全 文 ：中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月·265·
仙茅叶片的组织培养及其细胞学观察
彭海峰，曹友培，俞新华，赵晟，黄晓柯
(华南农业大学生命科学学院，广东广州 510642)
摘 要：目的 通过对仙茅叶片组织培养的研究与细胞学观察，为仙茅的快速繁殖提供技术依据。方法将仙茅幼
叶培养在MS培养基，通过设计不同的光照条件，附加不同的激素、水解酪蛋白和活性炭成分，调查出愈率和成苗
率。细胞学观察采用石蜡切片法。结果对仙茅叶片的愈伤诱导，黑暗的效果好于光照；在所试验的培养基成分中，
适宜的激素配比是2．0mg／L2，4-D或6一BA1．5mg／L+2，4-D2．5mg／L，并且附加300mg／L水解酪蛋白和
0．2％活性炭，对于仙茅叶片的离体成苗较好；培养后，愈伤组织主要由叶片的中脉产生，位于中脉上表皮内侧的薄
壁细胞首先启动分裂，随后维管束鞘薄壁细胞及其外侧的叶肉细胞也启动分裂，参与愈伤组织的形成。愈伤分化时，
芽发生于愈伤组织的表面，根发生于愈伤组织的内部。结论可以通过仙茅幼叶的组织培养进行仙茅的快速繁殖。
关键词：仙茅；叶片；组织培养；细胞学
中图分类号：R282．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)02—0265—05
TissuecultureandcytologicalobservationsofleafexplantsofCurculigoorchioides
PENGHai—feng，CAOYou—pei，YUXin—hua，ZHAOSheng，HUANGXiao—ke
(CollegeofLifeScience，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)
Abstract：ObjectiveThes udiesontissuecultureandcytologicalobservationsofleafexplantsof
Curculigoorchioideswereconductedinor ertoprovidethbasisfortherapidpropagationofC． rchioides．
MethodsYoungleafexplantsofC．orchioideswerculturedonMSbasalmedia．Differencesinthecallus
inductionandplantletr generationra ewereobservedbydifferentlightreatmentaswellaschemicalfac—
torslikedifferentphytohormones，caseinhydrolysate(CH)，andactivatedcharcoal(AC)concentrations．
Paraffinmethodwasusedtocytologicalobservation．ResultsForcal uinductionofleafexplantsofC．
orchioides，darktre tmentgavebetterresultscomparedtolighttreatment；amongthemediatested，the
suitablephytohormonecombinationswere2．0mg／L2，4-Dor6一BA1．5mg／L+2，4一D2．5mg／L，and
300mg／LCH+O．2％ACwasgoodforplantletr generationfromleafexplants．Thecallusfromleafex—
plantsmainlyoriginatedfrommidrib．Thepar nchymacellsnearepicuticleofmidribfirstlywereinitiated
todivision．Thentheparenchymacellsofvascularbundlesheathndmesophyllcel soneachsideofvascu—
