全 文 ：HPLC法测定益母草不同制剂中水苏碱
严优芍1 , 李卫民1* , 高　英1, 李其凤2 , 伍淑华2X
( 1. 广州中医药大学 新药开发研究中心, 广东 广州　510405; 2. 广州中医药大学科技产业园,广东 广州　510445)
　　益母草为唇形科植物益母草 L eonurus j ap o-
nicus Hout t .的干燥全草,是中医妇科常用药。益母
草中主要有效成分为水苏碱、益母草碱等生物碱类
成分[ 1]。含益母草制剂大多以水苏碱作为定量指标,
其测定方法有雷氏盐剩余比色法(《中国药典》2005
年版一部益母草项下)、雷氏盐沉淀溶解比色法(《中
国药典》1977年版一部)、紫外分光光度法 [ 2]、薄层
扫描法[ 3]、HPLC 法[ 4, 5]等。本实验采用 HPLC 法对
含益母草制剂中的盐酸水苏碱进行测定,结果表明,
该方法较其他方法精确可靠, 从而为益母草及其制
剂的质量控制提供了参考方法。
1　仪器与试药
　　Waters 高效液相色谱系统: Waters 2695 泵,
Waters 2996二极管阵列检测器, Empow er 色谱处
理系统。Aglient 8453—E 紫外分光光度计。
　　盐酸水苏碱对照品(批号 110712—200306, 中
国药品生物制品检定所) ,益母草药材购于广州中医
药大学大药房,各种益母草制剂均为市售, 乙腈为色
谱纯,其他试剂为分析纯,水为重蒸水。
2　方法与结果
2. 1　色谱条件:色谱柱为Water s-NH2 色谱柱( 250
mm×4. 6 mm, 5 Lm) ,流动相为乙腈-水( 80∶20) ,
检测波长为 202 nm,体积流量为 1. 0 mL/ m in, 柱温
为 25 ℃。
2. 2　溶液的配制
2. 2. 1　对照品溶液的制备:精密称取 105 ℃干燥至
恒重的盐酸水苏碱对照品 10 mg ,置 10 mL 量瓶中,
加甲醇使溶解,并加至刻度,摇匀,即得。
2. 2. 2　供试品溶液的制备: 取一定量样品(益母草
药材 6 g、益母草流浸膏 10 mL、益母草膏 10 g、益母
草颗粒 15 g、益母草片 0. 6 g、益母草胶囊 1 g、复方
益母草膏 4 g、调经益母片 6 g、慈航片 36 g、抗宫炎
片 12 g ) , 除益母草流浸膏、益母草膏和复方益母草
膏外,益母草药材粉末(过 3号筛)、益母草颗粒(研
细)、益母草胶囊内容物和益母草各种片剂(去包衣
后研细) ,均置具塞锥形瓶中, 精密加入 10 倍量乙
醇, 称定质量,超声处理 30 min,放冷, 再称定质量,
用乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过, 精密量取半量
续滤液,回收溶剂,残渣加水溶解。益母草流浸膏中
缓慢加入无水乙醇摇匀、益母草膏和复方益母草膏
加等量硅藻土研匀,其余操作按益母草药材等样品
处理方法操作。以上样品均用浓盐酸调至 pH 值为
2,加入新配制的 2%雷氏盐溶液适量, 冰水浴中放
置 1 h,滤过, 沉淀用少量冰水洗后, 加丙酮溶解, 往
丙酮液中滴加 0. 5%硫酸银溶液至不再有沉淀生成,
滤过,沉淀用水洗,合并滤液和洗液适当浓缩,向浓缩
液中滴加与硫酸银等物质的量的 1%氯化钡溶液,滤
过,沉淀用水洗, 合并洗液与滤液, 蒸干, 残渣加甲醇
溶解,转移至10 mL 量瓶中,加甲醇至刻度,备用。
2. 3　标准曲线的制备:将对照品溶液用甲醇稀释成
质量浓度分别为 0. 05、0. 1、0. 2、0. 4、0. 8 mg / mL 的
溶液,精密吸取各稀释液和原对照品溶液 10 LL 注
入液相色谱仪, 按上述条件测定峰面积。以水苏碱峰
面积( Y )对进样量( X )作线性回归处理,其回归方程
为: Y = 6. 20×104 X - 1. 56×104 , r= 0. 999 9。结果
