全 文 ：·430- 中革菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第3期2006年3月
山茱萸不同栽培品种的RAPD分析
陈随清“2，王利丽1，冀春茹1
(1．河南中医学院．河南郑州450008；2．郑州大学基础医学院博士后流动站，河南郑州450052)
摘要：目的分析山茱萸不同栽培品种之间的遗传美系，为山茱萸品种选育提供依据。方法采用改良后的
CTAB法从山莱萸叶片中提取总DNA，进行RAPD分析；采用SPSSIO．0软件计算DICE遗传相似性系数，Be—
tween—groupslinkage方法聚类，构建亲缘关系树系图。结果共筛选出22个lo个碱基随机引物用于PCR扩增，
12个样品获得了133条带，其中多态性条带75条，占56．39％。聚类分析结果表明：纺锤形果型自成一类，短梨形果
型与短圆柱形果型聚为一类，其余几种较长大的果型聚为一类，反映了栽培过程中人为选择的后果。结论实验结
果与山茱萸栽培品种的生物特性和区域分布基本一致；RAPD分析可作为对山茱萸品种选育的辅助手段。
关键词：山茱萸；栽培品种}RAPD
中圈分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)03—0430—03
RAPDAnalysisondifferentcul ivarsofCornusofficinalis
CHENSui—qing‘～，WANGLi—lil，jIChun—rul
(1．HenanCollegeofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450008，China；2．PostdoetorProgramStati n，
SchoolofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China)
Abstract：ObjectiveToanalyzethgeneticrelationshipamongthedifferentcul ivarsofCornusoffic—
inalisandprovidesomefoundationforhereditybreeding．MethodsAmodifiedm thodofextractingtotal
DNAfromtheleavesofC．officinalisw selectedbyimprovingthetraditionalmethodCTAB，theotal
DNAWaSanalyzedbyRAPD；thegen ticsimilaritycorrelationwascalculatedbySPSS10．0DICE
method，clusteranalyseswerecarriedoutusingBetween—groupslinkagemethod，andthegeneticdendro—
gramwasestablished．ResultsRandomprimers(2210-bD)wereselectedtobeusedforthePCR，atotal
of133bandswereamplifiedby12samples，amongwhich75bandswerepolymorphic，accountingfor
56．39％．Theclusteranalysisindicatedthat：spindleformitselfwasonegroup，shortpea —shapeandshort
eylinderieformclusteredtogether，theestlongertypesclusteredtogether，whichreflectedthresultoffir
tificialse ectioninthecourseofcultivating．ConclusionTheresultkeepsaccordancewiththebiologic
characterandterritorialdistributionofC． fficinaliscu tivars；RAPDanalysisiSanassistantmeanfor
seedbreedingofC．officinalis．
Keywords：ComusofficinalisSieb．etZucc．；cuhivars；RAPD
山茱萸Comusn所cinalisSieb．etZucc．为我
国常用中药材，俗名山萸肉、萸肉、药枣、枣皮，具有
补益肝肾、涩精固脱的功效。主要分布于我国的河
南、浙江、陕西等省，四川、安徽、山东亦有分布。山茱
萸在长期的应用和栽培过程中，种内产生很大变异，
出现较多栽培品种，主要表现在这些品种的果实从
形状、大小、颜色、质量到产量、干果肉(药材)得率等
具有较大的差异，即它们的经济价值是明显不同
