有改进。称
取 012 g 干燥药材, 加入液氮迅速研磨至粉末, 快速
加入有 900 ΛL 提取缓冲液 (N aC l 500 mmo löL ,
ED TA 50 mmo löL , T ris·HC l 100 mmo löL , Β2巯
基乙醇 10 mmo löL , SD S 1% ) 的 Ep 管中, 55 ℃水
浴处理 20 m in, 间隔摇动 2～ 3 次; 加入 5 mo löL 的
KA C 160 ΛL 摇匀后冰浴 30 m in, 4 ℃、12 000×g
离心 15 m in; 取上清液加入等体积的氯仿2异戊醇
(24∶1)反复摇匀, 4 ℃、8 000×g 离心 10 m in; 取上
清液加入 2ö3 体积- 20 ℃预冷的异丙醇, 摇匀后放
置 30 m in、4 ℃、10 000×g 离心 10 m in, 弃去上清
液, 所得沉淀用 70% 乙醇洗 2 次; 干燥 15 m in, 溶于
50 ΛL T E 缓冲液 ( T ris 10 mmo löL , ED TA 1
mmo löL , pH 810) ; 加 2 ΛL 的 RN ase A (10 ΛgöΛL ) 37 ℃消化 1 h。018% 的琼脂糖凝胶电泳检测其
降解情况后, 紫外分光光度计测定吸光度 (A ) , 根据
A 260和A 280, 计算其浓度及纯度。
213　RA PD 分析: 反应体系总体积 25 ΛL , 其中
10×Buffer 215 ΛL (M g2+ 15 mmo löL ) , DNA 模板
5 ng, dN T P s 1 ΛL (10 mmo löL ) , 引物 1 ΛL (10
mmo löL ) ,BSA 1 ΛL (25 m gömL ) , 1125 U 的 T aq
酶, 其余以无离子水补足。扩增程序为 94 ℃预变性
5 m in, 94 ℃、30 s, 37 ℃、30 s, 72 ℃、60 s 45 个循
环, 72 ℃延伸 7 m in。产物在 4 V öcm 电压下用
115% 的琼脂糖凝胶电泳, 紫外检测拍照。
214　 ISSR 分析: 反应体系总体积 25 ΛL , 其中 10×
Buffer 215 ΛL (M g2+ 15 mmo löL ) , DNA 模板 2
ng, dN T P s 1 ΛL ( 10 mmo löL ) , 引物 1 ΛL ( 10
mmo löL ) ,BSA 1 ΛL (25 m gömL ) , 1 U 的 T aq 酶,
其余以无离子水补足。扩增程序为 94 ℃预变性 5
m in, 94 ℃、30 s, 52 ℃、30 s, 72 ℃、90 s 45 个循环,
72 ℃延伸 7 m in。电泳及检测条件同RA PD。
215　数据统计分析: 根据 PCR 产物结果记录条带,
按照N ei 氏片段共享公式[6 ] , 计算不同基因型片段
遗传相似系数 (F ) 和遗传距离 (D ) 进行U PGM A 法
类聚分析。
　　F = 2N x y ö(N x + N y ) ,D = 1- F
式中N x y表示 x、y 2 个个体共有的 RA PD 或 ISSR 标记数,
N x 和N y 分别为 x 和 y 个体所具有的标记数
3　结果与分析
311　RA PD 扩增体系的优化
31111　DNA 模板的浓度: 选择 9 个不同浓度的基
因组DNA 作为模板进行扩增 (图 1)。1～ 9 号中模
板 (条叶龙胆样品D 218 模板稀释为不同浓度) 在体
系中用量分别为 200、100、50、40、20、10、5、1、015
ng。其中 1～ 6 号由于模板浓度较大, 条带不清, 不利
于进一步的分析; 8、9 号条带也不清且一些弱带不
可见; 而 7 号 (5 ng)条带较清晰, 一些弱带也清晰可
见, 最终选择RA PD 总体系中模板用量为 5 ng。
M 2M arker DL 2000
图 1　不同浓度的D NA 模板的 RAPD 扩增结果
F ig11　RAPD ampl if ied products of d ifferen t
concen tration of D NA templates
31112　DNA 模板的纯度: 选取 8 个不同纯度的
DNA 模板 (分别为条叶龙胆样品D 221、22、23、16、
17、11、18、1 其纯度见表 2, 其中D 221、22、23 因质量
较低未用于正式实验) , 进行RA PD 扩增 (图 2)。由
电泳图可见当DNA 纯度在 112～ 210 时都可以得
到理想的结果, 可见在这个区间内DNA 的纯度对
反应的影响不大, 但为保证模板的质量, 实验样品的
纯度选在 116～ 210。
31113　其他条件的优化: 实验除了优化DNA 模板
的浓度和纯度条件外, 还对反应体系中 dN T P s、引
物及酶的浓度都进行了优化, 并在体系中加入了
BSA ( 1ΛgöΛL ) [7 ] , BSA 可以阻止多酚化合物及蛋
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　　　　　　　表 2　模板D NA 的纯度
Table 2　Pur ity of D NA templates
编号 A 260 A 280 A 260öA 280
1 01537 01441 11218
2 01723 01542 11334