表明,水苏碱在 0. 5～10 Lg 与其峰面积呈良好的线
性关系。
2. 4　精密度试验: 精密吸取质量浓度为 0. 4 mg /
mL 对照品稀释溶液 10 LL, 连续重复进样 6 次, 测
定盐酸水苏碱峰面积值, 结果峰面积的 RSD 为
0. 99%。
2. 5　稳定性试验: 将上述各供试品溶液在配制后
0、2、4、6、8 h 进样,测定峰面积,结果盐酸水苏碱峰
面积的 RSD均< 2%, 表明各供试品溶液中盐酸水
苏碱在测定的 8 h内可保持稳定。
2. 6　重现性试验:取不同益母草制剂, 制备供试品
溶液, 每一样品平行测定 6 份, 各样品中盐酸水苏
碱的质量分数 RSD均在 2%以下。
2. 7　回收率试验:采用加样回收法。取已知质量分
数的益母草药材3 g,益母草流浸膏 5 mL,益母草膏
·70· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 37 卷第 1 期 2006年 1月
X 收稿日期: 2005-03-16
作者简介:严优芍( 1979—) ,女,浙江舟山人,硕士, 2005年毕业于广州中医药大学,主要从事中药新药的研究工作。
* 通讯作者　李卫民　Tel: ( 020) 87470715　E-mail : liw imi@pub. guangzhou . g d. cn
(湖南) 5 g, 各精密取 6 份, 分别加入精密称定的盐
酸水苏碱对照品 4 mg ,制备供试品溶液, 测得益母
草药材的平均回收率为 96. 61%, RSD 为 2. 65%;
益母草流浸膏的平均回收率为 96. 47% , RSD 为
1. 27% ;益母草膏的平均回收率为 95. 70%, RSD为
1. 63%。
2. 8　样品测定: 分别精密吸取各供试品溶液 10
LL, 按上述条件测定, 结果见表 1, 益母草制剂的
HPLC 色谱图见图 1。同时另取各种益母草制剂,采
用雷氏盐比色法进行测定, 测定结果见表 1。
表 1　益母草不同制剂中水苏碱的测定结果 ( n= 6)
Table 1　Quantitative determination of stachydrine
in diff erent preparations of Herba Leonuri
样　品　 产地或生产厂家 批　号 质量分数/ %
HPLC法 比色法
益母草药材　 广东　　　　　 031225 0. 12 0. 15
益母草流浸膏 广东××公司　 030804 0. 09 0. 11
益母草膏　　 湖南××公司　 031106 0. 08 0. 11
湖北××公司　 031202 0. 04 0. 06
广州××公司　 040107 0. 08 0. 12
山东××公司　 040101 0. 13 0. 21
益母草颗粒　 浙江××公司　 0309001 0. 08 0. 09
四川××公司　 030601 0. 10 0. 11
广东××公司　 040402 0. 11 0. 13
广西××公司　 040503 0. 04 0. 05
益母草片　　 四川××公司　 040101 1. 37 1. 82
广东××公司　 030604 1. 44 1. 83
益母草胶囊　 沈阳××公司　 20031277 1. 11 1. 03
复方益母草膏 北京××制药厂 030228 0. 22 0. 29
调经益母片　 广州××公司　 F00015 0. 07 0. 15
慈航片　　　 江西××制药厂 20040307 未检出 未检出
抗宫炎片　　 江西××公司　 20040641 0. 02 0. 21
湖南××公司　 20040412 0. 02 0. 21
2. 9　本法与药典、部颁标准方法测定结果比较:取
益母草药材、益母草流浸膏和益母草片分别按《中国
药典》2005 年版一部益母草项下方法和《中华人民
共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第 13册中方