larbundlewerealsodividedtoformcallus．Thebudsdevelopedntheperipheralpartsofthecalli，butthe
rootsdevelopedintheregionsdeepwithinthecalli．ConclusionTi suecultureofyoungleafexplantsof
C．orchioidescanmakethepropagationofC． rchioidesrapid．
Keywords：Curculigoorch oidesGaertn．；leafexplants；tissuecult re；cytology
仙茅CurculigoorchioidesGa rtn．系石蒜科仙
茅属多年生草本植物，其根状茎人药，是一种传统的
中药材。能补肾助阳、益精血、强筋骨、行血消肿。用
于肾阳不足、阳痿遗精、腰脊冷痛、尿频尿急、寒虚崩
漏、疮疡肿痛、痨虚内伤、筋骨冷痛等临床病症[1]。随
着人们对仙茅药用价值的不断深入认识，对其开发
和应用越来越广泛，但由于仙茅在自然界的数量有
限，且传统的获取方法又以采集和消耗大量的野生
资源为代价，造成仙茅资源短缺。因此，有必要对其
进行以组织培养为手段的人工繁殖研究。目前，国内
外关于仙茅组织培养的研究报道较少[2’3]，且对其形
态发生的细胞学研究尚未见报道。本实验以仙茅叶
片为外植体，对其离体成苗的影响因素以及器官发
生的细胞学过程进行研究，以期为仙茅快繁体系的
建立提供理论依据和技术路线。
1材料与方法
1．1仙茅叶片的组织培养：挑选自然环境下生长健
壮的仙茅植株，取其新长出的长度约为8cm的幼
叶，流水冲洗干净后用75％酒精表面消毒30S，无
菌水冲洗1次，再用0．1％升汞消毒10～12min，
收稿日期：2006—05～05
作者简介：彭海峰(1972一)，女，山西右玉人，硕士，讲师，主要从事植物发育生物学研究。
Tel：(020)85280193E—mail：phf72@126．com
万方数据
·266· 中草芮 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月
无菌水冲洗5～6次。然后将叶片切割成0．5cm×
0．5cm的小块接种到MS培养基，每瓶接种4块。
诱导培养基添加的激素见表1，分化培养基添加的
激素为0．5mg／[。6-BA。所有培养基除特别说明
外，均附加300mg／I。水解酪蛋白，3．0％蔗糖及
0．2％活性炭，用0．6％琼脂固化，pH值调至
5．86。培养室的温度控制在26～28℃，在全黑暗、
全光照(12h／d)或先2d黑暗再光照(12h／d)的
条件下进行愈伤组织的诱导培养，绿苗分化在12
h／d光照的条件下进行。接种后约2个月统计出愈
率，并将愈伤组织转移到分化培养基上，1个月后统
计成苗率。出愈率一罐糕糌×100％成苗率==叁芸岩燃X100％
1．2 仙茅叶片组织培养的细胞学观察：将培养前的
叶片、培养不同时间的叶片以及愈伤组织，用FAA
固定液同定．按常规石蜡切片法制片。连续横切，切
片厚6～8pm．用番红～固绿或铁矾～海氏苏木精染
色，中性树胶封片。
2结果与分析
2．1 仙茅11{1片的组织培养
2．1．1 激素对仙茅叶片组织培养的影响：由表1可
知．单独使用2．4D时，在1．o～3．0mg／L的质量
浓度范围内．附加2．0mg／L2，4一D的诱导培养基，
其}_}j愈率和成莳率都是最高的，分别达到80．4％
和8s．7％．而u{2．4-D质量浓度为1．0或3．0mg／
I，时．H{愈率和成苗率均有所下降，且3．0mg／L
2．4D的下降幅度较大，出愈率和成苗率分别低至
37．5％和28。1％；单独使用6-BA时，在0．5～2．0
mg／I，内．出愈率最高的是附加0．5mg／L6一BA的
诱导培养基，而成苗率最高的是附加1．0mg／L6一
BA的诱导培养基，出愈率和成苗率分别为27。3％
和50．0％。附加2．0mg／L6-BA的培养基其出愈
率和成苗率都是最低的，出愈率仅为2．1％，成苗率
为0；2，4-I)与6BA搭配使用时，当2．0mg／L6一
BA配合使用不同质量浓度的2，4-D(1．5～2．5
mg／I。)时，出愈率和成苗率均随2，4一D的升高而增
加，并a附加2．0mg／L6一BA与2．0mg／L2，4一D
