全 文 ：中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月·907·
药材与资源
丹参不定根组织培养的研究(II)
碳源、氮源和磷源对丹参不定根培养的影响
郭肖红，高文远+，李克峰
(天津大学药物科学与技术学院，天津300072)
摘 要：目的研究碳源、氮源和磷源对丹参Salviamiltiorrhiza不定根生长及其有效成分丹参酮Ⅱn和原儿茶醛
量的影响。方法利用组织培养技术结合HPLC分析手段，通过改变培养基碳源种类和浓度、氮源和磷源浓度，研
究其对丹参不定根生长和丹参酮Ⅱn、原儿茶醛量的影响。结果碳源、氮源、磷源对于不定根培养是必需的。以蔗
糖为碳源，添加30g／L蔗糖，培养20d，不定根增殖倍数最高，60g／L蔗糖最适合丹参酮1In合成，低质量浓度蔗糖
更利于原儿茶醛合成。间歇添加蔗糖至培养25d，不定根增殖率是对照的2．3倍，丹参酮Ⅱn量是对照的2．4倍。培
养基NH。+和NO。一总浓度保持60mmol／L，NH。+／NO。一为1：4、1：4、1：1时分别得到最大的不定根增殖倍数、
丹参酮Ⅱn和原儿茶醛的量。改变培养基KH。PO。浓度时，丹参不定根生长均比对照组旺盛，但高浓度KH。PO。抑
制了丹参酮Ⅱ一合成。结论本实验确定了丹参不定根悬浮培养的最佳碳源种类和浓度、氮源比例和磷源浓度，表
明不同碳源、氮源和磷源对丹参不定根生长和次生代谢物合成有显著影响。
关键词：丹参；丹参酮Ⅱn；原儿茶醛；碳源；氮源；磷源
中图分类号：R282．13 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)06—0907—05
TissuecultureofSalviamiltiorrhizaadventitiousro t (Ⅱ)
Effectsofcarbon，nitrogen，andphosphatesourcesonculture
ofSalviamiltiorrhizaadventitiousro t
GUOXiao—hong，GAOWen—yuan，LIKe—feng
(CollegeofPharmaceuticalsandBiotechnology，TianjinUniversity，Tianjin300072，China)
Abstract：ObjectiveTostudytheffectsofcarbon，nitrogen，andphosphatesourcesonthegrowth
ofSalviamiltiorrhizaadventitiousrootandthecontentsof anshinoneⅡAandprotocatechuicaldehyde．
MethodsTheadventitiousro twereobtainedthroughtissueculturebymanipulationofcarbon，nitro—
gen，andphosphatesourcesandthecontentsof anshinonelIAandprotocatechuicaldehydeweredeter—
minedbyHPLC．ResultsCarbon，nitrogen，andphosphatesourcesw renecessaryforthecultureofS．
miltiorrhizaadventitiousro t ．Thehighesttimesofrootmultiplicationwereachievedatsucrose1evelof
30g／Lafter20dculture，60g／Lsucroseandlowlevelsucrosewerefavorableforbiosynthesesoftanshi—
noneⅡAandprotocatechuicaldehyde，respectively．Thehigh strootieldandtanshinoneⅡAcontento
day25wereobtainedbyintermittentsugarddingduringcultivation，andthepro uctionofadventitious
