全 文 ：·药理与临床·
雷氏大疣蛛毒素对人肝癌细胞 SMMC-7721
细胞增殖及细胞周期的影响
孙 捷1 ,高 莉2 ,沈永青3,单保恩4
( 1. 河北医科大学科技总公司, 河北 石家庄 050017; 2. 河北师范大学生命科学学院,河北 石家庄 050016;
3. 河北省人民医院 肿瘤科,河北 石家庄 050051; 4. 河北医科大学第四医院 科研中心, 河北 石家庄 050011)
摘 要: 目的 探讨雷氏大疣蛛 Macrothele rav eni 毒素对人肝癌细胞 SM MC-7721 增殖及细胞周期的抑制作用,
进一步探讨其作用的分子机制。方法 采用 M TT 法测定雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞增殖作用的影响;
采用 [ 3H] -T dR 掺入法检测雷氏大疣蛛毒素作用前后 SMMC-7721 细胞 DNA 合成的变化; 采用流式细胞术
( FCM ) 探讨雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞凋亡率和细胞周期的影响; 采用 Western Blot 方法研究雷氏大
疣蛛毒素对细胞周期相关 c-m yc 蛋白表达的影响。结果 M TT 方法表明雷氏大疣蛛毒素对 SM MC-7721 细胞增
殖有较强的抑制作用 (P < 0. 05) , 时效和量效关系良好。雷氏大疣蛛毒素可以抑制 SMM C-7721 细胞 DNA 的合
成。流式细胞仪检测结果发现雷氏大疣蛛毒素作用后 SMMC-7721 细胞凋亡率增加, 细胞周期阻滞在 G 2/ M 期。
Western Blot 方法进一步检测到雷氏大疣蛛毒素作用 SMMC-7721 细胞 72 h 后, c-myc 蛋白表达减弱。结论 雷
氏大疣蛛毒素可以抑制人肝癌细胞 SMMC -7721 的增殖和 DNA 的合成,其机制可能是诱导细胞凋亡,使细胞周期
相关 c-myc 蛋白表达减弱,导致细胞周期的变化。
关键词: 雷氏大疣蛛毒素; SMMC -7721 细胞; c-myc 蛋白
中图分类号: R286. 91 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2006) 01 0074 04
Effect of spider venom from Macrothele raveni on proliferation and cell cycle
of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721
SUN Jie
1
, GAO Li
2
, SHEN Yong-qing
3
, SHAN Bao-en
4
( 1. Science and Techno lo g y Company, Hebei Medical Univ er sity, Shijiazhuang 050017, China ; 2. Colleg e of L ife Science,
Hebei Normal U niver sity , Shijiazhuang 050016, China; 3. Depar tment of Onco log y, Peoples Hospital
o f Hebei Pr ovince , Shijiazhuang 050051, China ; 4. Resear ch Centr e, T he Four th Hospital
of Hebei Medical Univer sity , Shijiazhuang 050011, China)
Abstract: Objective T o study the ef fect of spider v enom fr om Macr othele raveni on proliferat ion and
cell cycles of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 and the molecular mechanism of the
effect . Methods Proliferat ion of SMMC-7721 cells w as determ ined by M TT assay . DNA synthesis of
SMMC-7721 cel l pre- and post-t reatment w ith spider v enom from M . rav eni was tested by [
3
H] -TdR
assay. The induct ion of apoptosis and the change of cell cy cle in SMMC-7721 cells t reated w ith spider
venom from M . raveni wer e invest ig ated by Flow Cy tometr y. The effect of spider venom from M . raveni
on expression of c-myc protein in SMMC-7721 cells w as studied by Western Blot . Results MTT assay
show ed that the prolifer ation of SMMC-7721 cells in v itro was inhibited by spider venom fr om M . raveni
( P< 0. 05) in t ime-dependent and concentrat ion-dependent manners. T he DNA synthesis o f SMMC-7721
cells w as inhibited by spider venom from M . raveni . T he apoptosis and inhibit ion of SMMC-7721 cells in
the G 2/ M phase w ere induced af ter tr eated w ith the spider v enom from M . rav eni . Expression o f c-myc
pr otein in SMMC-7721 cells t reated w ith spider venom from M . r aveni fo r 72 h w as obviously down-
regulated. Conclusion Spider v enom from M . raveni could inhibit the proliferat ion and DNA synthesis of
SMMC-7721 cel ls. The potent ial mechanisms ar e to induce cell apoptosis, act iv ate the low er expression of
c-myc protein and change the cell cycle of SMMC-7721 cells.