的诱导培养基，其出愈率和转分化后的成苗率比单
独使用2．0mg／L6-BA高，却比单独使用2．0rag／
I．2，4-D低。而当2，4一D为2．5mg／L时，使用1．5
mg／I，6BA的效果又好于2．0mg／L6一BA，成苗率
由31．3％上升到50．0％。
表1激素对仙茅叶片组织培养的影响
Table1 Effectofdifferentphytohormoneco binations
ontissuecultureofl afexplantsofC．orchioides
以上结果表明单独使用2，4一D和6一BA时，2，
4一D的效果比6一BA好；2，4一D和6-BA搭配使用
时，较高质量浓度的2，4一D有利于仙茅叶片的愈伤
诱导及进一步分化成苗，而较高质量浓度的6一BA
对仙茅叶片的愈伤诱导及成苗具有一定的抑制作
用。形态学观察还发现，单独附加6-BA的诱导培养
基获得的愈伤组织分化的绿苗数较少，多数为1～2
棵苗；而单独使用2，4一D以及6-BA与2，4一D搭配
使用时，诱导产生的愈伤组织容易增殖，且获得的愈
伤组织分化的绿苗数较多，但单独使用2，4-D获得
的试管苗由于数量较多而生长相对较弱。
2．1．2水解酪蛋白和活性炭对仙茅叶片组织培养
的影响：由表2可知，在MS+0．5mg／I．6BA的培
养基上加入0．2％活性炭后仙茅叶片的出愈率明
显升高，达到59．1％，是不加活性炭的1．7倍。形态
学观察表明这与活性炭有效防止褐变有关。当再加
入300mg／L水解酪蛋白后则出愈率下降，但成苗
率却由11。4％提高到37．5％，这可能与水解酪蛋
白改善了愈伤质量有关。
表2水解酪蛋白和活性炭对仙茅叶片组织培养的影响
Table2 EffectofCHandAContissueculture
ofleafexplantsofC．orchioides
2．1．3光照条件对仙茅叶片组织培养的影响：将仙
茅叶片接入MS+0．5mg／L6-BA+300mg／I。水
解酪蛋白+0．2％活性炭的培养基，在3种光照条
件下进行诱导培养。由表3可知，3种光照条件均能
诱导仙茅叶片产生愈伤组织并分化成苗，其中全黑
暗条件对仙茅叶片的诱导效果较好，出愈率高且愈
∞弱驼“弘够跎∞∞“
O
0
O
5
O
5
5
1
2
3
0
O
0
l
2
2
2
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月·267·
表3不同光照条件对仙茅叶片组织培养的影响
Table3 Effectofdifferentlightreatmentsonti sue
cultureofl afexplantsofC．orchiordes
伤质量好，成苗率达到37．5％；2d黑暗再光照虽然
诱导愈伤组织反应快，但出愈率不高，且愈伤组织质
量较差，成苗率仅为15．9％；全光照条件则出愈率
低且愈伤组织容易褐变而死亡，但其成苗反应快。
2．1．4炼苗与移栽的条件：对不同大小的试管苗进
行炼苗移栽的结果表明，当试管苗长到6cm时打
开瓶盖．在培养室放置3～5d，然后将试管苗从培
养瓶中取出，用清水洗净根系上的培养基，移栽到无
菌沙土里．10d后将小苗移到自然环境中的存活率
较高，可达85％以上(图1—5)。
2．2仙茅叶片组织培养的细胞学观察：培养前的仙
茅幼叶由表皮、叶肉和叶脉组成。表皮是单层细胞，
分卜^、下表皮。叶肉无栅栏组织和海绵组织的分化，
叶肉细胞内含大量叶绿体。叶脉为平行脉，中脉由维
管束、厚壁组织和薄壁组织组成。维管束的木质部近
叶腹面．韧皮部近叶背面，维管束鞘由2层细胞组
成，内层是较小的厚壁细胞，外层是较大的薄壁细
胞。维管束的上下方是厚壁纤维细胞，其中下方(即
近背面)的厚壁纤维细胞木化程度高而层数多，直接
与下表皮相接；上方(即近腹面)的厚壁纤维细胞木
化程度低而层数少，与上表皮之间还有薄壁细胞
(图1-6)。这些维管束上方的厚壁纤维细胞及其与
上表皮之间的薄壁细胞的层数会随着叶片的发育而
变化，在成熟叶片中全部为厚壁纤维细胞(图1—7)。
接种后几天，叶片伸展增大，中脉慢慢变白，培
养至3～4周左右，中脉膨大处产生白色的愈伤组
织(图1一1)。组织切片观察表明，上表皮内侧的薄壁
细胞首先启动分裂(图1—8)，形成愈伤组织(图1—
9)，随后维管束鞘薄壁细胞也启动分裂参与愈伤组