rootsandtanshinoneⅡAwere2．3一and2．4一foldcomparedwiththoseofcontrol，respectively．Themaxi—
mumrootgrowthrate，contentsoftan hinoneⅡAandprotocatechuicaldehydewereachievedwhileNH4+一
N03--was1：4，1：4，and1：1，respectivelywhenconcentrationoftotalnitrogensourcewaskeptat60
mmol／L．Tocomparewiththecontrolgroup，changingofKH2P04concentrationcouldfavorforthead—
ventiliousr otgrowth，buthighKH2P04concentrationinh bitedtanshinoneⅡAbiosynthesis．Conclusion
Theresultsshowthatvariouscarbon，nitrogen，andphosphatesourceshavethesignificanteffectsonad—
ventitiousr otcultureofS．miltiorrhiza．Thebestcarbonsourceanditsconcentration，nitrogenandphos—
phatesourcesforthegrowthofS．miltiorrhizaadventitiousrootandthesynthesisof econdarymetabolite
收稿日期：2006—10—10
基金项目：国家863项目(2003AA222040)；
*通讯作者高文远Tel：(022)87401895
国家中医药管理局中医药科学技术研究专项(04—05ZPl0)
E—mail：pharmgao@tju．edu．ca
万方数据
·908· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
areconfirmed．
Keywords：SalviamiltiorrhizaBunge；tanshinone
nitrogensources；phosphatesources
丹参SalviamiltiorrhizaBunge以根和根茎人
药，主要含脂溶性二萜类化合物和水溶性酚酸类化
合物，是治疗心血管疾病的重要中药。国内外学者先
后开展了丹参的组织培养研究，对丹参细胞和毛状
根培养次生代谢产物的研究有一些报道[1~3]，但是
关于不定根培养和合成次生代谢产物的报道比较
少[4]。本实验主要研究了碳源、氮源和磷源对丹参不
定根生长及次生代谢产物合成的影响。
1材料与方法
1．1材料：为在附加IBA2mg／L和KT0．2mg／L
的基本MS液体培养基中继代多次的丹参不定根。
1．2碳源对丹参不定根培养的影响
1．2．1碳源种类对丹参不定根培养的影响：将传代
多次的丹参不定根约1g接种到250mL三角瓶中
培养20d。三角瓶内含50mL2mg／LIBA和0．2
mg／LKT的MS培养基，培养基分别添加3％蔗
糖、3％葡萄糖、3％果糖、1．5％葡萄糖+1．5％果糖、
1．5％果糖+1．5％蔗糖、1．5％葡萄糖+1．5％蔗糖。
培养基pH值灭菌前调到6．0，摇床转速110r／min，
每个处理3～4瓶。
1．2．2蔗糖质量浓度对丹参不定根培养的影响：将
传代多次的丹参不定根约1g接种到250mL内含
50mL2mg／LIBA和0．2mg／LKT的MS培养基
的三角瓶中，培养基添加不同质量浓度的蔗糖(20、
30、50、60、80g／L)。每隔5d测定不定根产量和有
效成分的量，共30d。培养基pH值和摇床转速同
上，每个处理3～4瓶。
1．2．3蔗糖添加对丹参不定根培养的影响：将丹参
不定根约1g接种到250mL三角瓶中，分别在第
6、11、16天往三角瓶中加入30、30、60g／L蔗糖，第
25天收获不定根。培养基pH值和摇床转速同上，每
个处理3～4瓶。
1．3氮源对丹参不定根培养的影响：丹参不定根接
种到250mL三角瓶中继代培养20d，三角瓶内盛
有50mL添加2mg／LIBA和0．2mg／LKT，3％
蔗糖的MS培养基，同时用(NH。)2SO。代替原MS