3 01768 01551 11394
4 01730 01480 11521
5 01660 01410 11610
6 11000 01580 11724
7 01792 01441 11796
8 01814 01391 21082
M 2M arker DL 2000
图 2　不同纯度的D NA 模板的 RAPD 扩增结果
F ig12　RAPD ampl if ied products of d ifferen t
pur ity of D NA templates
白质与 T aq 酶结合, 从而提高酶的活性。反应程序
在W illiam s 的程序上略有改进, 特别是将循环中各
步的时间改为 94 ℃、30 s, 37 ℃、30 s, 72 ℃、1 m in,
使反应在 215 h 内完成, 缩短了反应时间。
312　 ISSR 扩增体系的优化: 选择5个不同浓度 (样
图 3 　 不 同 浓 度
D NA 模 板
的 ISSR 扩
增结果
F ig 13　ISSR-ampl i
f ied products of
d ifferen t conce-
n tration of D NA
templates
品D 218 模板稀释为不同浓度)
的基因组DNA 作为模板进行
扩增 (图 3)。1～ 5 号模板用量分
别为 10、5、2、1、015 ng。其中 1、
2、4、5 号由于模板浓度不合适,
条带不清或多态性不强, 不利于
进一步的分析, 而 3 号 (2 ng) 条
带较清晰, 多态性强, 最终选择
ISSR 总体系中模板用量为 2
ng。反应体系中 dN T P s、引物及
酶的浓度也进行了优化, 反应程
序的优化是在文献[8～ 10 ]的基础
上加以改进。
313　遗传多样性的分析结果:
从 100 个RA PD 引物筛选出 10
个用于遗传多样性分析, 共检测出 120 个位点, 其中
116 个 (96167% ) 显多态性, 图 4 列举 RA PD 引物
SBSE220 的电泳结果。
　　从 32 个 ISSR 引物中筛选出 4 个引物用于遗
传多样性分析, 共检测出 45 个位点, 其中 44
(97178% )显多态性, 图 5 列举 ISSR 引物 5′(A C) 8
T 3′的电泳结果。
D 1～ 202条叶龙胆　N 1～ 32坚龙胆
S1～ 102三花龙胆　C1～ 102龙胆
D 1—202G1 m anshu rica　N 1—32G1 rig eslens
S1—102G1 trif lora　C1—102G1 scarbra
图 4　RAPD 引物 SBSE-20 扩增结果电泳图
F ig14　Electrophoresis products of RAPD
pr imer SBSE-20
D 1～ 202条叶龙胆　N 1～ 32坚龙胆
S1～ 102三花龙胆　C1～ 102龙胆
D 1—202G1 m anshu rica　N 1—32G1 rig eslens
S1—102G1 trif lora　C1—102G1 scarbra
图 5　ISSR 引物 5′(AC) 8T3′扩增结果电泳图
F ig15　Electrophoresis products of ISSR
pr imer 5′(AC) 8 T3′
　　对扩增产生的条带进行 0、1 统计 (有带记为 1,
没有带记为 0) [11 ] , 利用M V SP312 软件分别得到
RA PD 和 ISSR 的类聚分析树系图 (图 6、7, 坐标显
示为N ei 氏相似系数) , 从图 6、7 都可见坚龙胆与三
花龙胆、龙胆、条叶龙胆的遗传距离较远, 为传统上
的“北龙胆”和“南龙胆”分类提供了分子生物学依
据。而三花龙胆、龙胆、条叶龙胆 3 种中三花龙胆和
龙胆亲缘关系较近。而在 4 个种群的内部也可见丰
富的遗传多样性, 从遗传学的角度来看丰富的遗传
多样性意味着比较高的适应能力, 蕴涵着比较大的
进化潜能以及比较丰富的育种和遗传改良能力, 这
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图 6　基于 RAPD 的 UPGM A 类聚分析树系图
F ig16　D endrogram of UPGM A cluster
analysis based on RAPD
图 7　基于 ISSR 的 UPGM A 类聚分析树系图
F ig17　D rendrogram of UPGM A cluster
analysis based on ISSR
为今后的栽培育种提供了依据。
4　结论
411　RA PD 和 ISSR 优化后的 PCR 反应体系和反
应程序所得到的扩增结果条带清晰, 重复性好, 适用
于药用植物龙胆。
412　对RA PD 和 ISSR 指纹图谱进行量化分析后,
发现 ISSR 2PCR 高于相对应的RA PD 2PCR 扩增产
生的多态位点的百分比, 这说明 ISSR 2PCR 更能反
映遗传的多样性。
4 13　对4个正品龙胆品种4 3个个体的RA PD 及
ISSR 的 PCR 电泳结果进行分析所得的类聚分析树
图中可见坚龙胆与三花龙胆、龙胆、条叶龙胆的遗传
距离较远。而三花龙胆、龙胆、条叶龙胆 3 种中三花
龙胆和龙胆亲缘关系较近。而在 4 个种群的内部也
可见丰富的遗传多样性, 以上实验结果为正品龙胆