织的形成(图1一lo)。培养后期，中脉两侧的叶肉细
胞经多次横向分裂后呈放射状整齐排列，也形成愈
伤组织的一部分(图1一11)。愈伤组织细胞的增殖方
式有无丝分裂和有丝分裂(图1—12～14)，但主要是
无丝分裂，有劈裂(图1—15、16)、碎裂(图1—17)、缢
裂(图1—18)、出芽(图1—19)等多种方式，其中以劈
裂的方式较为常见。由于核分裂较胞质分裂快，也经
常可见到双核细胞(图1-9)。
随着愈伤组织的增殖，下表皮被愈伤组织形成
的突起撑破，在维管束近腹面一侧的愈伤组织中开
始出现成团的分生细胞群，也称为分生组织结节
(图1-20)，分生组织结节可以成为愈伤组织的生长
中心，也可以进一步分化出成群的管状分子，形成鸟
巢状的维管组织结节(图1—21)。近维管束的维管组
织结节进一步向着叶背面侧发育成根(图1．22)，而
在远离根的另一端的愈伤表面形成芽，芽与根之间
有维管组织相连(图l一23)，并可进一步发育成完整
的小植株(图1—2、4)。此外，上表皮内侧的薄壁细胞
启动分裂后不久形成的愈伤组织，也可不经过明显
的增殖阶段进行器官发生，分化出根和芽f图卜24、
25)，在中脉切口处成苗(图1—3)。
3讨论
关于植物叶片组织培养的愈伤组织起源和形成
已有一些报道。许智宏等[4]对烟草叶片(切去主脉
及大的侧脉)培养的细胞学观察，认为诱导愈伤组
织形成的是两类细胞，即叶肉细胞，以及小维管束中
的韧皮薄壁细胞和维管束鞘细胞。过令，}，对含主
脉的杨树叶薄层培养的细胞组织学研究表明，愈伤
组织主要由维管束鞘薄壁细胞，以及‘j其邻接的一
些栅栏组织细胞和韧皮薄壁细胞分裂而来．陈明霞
等[6]对怀山药叶片(试管苗叶片)脱分化过秤的细
胞学研究，指出愈伤组织起源于切【l附近的叶肉细
胞。暨淑仪等¨]对茶叶片(芽下第l、2片叶)愈伤形
成的组织细胞学观察，认为叶外植体叶肉中的小叶
脉周围以及主脉中的薄壁细胞首先启动脱分化，分
裂形成分生细胞团，继而形成愈伤组织。fj文和等圳
对草莓叶片培养的组织学研究，表明愈伤组织足由
维管束周围的薄壁细胞和叶肉细胞脱分化形成的分
裂中心进一步发育而成的。而对于单子叶植物，陈惠
民等[93报道小麦幼叶(发芽第4天的第1片幼叶)
愈伤组织最初起源于维管束鞘细胞，而且从靠近韧
皮部的位置开始，继而扩展至整个周圈及束内，维管
束以外的细胞未见分裂。李春瑶[1叩报道甘蔗幼叶
(高约2m成长蔗的蔗尾一1及一2叶)的愈伤组织起
源于两小维管束或小维管束与下表皮之间的薄壁细
胞。实验对单子叶植物仙茅叶片(8cm长幼叶)培
养的细胞学观察表明，其愈伤组织首先起源于中脉
维管束与上表皮之间的薄壁细胞，以后扩展至维管
束鞘薄壁细胞及其外围的叶肉细胞，韧皮薄壁细胞
未参与愈伤组织的形成。与前人研究结果的差异，可
能与植物种类、叶片结构与发育阶段以及叶片接种
部位的不同有关。
万方数据
·268· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月
1一叶片中脉处诱导出愈伤2一愈伤增殖并分化
出芽3一中脉切口处成苗，未见明显的愈伤
4一分化出芽和根的试管苗 5一移栽的组培苗
6、7-仙茅叶片横切面(6幼叶，7成熟叶，Ph韧
皮部，Xy木质部，VBS维管束鞘，S厚壁组织，
P薄壁组织)8-上表皮内侧的薄壁细胞分裂
(十)9-刚产生的愈伤组织lo一维管束鞘薄
壁细胞分裂形成的细胞团(+)11一中脉两侧
的叶肉细胞经多次横向分裂呈放射状排列
12～14一有丝分裂方式(12中期，13前期，14后
期) 15～19-无丝分裂方式(15劈裂，16劈
裂，17碎裂，18缢裂，19出芽)20一分生组织
结节(十)21一维管组织结节22一维管组织结
节分化出根23一愈伤组织的表面分化出芽，内
部分化出根24初始愈伤的芽原基分化 25一
不经明显愈伤阶段的根芽分化(十)
1callusinducedfrommidribofleafexplants
2-adventitiousbudsdeve—．10pedfrommultipliea—．
tivecalliofthemidrib3-midribofleafex—
plantsshowingor anogenesiswithoutevident