培养基中的NH。NO。，在保持总氮素60mmol／L不
变条件下，改变NH。+／NO。一的比值。培养基pH值
和摇床转速同上，每个处理3～4瓶。
1．4磷源对丹参不定根培养的影响：丹参不定根接
种到250mL三角瓶中继代培养20d，三角瓶内盛
有50mL附加2mg／LIBA和0．2mg／LKT，3％
蔗糖的MS培养基，其中KH。PO。浓度分别为基本
MS培养基的1／4、1／2、1、2、4倍，培养基pH值和摇
床转速同上，每个处理3～4瓶。
1．5有效成分提取和测定方法：收获不定根后，分
别称取每瓶不定根鲜质量，并于105℃恒温下烘30
min，然后于60℃恒温烘干7r～8h至恒重，称取不
定根干质量，并计算其增长率[增长率一(生长量一
接种量)／接种量]。每个处理的不定根合并后用甲醇
超声提取分离测定丹参酮IIA的量，水提醇沉法提
取分离测定原儿茶醛的量。两者的分析均采用
HPLC法，参照文献进行测定口]，分析体系分别为甲
醇一水(8：2)和甲醇一0．5％HAc(15：85)进行等速
洗脱，体积流量1mL／min。丹参酮ⅡA和原儿茶醛
的对照品由中国药品生物制品检定所提供。
2 结果
2．1碳源对丹参不定根培养的影响
2．1．1碳源种类对丹参不定根培养的影响：表1是
不同碳源对丹参不定根生长及其有效成分丹参酮
ⅡA和原儿茶醛的影响。3％蔗糖为碳源时明显有利
于丹参不定根增殖，1．5％葡萄糖+1．5％蔗糖为碳
源时得到最高量的丹参酮ⅡA，而以3％果糖为碳源
时，原儿茶醛量最高。综合考虑经济成本和不定根生
长，选用蔗糖作为碳源。
2．1．2蔗糖质量浓度对丹参不定根培养的影响：
(1)蔗糖质量浓度对丹参不定根生长的影响：不同质
量浓度蔗糖对丹参不定根生长的影响见图1。可以
看出，随着培养时间增加干质量持续增加，第20天
达到最大值，然后又开始下降。其中以添加30g／L
蔗糖干质量增长率最高，达到5．07倍，20d后由于
蔗糖被消耗尽，不定根干质量迅速下降。蔗糖为20
g／L时，由于蔗糖在15d左右差不多被消耗完，所
以干质量增加倍数少。蔗糖为60g／L的培养基中丹
参不定根增长率要小于30、50g／L。同时可以看到
蔗糖为80g／L时，干质量增加也较显著。20d后由
于蔗糖未被消耗光，干质量下降并不十分显著。因此
丹参不定根培养以添加30g／L蔗糖，培养20d后
收获能得到最大的干质量。(2)蔗糖质量浓度对丹参
酮ⅡA和原儿茶醛合成的影响：图2为不同质量浓
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
度蔗糖对丹参不定根中丹参酮ⅡA和原儿茶醛合成
的影响。较高质量浓度的蔗糖有利于丹参酮IIA的
合成，当蔗糖为20、30g／L时，丹参酮ⅡA量先上升
上升到最高值，分别为12．73和24．4099／g；蔗糖为
50g／L时，丹参酮ⅡA的量先上升后下降，20d达到
低谷，然后迅速上升到最大值；蔗糖为60g／L时，丹
后下降，在20d仅为5．14和6．38／．tg／g，然后迅速参酮ⅡA的量第20天达到最大值(42．33弘g／g)。
表1 不同碳源对丹参不定根培养的影响
Table1 EffectsofvariouscarbonsourcesoncultureofS．miltiorrhizaadventitiousroots
6
逛4
＼
褂
业
磬2
L—
L—
L—
L—
L—
t／d
图2 蔗糖质量浓度对丹参次生代谢物合成的影响
Fig．2Effectsofsucroseconcentrationsonsecondary
metabolitebiosynthesisofS．miltiorrhiza
蔗糖质量浓度对原儿茶醛的量并没有显著
的影响，但总的来说，低质量浓度的蔗糖更利于原儿
茶醛合成。除蔗糖为30g／L外，原儿茶醛量第5天
达到较高值，这可能与培养液果糖和葡萄糖量迅速
升高有关，接着原儿茶醛的量迅速下降，然后又开始
持续上升。并且添加20g／L蔗糖时，原儿茶醛的量
达到所有处理的最大值265．86弘g／g。而添加30g／
L蔗糖时，原儿茶醛的量先下降然后迅速上升，此后
几乎没有多大变化。
2．1．3蔗糖添加对丹参不定根培养的影响：由实验
可知，低质量浓度蔗糖有利于不定根生长，而高质量