的品种鉴定及栽培育种提供了分子生物学依据。
References:
[ 1 ]　Ch P (中国药典) [S ]1 V o l É 1 20001
[ 2 ]　W illiam s J G K, Kubrlik A R , L ivak J , et a l1 DNA
po lymo rph ism amp lified by arb itrary p rim er are usefu l as
genetic m arkers [J ]1 N uc A ci R es, 1990, 18 ( 20) : 65312
65351
[ 3 ]　Shu Y Q , Bai S M , Chen Y H 1 T he A pp lication of random
amp lified po lymo rph ic DNA ( RA PD ) in m edicinal p lan ts
[J ]1 Ch in T rad it H erb D rug s (中草药) , 1999, 30 (2) : 1472
1511
[ 4 ]　Zietk iew icz E, Rafalsk i A , L abuda D , et a l1 Genom ic F in2
gerp rin ting by simp le sequence repeat ( SSR ) 2ancho red
po lym erase chain reaction amp lification [J ]1 Genom ic, 1994,
20: 17621831
[ 5 ]　W ang G L , Fang H J1 T heory and T echn ique in Gene
E ng ineering (植物基因工程原理与技术) [M ]1 1st ed1
Beijing: Science P ress, 19981
[ 6 ]　N ei M , L i W H 1 M athem atical modal fo r studying genetic
variation in term s of restriction endonnu leasea [J ]1 P roc
N a tl A cad S ci U SA , 1979, 76 (10) : 5269252731
[ 7 ]　B ian C M , L i J M , J in Z X, et a l1 Effect of BSA of random
amp lified po lymo rph ic DNA ( RA PD ) in p lan ts [J ]1
H ered itas (遗传) , 2002, 24 (3) : 27922821
[ 8 ]　Ratnaparkhe M B, San tra D K, T ullu A , et a l1 Inheritance
of in ter2simp le sequence repeat po lymo rpho rism s and linkage
w ith a fusarium w ilt resistance gene in ch ickpea [J ]1 T heor
A pp l Genet, 1998, 96: 34823531
[ 9 ]　H uang J C, Sun M 1 Genetic diversity and relationsh ip s of
sw eetpo tato and its w ild relatives in Ip om oea series Batatas
(Convo lvu laceae) as revealed by in ter2simp le sequence repeat
( ISSR ) and restriction analysis of cho rop last DNA [J ]1
T heor A pp l Genet, 2000, 100: 1050210601
[ 10 ]　J iang S Y, Chen Q F, Fang X J1 RA PD and ISSR analysis
betw een pho toperriod sensit ive gen ic m ale sterile rice
nongken 58s and its o rig inal variety nongken 58 [J ]1 J A g ric
B iotehnol (农业生物技术学报) , 2000, 8 (1) : 632661
[ 11 ]　Xu K, ZhengM , Cao Y, et a l1 RA PD on natu ral popu lations
in Op h iop og on jap on icus in Sichuan P rovince [J ]1 Ch in
T rad it H erb D rug s (中草药) , 2002, 33 (7) : 64826521
《中草药》杂志被收录为中国科技论文统计源期刊 (中国科技核心期刊)
　　中国科学技术信息研究所经过多项学术指标综合评定及同行多位专家评议推荐, 我刊被收录为国家科
技部“中国科技论文统计源期刊 (中国科技核心期刊) , 并在 2004 年 3 月颁发证书。
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