Key words : spider venom from Macrothele rav eni Zhu, L i & Song ; SMMC-7721 cells; c-myc protein
·74· 中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 37 卷第 1 期 2006年 1月
收稿日期: 2005-05-20基金项目: 国家自然科学基金项目 ( 30371753) ; 河北省教育厅科研项目 ( 2004110) ; 河北师范大学科研基金资助
作者简介: 孙 捷( 1969—) ,女, 江苏徐州人,医学硕士,主管药师, 主要从事抗肿瘤药理学研究。
* 通讯作者 高 莉 T el: ( 0311) 6268655 6033941-290 Fax : ( 0311) 6992004 E-mail: gao li0823@ yahoo. com . cn
近年来, 在动物毒素的抗肿瘤作用研究中, 关于
蛇毒的研究比较多。而关于蜘蛛毒素对肿瘤细胞的
作用的研究很少。仅有赵维勒等[ 1]报道穴居狼蛛毒
的某些组分对培养的人肺腺癌细胞 ( SPC-A) 的致
伤作用明显但却没有探讨作用机制。本研究的目的
在于研究雷氏大疣蛛 Macr othele r aveni Zhu, Li &
Song 毒素对人肝癌细胞株 SMMC-7721 增殖的抑
制作用和对细胞周期的阻滞作用及利用 MTT 法、
[ 3H] -T dR 掺入法、流式细胞术和 Western Blot 方
法从细胞水平和分子水平探讨其作用机制。
1 材料
人肝癌细胞株 SMMC-7721, 由河北医科大学
第四医院科研中心提供。RPM I-1640 培养基和胰蛋
白酶为 Gibco 公司产品;胎牛血清为杭州四季青生
物工程材料有限公司产品; [ 3H] -TdR 购自中国原
子能研究所; M T T、SDS、T riton X-100、戊二醛、2-
巯基乙醇、EDT A, 木瓜蛋白酶抑制剂和碘化丙啶
( PI ) 均购自 Sigma 公司; 第一抗体为 c-myc、
GAPDH 鼠抗人单克隆抗体 ( Santa Cruz, 美国) ;
第二抗体为辣根过氧化物酶标记的抗鼠 IgG 抗体,
购自中山生物技术公司。滤器为 Nippon M illipo re
L td 产品; 96 孔培养板为美国 Costar 公司产品;
TC2323 型 CO 2培养箱为美国 Sheldon 公司产品;
LH50A 型倒置相差显微镜为日本 Olympus 产品;
SW—CJ—IF 型净化工作台为苏净集团苏州安泰空
气技术有限公司产品; 酶标仪为 Bio—Rad 公司产
品; Backman CoulterTM型液闪仪 ( LS6500 型, 美
国 ) ; 流式细胞仪 FACScan, Becton-Dickinson, 美
国。ECL 增强化学发光系统和硝酸纤维膜购自英国
Amersham 公司。
雷氏大疣蛛毒素购于广西南宁市南方蜘蛛研究
所。其制备方法是:用空心软管诱导雷氏大疣蛛,待
其螯牙扎入软管排毒后,用一次性注射器吸取。立即
放入冷冻干燥机中冻干。实验时,用 RPM I-1640培
养基溶解,一次性小滤器滤过除菌。
2 方法
2. 1 肿瘤细胞悬液制备:将 SMMC-7721细胞从液
氮中取出经复苏后, 培养在 RPM I-1640 完全培养
液中 (含 10%～20% 胎牛血清,青霉素和链霉素各
100 U / mL 及 0. 03% 谷氨酸胺)。置于 37 ℃、饱和
湿度、5% CO2培养箱中培养,隔日换液,待细胞进入
对数生长期后,贴壁细胞弃去上清液,磷酸盐缓冲液
( PBS ) 冲洗两遍, 用 0. 25% 胰蛋白酶消化, 传代
细胞。
2. 2 雷氏大疣蛛毒素对人肝癌细胞 SMMC-7721
的体外抑制作用 ( MT T 法 ) [ 2] : 将 1× 105 / mL
SMMC-7721 细胞悬液接种于 96 孔培养板, 每孔
100 L,分别加入 PBS (阴性对照)及不同终质量浓
度 ( 10、20、40 g/ mL) 的蜘蛛毒素各 10 L, 每组
均设 6 个复孔。置于饱和湿度、37℃、5% CO 2培养
箱中培养 72 h,各培养孔加入 5 mg/ mL MT T 10
L, 4 h 后, 弃去培养上清液, 每孔加入 15% SDS
100 L,过夜。次日用酶联免疫检测仪检测各孔吸光
度 ( A ) 值, 测定波长为 570 nm , 参考波长为 630
nm ,计算生长抑制率。
生长抑制率= ( 1- A实验/ A 对照 )×100%
2. 3 [ 3H] -TdR 掺入试验: 接种 SMMC-7721 细胞
至 24 孔培养板,培养 4 h 使细胞贴壁生长,无血清