calli4-fullygrowni vitroplantshowing
multipleshoots5 plantletstransferredtOsoil
6，7-transverseectionofleafwithmidrib(6
youngleaf，7maturel af，Phloem，Xy
Xylem，VBSvascularbundlesheath，Sscle—
renchyma，Pparenchyma)8-parenchyma
cellsnearepicuticlebegintodivide9-calliof
earlyphase10cellgroupsfromparenchyma
cellsofvascularbundlesheath(arrow)¨一
regularrowsofcalliformedasaresultofcon—
secutivefissuratransversaofmesophyllcel s
12—14～modefmitosis(12metaphase，13
prophase，14anaphase)15m19-modeofami—
tosis(15 fissuratedivision，16-fissuratedivi
sion，17-fragmentationdivision，18一constric—
tiondivision，19-buddingdivisio )20一meris—
ternodule(arrow)21一vascularnodules22一
rootdevelopedfromnodularv sculartissue
(arrow)23一budsevelopedonperipheral
partsofthecalli，butrootsinregionsdeep
withinthecalli24——initiationofbudprimordi，．
umonperipheralpartsofcalliatearlyphase
25differentiationof rootandbudwithout
evidentcalli
图1 仙茅叶片培养的形态学及细胞学观察
Fig．1MorphologicalandcytologicalobservationsOiltis ueeultureofleafexplantsofC．orchioides
由于仙茅叶片的愈伤组织形成与器官发生部位 先将幼叶(长度不超过8cm)的带中脉叶块，接入
主要集中分布在中脉维管束附近，特别是维管柬与 诱导培养基(MS+1．5mg／L6一BA+2．5mg／L2，
上表皮之间的薄壁细胞在此过程中起了非常重要的 4一D或MS+2．0mg／L2，4一D，并附加300mg／I。
作用，但这些薄壁细胞会随着叶片的成熟逐渐分化 水解酪蛋白和0．2％活性炭)，在26～28℃的黑暗
为厚壁纤维细胞而失去脱分化能力。因此，对于仙茅 条件下进行诱导培养；当愈伤组织大小长到2～3
叶片的组织培养，取材时应选取长度不超过8cm mITl时转入分化培养基(MS+6一BA0．5mg／L+
的幼叶，并切取带有中脉的叶块，以提高仙茅的离体 300mg／L水解酪蛋白+0．2％活性炭)，在26～28
成苗率。另外，综合本研究中光照条件、培养基成分 ℃12h／d光照的条件下进行愈伤增殖及绿苗分化
及炼苗移栽条件对仙茅叶片离体培养成苗影响的研 培养；当试管苗生长至6crn高时，打开瓶盖3～5
究结果，可初步建立了一套仙茅快繁的技术体系：首d，然后将小苗移栽到无菌沙土里，10d后将小苗移
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第2期2007年2月·269·
栽到自然环境中生长。
致谢：在切片，gg,0e曾得到华南农业大学生命
[6]
科学学院严学成教授的热心帮助。
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防己药材的HPLC指纹图谱研究
崔金国1’2，饶 毅“，魏惠珍1，黎 莉2，刘隆洪3，王跃生1，杨世林1
(1．中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西南昌 330006；2．江西中医学院，江西南昌330006；