浓度蔗糖(60g／L)更利于丹参酮ⅡA形成。为了进
一步改善培养条件，提高不定根生物量和丹参酮ⅡA
的量，本实验采用蔗糖添加，即在第6、1l天分别往
培养基中加入30g／L蔗糖以提高不定根生物量，第
16天加入60g／L蔗糖以提高丹参酮ⅡA的量。由图
3可以看出，未添加蔗糖即6d前，两组不定根生物
量几乎相同，随着蔗糖的添加，添加组不定根生物量
明显高于对照组，第25天达到最大值，增殖倍数为
8．44，是对照组的2．3倍。至于丹参酮ⅡA(图4)，对
照组从第6天到第25天量增加不明显，由16．58
t-g／g增加到26．92gg／g，而添加组丹参酮ⅡA的量
增加很快，由第6天的15．38肛g屈增加到第25天
的55．92pg／g，是对照组的2．4倍。这表明通过间歇
往培养基中添加蔗糖对于提高不定根生物量和丹参
酮ⅡA的量是有效的。
迎
＼
槲
型
磐
t／d
图3蔗糖添加对丹参不定根生长的影响
Fig．3Effectsofsucroseaddingon rowth
ofS．miltiorrhizaadventitiousro ts
2．2氮源对丹参不定根生长的影响：见表2，随着
NH。+／NO。一比值增加，培养基pH值不断降低，
r
r
r
r
r
g
g
g
g
g加∞的∞∞}{{}一
万方数据
·910· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第6期2007年6月
NO。一为唯一氮源时pH为5．94，NH。+为唯一氮源
时pH为3．54。NH。+／NO。由0增加到1：4，丹参
不定根增殖倍数增加至最大值；继续增大NH。+／
NO。比值，不定根增殖倍数下降，当全部为NH。+
时不定根几乎停止生长，趋于死亡。氮源对次生代谢
，
lbD
●
∞
j
鼍
』
一
屠
热
=k
60
40
20
0
t／d
图4蔗糖添加对丹参酮Ⅱ。量的影响
Fig．4Effectsofsucroseaddingontanshinone
物合成的影响呈折线变化，低比例的NH。+／NO。一
时丹参不定根颜色较红，丹参酮ⅡA的量较高，培养
基颜色也较红，比例为1：4时丹参酮ⅡA的量最
高。NH。+／NO。一为1：1时原儿茶醛的量最高，其次
是1：4。由上可得出NH。+／NO。一为1：4培养效果
较好。
2．3磷源对丹参不定根生长的影响：表3显示降低
或者提高KH。PO。浓度均能提高丹参不定根生长速
率，高浓度磷源抑制了丹参酮ⅡA合成，当KH。PO；
浓度为基本培养基的2倍时，丹参酮iiA的量仅为
其0．24倍，KH：PO。浓度为基本培养基的一半时，
丹参酮ⅡA的量为其1．57倍。而磷源对原儿茶醛合
成没有显著性影响，各种处理下其量变化不大。
ⅡAcontentinS·miltiorrhiza 3讨论
表2氮源对丹参不定根培养的影响
Table2 EffectsofnitrogensourcesoncultureofS．miltiorrhizaadventitiousro t
表3磷源对丹参不定根培养的影响
Table3 EffectsofphosphatesourcesoncultureofS．miltiorrhizaadventitiousro t
3．1碳源：不同植物培养过程中所需的碳源种类和
浓度不同，一般是添加蔗糖、葡萄糖或果糖，其中以
蔗糖最常用。糖类在培养基中除了作为碳源和能源
外，还具有维持培养基一定渗透压的作用。本实验研
究发现添加葡萄糖或果糖并不能提高不定根的产
量，但是葡萄糖结合蔗糖或以果糖作为唯一碳源均
能提高丹参酮ⅡA和原儿茶醛的量。综合考虑经济
成本、根产量和次生代谢物的量，宜选用蔗糖为碳
源。蔗糖质量浓度较高时丹参不定根生长受到了抑
制，可能与高糖带来的培养基高渗透压有关，这与三
七细胞培养结果一致[6]，而较高质量浓度的蔗糖得
到了高质量的丹参酮ⅡA，说明适当提高渗透压有利
于丹参酮ⅡA合成，至于原儿茶醛，低浓度蔗糖更利
于其合成，其影响机制有待进一步探讨。为了进一步
提高培养效果，采取间断添加蔗糖，两阶段培养丹参
不定根，即先添加低质量浓度蔗糖提高不定根生物
量，然后添加高质量浓度蔗糖提高丹参酮ⅡA的量，
结果表明此方法是可行的。这为两阶段培养丹参不
定根奠定了一定的实验基础。
3．2 氮源：培养基中的硝态氮和铵态氮对丹参不定