DMEM 培养 24 h 使细胞生长同步化于 G0 / G 1期。
细胞分成 4组,每组设 4个复孔。24 h 后每孔加入
10 L [ 3H] -T dR ( 3. 7×104 Bq) ,继续培养 12 h。加
入不同终质量浓度 ( 0、10、20、40 g/ mL) 的雷氏大
疣蛛毒素继续培养 24、48、72 h。培养结束后,弃去
培养液, 用 PBS 100 L 洗涤 3 次, 0. 1 mol/ L
NaOH 裂解细胞。用 ZT—Ⅲ 型微量细胞收集仪抽
滤 96 孔板底部的细胞,收集至 G49 型玻璃纤维滤
纸上,用磷酸盐缓冲液洗涤 2 次。将玻璃纤维滤纸
在 90 ℃ 下烘干后放入含 5 mL 闪烁液的闪烁瓶
内,暗处静置 24 h。于 BA CKMAN—L1600 型液闪
仪中,测定脉冲数 ( cpm)。
2. 4 流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期:采用
PI 染色法。实验组 10、20、40 g / mL 雷氏大疣蛛毒
素作用 SMMC-7721 细胞 72 h 后 (阴性对照组只
加等量 PBS) , 分别收集各组细胞,每组各设 6个复
孔, PBS 清洗 1遍。注入预冷 70% 乙醇, 固定 18 h。
离心弃乙醇后用 PBS 洗 1次。加入 RNA 酶 37 ℃
作用 1～2 h, 加入 T riton X-100 PI ( 100 g/ mL)
100 L, 混匀置冰上 30 min 后,在流式细胞仪上检
测。每组实验重复 3次。
2. 5 Western Blot 试验: 细胞处理同 2. 2 项方法。
用细胞刮刮下各实验组及对照组(只加 PBS ) , PBS
洗 2 次, 弃去洗液并吸干残液; 以 200 L 裂解液
( 50 mmo l/ L T ris-HCl, pH 8. 0, 0. 5 g/ L SDS, 1
mmol / L DT T) 裂解细胞,离心收集上清液。用改良
的 RIPA 缓冲液 (含 2 mmol/ L EDT A、50 mmol/ L
氟化钠、0. 1 mmol / L 钒酸钠, 1 L/ mL 亮抑制肽和
1 L/ mL 木瓜蛋白酶抑制剂) 稀释,测定蛋白的量。
每个样品取 10 L 蛋白质,加入 1×凝胶电泳缓冲
·75·中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 37 卷第 1 期 2006年 1月
液 100 L,沸水煮 5m in。将定量的蛋白提取物上清
液至 15% SDS-PAGE 80 V 电泳 3 h,经 100 V 转
移 2 h 至硝酸纤维素膜, 用 10% 脱脂奶粉封闭 1
h, 然后用相应的一抗 ( c-myc) , 4 ℃ 孵育 12 h, 用
辣根过氧化物酶标记的二抗进行标记,使用增强化
学发光系统检测反应蛋白, X线胶片显影。采用凝胶
成像分析仪 ( GDS8000,英国 UVP) 对 X 线胶片上
的条带进行峰下体积相对密度分析。
2. 6 统计学处理:数据用 x±s 表示。两组间比较用
t 检验,组间数据用双因素方差分析 ( F 检验)。应用
The SAS system 6. 12 统计软件计算。所有实验结
果均重复 3次。用凝胶成像及分析系统软件分析基
因在雷氏大疣蛛毒素作用 SMMC-7721细胞前后表
达情况的差异。
3 结果
3. 1 雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞的增殖
抑制作用的时效和量效关系:图 1结果显示,与阴性
对照组比较, 雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞
的增殖具有抑制作用, 并有良好的量效和时效关系,
随着药物质量浓度的降低和时间的减少, 抑制率逐
渐下降。
与对照组比较: * P < 0. 05
* P< 0. 05 v s cont rol group
图 1 雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞增殖的
抑制作用 ( x±s, n= 4)
Fig. 1 Inhibition of spider venom from M. raveni on
SMMC-7721 cell prolif eration ( x±s, n= 4)
3. 2 雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞 DNA
合成的影响: 采用 [ 3H] -TdR 掺入法观察不同质量
浓度的雷氏大疣蛛毒素作用 SMMC-7721 细胞 24、
48、72 h 后,对细胞 DNA 合成的影响。结果见表 1。
雷氏大疣蛛毒素作用 24 h 能明显抑制 SMMC-