3．江西翔云生物药业有限公司，江西遂川 343900)
摘 要：目的 用HPLC法对防己药材指纹图谱进行研究。方法采用色谱条件：ShimadzuVP—ODS柱(250mm×
4．6ram)；流动相为乙腈一0．1％磷酸溶液，梯度洗脱进行色谱分离；检测波长为282nm；以防己诺林碱作为参照物。
结果 初步建立了防己药材的HPLC指纹图谱，并进行相似度评价。结论方法简单可行，能够有效地控制防己药
材的内在质量。
关键词：防己；指纹图谱；HPLC；相似度
中图分类号：R282．7R286．02 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)02—0269—04
HPLCFingerprintofRadixStephaniaeTetrandrae
CUIJin—gu01～，RAOYil，WEIHui—zhenl，LILi2，LIULong～hon93，
WANGYue—shen91，YANGShi—linl
(1．NationalPharmaceuticalEngineeringCenter(NPEC)forSolidPrepa ationinChineseMateriaMedica，Nanchang
330006，China；2．JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330006，China；
3．JiangxiXiangyunBiologyPharmaceuticalCo．，Ltd．，Suichuan343900，China)
Abstract：ObjectiveTos udythefingerprintofRadixStephaniaeTetrandraebyHPI。C．Methods
HPLCcondition：COlumnShimadzuVP一0DS(250mm×4．6mm)；themobilephasewasacetonotrilewith
0．1％phosphoricacidandthegradientelutionm dewasappliedinchromatographicseparation；thedetee—
tivewavelengthwas282nm；fangchinolinewasusedasthereferencecompound，ResultsHPLCFinger—
printofRadixStephaniaeTetrandrawasestablishedandthesimilarityofthefingerprintwascompared．
收稿日期：2006—04—25
作者简介：崔金国(1978一)，男，江西中医学院药物分析专业硕士研究生。E—mail：lanshu2005@163．corn
*通讯作者饶毅Tel：(0791)7119609E—mail：raoyi99@126．com
万方数据
仙茅叶片的组织培养及其细胞学观察
作者： 彭海峰， 曹友培， 俞新华， 赵晟， 黄晓柯， PENG Hai-feng， CAO You-pei， YU Xin-
hua， ZHAO Sheng， HUANG Xiao-ke
作者单位： 华南农业大学生命科学学院,广东,广州,510642
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(2)
被引用次数： 1次

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文]-药学实践杂志2010,28(3)
4. 聂诗明.张丽萍.卢水珍.黎祥胜.校合香 正交试验法优选仙茅提取工艺的研究[期刊论文]-中成药2002,24(9)
5. 李向阳.屠万倩.翟乙娟.侯文峰 HPLC测定骨仙片中仙茅苷的含量[期刊论文]-中成药2005,27(9)
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引证文献(1条)
1.张萍.魏琴.张超.周黎军.袁吉有.刘庆.蒲国萍 仙茅地下茎段组织培养研究[期刊论文]-安徽农业科学 2009(10)


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