根生长和次生代谢物合成都有一定的作用。以
NO。为唯一氮源时，不定根生长较旺盛，但是次生
代谢合成受到抑制，适当增加NH。+使其NH。+／
NO。一为1：4，丹参不定根增殖倍数增加，达到最大
值，而且次生代谢物的量明显增加。继续增大
NH。+／NO。一比值，不定根增殖倍数下降，全部为
NH。+时不定根几乎停止生长，趋于死亡，其原因是
培养基中NH。+的量太高，培养基酸化，细胞毒性增
万方数据
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加，从而抑制了根生长和次生代谢物合成，而NO。一
可以协同作用调节离子吸收，消除NH。+对细胞的
毒害作用[7]。氮源对次生代谢物合成的影响规律不
如其对不定根生长影响明显，呈折线变化。低比例的
NH。+／NO。一时丹参不定根颜色较红，丹参酮11A的
量较高，培养基颜色也较红，比例为1／4时丹参酮
ⅡA的量最高。NH。+／NO。一为1：1时原儿茶醛的
量最高，其次是1：4，因此NH。+／NO。为1：4培
养效果较好。
3．3磷源：磷是植物组织培养重要的营养因素。但
是国内外学者对磷对细胞生长的作用看法不一。
Amino等认为MS培养基中的磷(1．25mmol／L)抑
制了长春花细胞生长[8]。Katsuhiro等报道指出培养
基中磷源是长春花细胞生长的必需元素，磷源饥饿
时细胞几乎停止生长，磷源浓度加倍对细胞生长没
有太多的影响，再加大磷源浓度至4倍、8倍，细胞
吸收过量的磷以致生长严重受阻[9]。本实验结果表
明加大或减少磷源浓度均能促进不定根生长。磷源
对次生代谢物的生物合成也起非常重要的作用，不
同植物的次生代谢合成所需磷浓度不同。丹参不定
根培养中过量的磷源抑制了丹参酮ⅡA合成，可能
是由于过量的磷加速不定根内源有机酸的降解口0|，
而一些有机酸比如甲羟戊酸、法尼基二磷酸等是丹
参酮ⅡA合成途径中必需的，原儿茶醛不同的合成
机制使其受磷源浓度变化影响不大。
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不同产地何首乌的ITS序列研究
张宏意1，石祥刚2
(1．广东药学院中药学院，广东广州 510240；2．中山大学生命科学学院，广东广州510275)
摘 要：目的 研究不同产地何首乌的ITS片段遗传差异性，分析该片段在何首乌道地性的DNA分子鉴别和野生
资源品种的鉴定及种质资源研究中的意义。方法从来自不同原产地的何首乌中提取总DNA，以核基因组ITS通
用引物为引物进行扩增，扩增产物经纯化后，用PCR产物直接测序法进行测序。结果各样品rDNA的ITS及
5．8SrDNA完全序列，18S和26SrDNA部分序列，共约648bp，其中ITSl长度为195bp，5．8S长度为164bp，
ITS2长度为189bp。序列间共有17个变异位点。结论ITS序列可对何首乌的道地性做出鉴别，对野生资源品种
的鉴定具有较好的分辨性。
关键词：何首乌；道地性；ITS序列
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)06—0911—04
AnalysisofrDNAITSsequencesinroottuberofPolygonummultiflorum
fromvarioushabitats
ZHANGHong—yil，SHIXiang—gan92
(1．SchoolofChineseMateriaMedica，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510240，China；
收稿日期：2006—08—12
万方数据
丹参不定根组织培养的研究(Ⅱ)碳源、氮源和磷源对丹参不
定根培养的影响
作者： 郭肖红， 高文远， 李克峰， GUO Xiao-hong， GAO Wen-yuan， LI Ke-feng
作者单位： 天津大学药物科学与技术学院,天津,300072
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(6)
被引用次数： 9次
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