7721 细胞 DNA 的合成, 差异显著 ( P< 0. 05)。作
用 48、72 h 没有显著抑制作用。
3. 3 雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞凋亡率
的影响:经过雷氏大疣蛛毒素作用 72 h 后, 用流式
细胞仪检测, SMMC-7721细胞凋亡率明显增加 (表
2) ,与对照组比较差异显著 ( P< 0. 05)。
3. 4 雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞周期的
影响:雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞的周期
分布均有影响, SMMC-7721 细胞 G2 / M 期明显升
高, G 0/ G 1期升高不明显, S期明显下降 (表 2)。
表 1 雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞 DNA
合成的影响 ( x±s, n= 4)
Table 1 Ef fect of spider venom from M. raveni on SMMC-
7721 cell DNA synthesis ( x±s, n= 4)
组 别
/
( g·mL- 1)
[
3
H] -TdR 掺入量 ( cpm)
24 h 48 h 72 h
对照 - 3 907±73. 24 4 23 2±121. 59 4 967±110. 31
雷氏大疣蛛毒素 10 3 116±83. 09* 4 02 9±118. 36 4 784±131. 51
20 2 472±51. 63* 3 92 3± 94. 38 4 529±143. 79
40 2 006±91. 47* 3 65 1±101. 46 4 482±117. 58
与对照组比较: * P < 0. 05
* P < 0. 05 v s con tr ol gr ou p
表 2 雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞凋亡
和细胞周期的影响 ( x±s, n= 6)
Table 2 Ef fect of spider venom from M. raveni
on apoptosis and cell cycles of SMMC-
7721 cells ( x±s, n= 6)
组 别
/
( g·mL- 1)
细胞周期分布/ %
G0/ G1 S G2/ M
细胞凋亡率/
%
对照 - 60. 3±2. 1 26. 5±1. 7 13. 0±2. 4 0. 7±0. 16
雷氏大疣蛛毒素 10 63. 0±2. 3 20. 3±2. 6* 16. 5±3. 1* 3. 6±0. 24*
20 65. 8±3. 1 11. 9±2. 0* 22. 3±2. 1* 7. 2±0. 30*
40 66. 2±2. 5 6. 0±1. 5* 27. 6±1. 9* 14. 0±0. 22* *
与对照组比较: * P < 0. 05 * * P < 0. 01
* P < 0. 05 * * P < 0. 01 v s cont rol group
3. 5 雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞 c-myc
蛋白表达的影响: Western Blo t 分析发现, 经 10、
20、40 g/ mL 雷氏大疣蛛毒素作用 72 h 后, 以灰度
分析比较, SMMC-7721 细胞中的 c-myc 蛋白表达
受到抑制,且表现为明显的质量浓度依赖关系。结果
见表 3。
表 3 雷氏大疣蛛毒素对 SMMC-7721 细胞中
c-myc 蛋白表达的影响 ( x±s, n= 6)
Table 3 Ef fect of spider venom from M. raveni
on expression of c-myc protein in
SMMC-7721 cells ( x±s, n= 6)
组 别 / ( g·mL- 1) c-myc/GAPDH
对照 - 0. 9±0. 07
雷氏大疣蛛毒素 10 0. 7±0. 14*
20 0. 5±0. 08*
40 0. 4±0. 11*
与对照组比较: * P < 0. 05
* P < 0. 05 v s con tr ol gr ou p
4 讨论
雷氏大疣蛛是于 2000年发现的一个新种 [ 3] , 目
前仅有关于雷氏大疣蛛毒素-Ⅱ的分离纯化与利用
·76· 中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 37 卷第 1 期 2006年 1月