的口]。笔者分别到河南的西峡县、内乡县、栾川县，浙
江的临安市、淳安市，陕西的周至县、佛坪县等地进
行了调查研究，发现山茱荑种内性状变异现象在国
内主要产区普遍存在，各品种的性状是稳定的，具有
遗传性。
本实验从山茱萸7个农家品种12个样品干燥
叶中成功地提取出了DNA，通过对200个上海生工
s系列引物进行试验，筛选出22个随机引物进行了
RAPD分析，以探讨不同品种间的亲缘关系，并初
步构建了7个农家品种的RAPD指纹数据库，为山
警銎品耆；篙蓄善慕蔷青年基金项目(0412000700)；河南省高校杰出科研人才创新工程基金项目(z004KYcx。07)
储简介。赞躲；甓高魏博士Fax’教：(授’037研究1)65方向9625舯46药规E-ma范化iltsu种iq器量麓毒船：发表论文”余篇’参编著作5部
万方数据
中革喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第3期2006年3月·431·
茱萸种质资源保护和品种鉴别提供理论依据。
1材料和方法
1．1材料：山茱萸叶分别采于河南的西峡县、内乡
县、栾川县，浙江的临安市、淳安市，陕西的周至县、
佛坪县等地，经笔者鉴定，材料名称及产地见表1。
采集无病虫害的新鲜叶片，硅胶快速干燥，备用。
衰1供试样品材料
Table1 Plantmateriaistested
1．2实验方法
1．2．1总DNA的提取：取同一产地同一品种5～
lo株的植物叶片(变色硅胶快速干燥)，混合后称取
lg，经液氮处理提取基因组DNA。总DNA的提取
采用改良后的CTAB法”j。
1．2．2引物筛选：实验用了200个上海生工公司生
产的s系列引物进行了研究筛选，从中选出了22个
条带清晰、重现性好、多态性强的引物，进行全部样
品的PCR扩增。筛选出的22个随机引物及碱基序
列见表2。
裹2扩增所用的22个引物豆其序列
Table2 Primers(Z2)andtheirsequencesamplified
引物 序 列 引物 序 列
S28 GTGACGTAGG$201 GGGCCACTCA
S37 GACCGCrrGT$207 t；GCAGGCTGT
$38 AGGTGACCGTS21l TTCCCCGCGA
S43 t：’F【X；C“；TCA $214 AATGcCGCAG
S45 TGAGCGGACA$275 ACACCGGAAC
$99 GTCAGGGCAASz77 GTCCTGGGTT
S115 AATGGCGCAG$333 GACIAA(j【：(X：
S】18 GAATCGGCCA$354 CACCCGGATG
S121 ACGGATCCrG S367 A(；C(；AGCAAG
S157CTACTGCeGT$382 TGGGCGTCAA
S198 CTGGC(jAACT$393 ACCGCCTGCT
1．2．3 PCR反应：反应体系为25pL：其中20
pmol／L引物2pL，核DNA约30～40ng／pI。2,ul。，
1 u／pLTaq酶2pL，dNTPs各2．5mmol／L1．5
“L，25mmol／LMgCI2 2pL，10×PCR缓冲液2．5
pL，ddH2013／1L。
扩增程序为：预变性94C、8rain；35个循环为
94℃、1rain，38C、lmin，72c、1．5rain；后延伸
72℃、5rain；4℃保存。
检测：取5HI．扩增产物于1．0％琼脂糖凝胶上用
1×TAE电泳缓冲液电泳，0．5ng／m]．溴化乙锭染
色，紫外检测，凝胶电泳图像分析系统拍照，见图l。
图1引物s115对不同山茱萸样品的扩增
结果(图上的数据为个体编号)
Fig．1RAPDAmplifiedpro uctsgeneratedbyPrimer
s115toC．officinaliss mples(datainfigure
arenumber3ofindividualsamples>
1．3数据处理：通过对200个引物进行筛选，最终
选出条带清晰、多态性明显，扩增产物丰}{对分子质量
在loo～2000bp的随机引物进行PCR扩增，检测
计算有效位点数，将辽移率相同的电泳条带作为同
原位点处理，强带计为l，弱带或无带计为0，得到每
一引物不同谱带与材料的1、0化数据矩阵，进行统
计分析。计算遗传系数FEF一2Nnn／(Ⅳn+Ⅳn)；
Ⅳ．、Ⅳ。；分别代表基因型(或个体)A和B所具有的
条带数，．vAB则表示A、B两个基因型共有的条带数]
和遗传距离D(D一1一F)，利用SPSSl0。0软件进
行聚类分析。
2结果与分析
2．1多态性及相似性分析：实验用了200个上海生
工公司生产的s系列引物进行了研究筛选，从中选
出了22个条带清晰、重现性好、多态性强的引物，进
行全部样品的PCR扩增，总计扩增出133条带，其
中多态性谱带75条，多态性比率为56．39％。从遗
传距离分析结果看，种下不同农家品种的遗传距离
比较接近，为0．065～0．279。
万方数据
中革喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第3期2006年3月
总体比较而言，不同品种之间的遗传距离大于
同一品种不同基因型(个体)之间的遗传距离，如：椭
圆形果型2号与3号、短梨形果型9号与10号、短
圆柱形果型11号与12号之间分别为0．065、
0．091、0．074；1号(纺锤形果型)与2号(椭圆形果
型)之间为0．140，见表3。
表3各样品之间的遗传距离数据衰
Table3 Geneticd stanceamongc．officinaliss mples
样
。1
2 3 4 5 6 7 8 9 lO ll
叫
2 0．140
3 m1400 055
d 0．2490．1720 j40
5 n．2170 1320 1320 131
6 0．1200．10i010101830103
7 0 2270 1460 1460 i540．I270 I47
8 0．20901250．1040l34013701370lIl
90．1530．1320．1100 2390 1870．1760．1780．137
1DO】85019601640．257D 22701960．]860．1570 091
11q 1940．1520 1410 2330 l940．1840 1650．1660—1220 102
12 0．1590 l600．1602790 2370 2040 1940．1960．1060 0970．074
2．2聚类分析：聚类分析的方法是建立某种距离分
析的基础上，依样品群体相似程度的大小使群体间
形成一树状关系，并借以研究样品群体的相似性和
遗传关系。本实验以各样本之闻的遗传距离为聚类
统计变量，采用SPSSl0．00软件进行聚类分析，绘
成树状图，如图2。从图中可以看出，纺锤形果型自
成～类，短梨形果型与短圆柱形果型聚为一类，其余
几种成一大类。
图2用遗传相似系数聚类分析产生的树状图
Fig．2DendrogramofC．officinaliss mples
withgenetics milarityanalysis
3讨论
3．1现代研究证明：山茱萸中含有多种成分，如有
机酸类、环烯醚菇苷类、鞣质类、多糖、氨基酸、维生
素及矿质元素等”]。为了评价不同品种山茱萸的质
量，笔者曾以熊果酸、马钱苷、总多糖、总鞣质、水溶
性浸出物和醇溶性浸出物的量为指标，利用灰色模
式识别法进行综合品质评价，并结合药效学评价结
果及农业经济指标，筛选出椭圆形、圆柱形、长梨形
果型的山茱萸为优良栽培品种“]。
3．2实验结果和山茱萸的生长和分布基本一致，从
纺锤形果型山茱萸生长习性看更近于野生种：果小，
每果序1～3个果，挂果稀少，产量低，植株抗病力
弱 抗逆性差。同时，从树状图也可以看出各栽培品
种之问的遗传关系，纺锤形果型与果形短小的短梨
形果型和短圆柱形果型又聚为一大类，亲缘关系较
近；其余几种果形较长大的品种椭圆形果型、圆柱形
果型、长圆柱形果型、长梨形果型聚为一大类，品种
有一定混杂。这是在长期的栽培过程中人为选择的
结果，经济效益的驱使，药农总是选择果大的类型；
由于缺少品种的纯化选育，加上异地品种的交流混
栽，造成品种的混杂。
3．3 目前对这些农家品种的比较鉴定的研究大多
停留在表现型水平【5。1，而无法知道各变异类型之
间的遗传关系。山茱萸是木本植物，从幼苗到开始挂
果需要6--8年的时间，故以果实的性状对山茱萸的
品种进行鉴别、筛选与纯化是非常困难的，长期以来
药农盲目引种栽培，在主产地山茱萸的品种相当混
杂，严重影响r药农的经济利益和山茱萸药材的质
量。利用现代分子生物学技术对名农家品种进行
RAPD(randommplifedpolymorphicDNA随机扩
增多态性DNA)分析，分析其遗传分化和遗传多样
性，建立DNA遗传图谱，从DNA分子水平上建立
筛选纯化山茉萸优良品种的快速、准确的科学方法，
为山茱萸的种质鉴定提供线索，为山菜萸的栽培和
育种提供理论依据。
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万方数据
山茱萸不同栽培品种的RAPD分析
作者： 陈随清， 王利丽， 冀春茹， CHEN Sui-qing， WANG Li-li， JI Chun-ru
作者单位： 陈随清,CHEN Sui-qing(河南中医学院,河南,郑州,450008;郑州大学基础医学院,博士后流动
站,河南,郑州,450052)， 王利丽,冀春茹,WANG Li-li,JI Chun-ru(河南中医学院,河南,郑
州,450008)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(3)
被引用次数： 11次

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