大鼠蛛网膜下腔给药方式进行初步的神经毒素鉴定
的报道[ 4]。迄今还没有关于雷氏大疣蛛毒素对肿瘤
细胞抑制作用的研究报道。本研究使用人肝癌细胞
株 SMMC-7721 作为腺源性代表细胞株, 用雷氏大
疣蛛毒素进行体外抑瘤实验。结果表明,雷氏大疣蛛
毒素对人肝癌细胞株 SMMC-7721 有增殖抑制作
用,且抑制作用有浓度依赖性。
细胞分裂增殖的实质就是 DNA 的复制,通过
细胞不断经历细胞周期来实现。而细胞周期受细胞
内信号传导和多种因素的精细调节。特别是 G 2 / M
期细胞对外界环境因素敏感并能被刺激, 从而加快
或减缓细胞增殖。当细胞周期发生障碍时, 细胞增殖
将受到抑制,而 DNA 合成障碍是细胞周期发生障
碍的较常见的原因。本研究中流式细胞仪测定结果
显示,经雷氏大疣蛛毒素作用后, SMMC-7721 细胞
周期发生了变化, 其中 G 2/ M 期细胞增多, S 期细胞
减少, 说明雷氏大疣蛛毒素的作用在 G 2/ M 期。用
同位素[ 3H] -T dR 作为 DNA 合成的前身物质, 加入
到培养液中,从细胞摄取[ 3H] -T dR 的多少, 借助放
射性活性测定方法来确定雷氏大疣蛛毒素对
SMMC-7721 细胞 DNA 合成的影响。实验结果表
明雷氏大疣蛛毒素明显抑制 SMMC-7721 细胞
DNA 的合成。以上结果提示,雷氏大疣蛛毒素抑制
SMMC-7721 细胞的增殖, 是通过抑制细胞 DNA
合成, 作用于 SMMC-7721 细胞株的 G 2/ M 期, 从
而阻滞细胞周期的进程来实现的。
以 Wester n Blot 实验进行检测与细胞增殖周
期关系密切的 c-myc 蛋白的表达情况, 发现 c-myc
蛋白表达减弱, 浓度关系依赖性明显。所以可进一步
推测:雷氏大疣蛛毒素药理作用机制之一可能是使
SMMC-7721 细胞周期相关蛋白 c-myc 表达减弱,
导致细胞周期阻滞。
经过本研究证实,蜘蛛毒素抑制肝癌细胞的增
殖确实是一个崭新的科研领域,具有基础理论与医
疗实践双重意义。
References:
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研究) , 2001, 3: 217-220.
四逆汤有效部位抗心肌缺血-再灌注损伤作用
孙慧兰, 吴伟康 ,罗汉川,梁天文
(中山大学 中西医结合研究所、中山大学基础医学院病理生理教研室, 广东 广州 510080)
摘 要: 目的 考察四逆汤有效部位抗心肌缺血-再灌注损伤的作用。方法 实验动物随机分为正常组、模型组、四
逆汤组、四逆汤有效部位组。大鼠心脏进行 Langendor ff 灌流, 通过控制灌流液流量建立心肌缺血-再灌注损伤模
型, 用药组在灌流液中加入相应药液, 测定再灌注后 50 min 的冠脉流量、心肌收缩力和再灌注 1 min 内心律失常
发生率。小鼠 ig 给药 3 d 后 ip 垂体后叶素 ( 20 U / kg ) 造模 ,记录 0～8 min 的心电图, 并取心肌测 SOD 活性、
MDA 及 LA 水平。结果 四逆汤和四逆汤有效部位均可不同程度地提高大鼠心肌缺血-再灌注损伤心肌收缩力恢
复率、降低再灌注 1 min 心律失常发生率 ,四逆汤有效部位对心肌收缩力的恢复作用较好,四逆汤对心律失常发生
的抑制较好;四逆汤和四逆汤有效部位均可明显地降低小鼠心肌缺血-再灌注损伤过程中的心电图 J 点抬高, 明显
提高心肌组织 SOD 活性,降低 M DA 和 LA 水平 ,四逆汤和四逆汤有效部位作用无明显差异。结论 四逆汤有效
部位可以显著地改善心肌缺血-再灌注损伤过程中的氧化损伤和抑制无氧酵解, 改善心肌收缩功能和心律失常。
关键词: 四逆汤;有效部位; 心肌缺血-再灌注损伤; 垂体后叶素
中图分类号: R286. 2 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2006) 01 0077 05
·77·中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 37 卷第 1 期 2006年 1月
收稿日期: 2005-05-30
基金项目: “211工程”重点建设项目课题 ( 98176) ; 广东省高教厅资助; 广东省中医药管理局科研基金资助项目 ( 100118)作者简介: 孙慧兰( 1972—) ,女, 山西太原人,中山大学中西医结合研究所、中山大学基础医学院病理生理教研室讲师,博士, 主要从事中西医结合及心血管
病理生理学研究。Tel: ( 020) 87331624 E-mail: hannasun@ 163. com
* 通讯作者 吴伟康 T el: ( 020) 87331624 F ax: ( 020) 87331779