法及本实验所用的 HPLC 法进行测定,并对结果进
行比较,结果见表 2。
表 2　本法和药典、部颁标准方法测定结果比较 ( n= 3)
Table 2　Comparison of analysis results with methods
of HPLC in Pharmacopoeia and promulgated
by Ministry ( n= 3)
样　品 批　号
水苏碱
(HPL C法 )
总生物碱(药典方法 )
实测值 规定量
益母草药材　 031225 0. 12% 0.15% > 0. 4%
益母草流浸膏 030804 0. 09% 0.11% > 0. 2%
益母草片　　 广东 040301 8. 86 mg·片- 1 16. 73 mg·片- 1 13. 5～16. 5 mg·片- 1
益母草片　　 四川 040101 8. 22 mg·片- 1 16. 44 mg·片- 1 13. 5～16. 5 mg·片- 1
A-对照品溶液　B-益母草胶囊　C-益母草片　D-益母草颗粒
E-复方益母草膏　F-益母草流浸膏　G-益母草膏　H-调经益
母片　I-抗宫炎片　J-益母草药材　K-慈航片　L-妇康宁片　
* -盐酸水苏碱
A-s tachydrine h ydrochlor ide　B-Yimucao Cap sules
C -Yim ucao T ab let s　D-Yimucao Granu le　E-Compound
Yimu cao electuary　F-Yimucao f luid ex tract　G-Yimucao
electuary 　H-T iaoj ing Yim u T ablets　I-Kanggongyan
T ablets　J-H er ba L eonur i　K-Cihang T ablet s
L -Fuk an gning　T ablet s　* -s tachydrine h ydrochlor ide
图 1　益母草不同制剂的 HPLC图
Fig. 1　HPLC Chromatograms of dif f erent preparations
of Herba Leonuri
3　讨论
　　根据水苏碱的结构, 曾经采用 ODS 柱,分别以
甲醇-0. 05 mol/ L 磷酸二氢钾、乙腈-0. 5% SDS
(pH 2～3 磷酸缓冲液)为流动相对水苏碱进行分
析,结果前者在任何比例下对水苏碱均无保留;而后
者在比例为 10∶90时, 虽能增加水苏碱的保留, 但
由于流动相组成复杂,方法的重现性较差。为此, 最
后参考文献报道 [ 5]改用氨基柱,以乙腈-水( 80∶20)
为流动相,在此条件下,水苏碱不仅能得到较好的保
留,且能和其他色谱峰分离。
　　在筛选供试品制备方法时发现, 益母草大多数
样品只需简单的醇提水沉或活性炭除杂后就能进行
水苏碱的分析测定,但对于含糖较多的制剂如益母
草膏等,则需进一步纯化。这些制剂用雷氏盐-硫酸
银-氯化钡法净化后,能除去样品中的大部分杂质,分
析效果好。为统一样品的处理方法, 同时保护色谱柱,
最后采用雷氏盐-硫酸银-氯化钡法对样品进行处理。
　　益母草各种制剂的 HPLC 法测定结果与比色
法相比偏低,可能是由于比色法的测定结果包含了
除水苏碱外其他成分。从益母草各制剂的 HPLC 分
析色谱图看,水苏碱色谱峰的附近还有其他色谱峰。
·71·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 37 卷第 1 期 2006年 1月
由样品的制备方法分析,该物质应该也是季铵碱。查
看该色谱峰的紫外吸收图谱发现其吸收光谱与水苏
碱很相似,具体为何物质有待进一步研究。在对抗宫
炎片进行测定时发现, 水苏碱前面色谱峰的峰面积
远大于水苏碱的峰面积,而测定结果也显示,比色法
所得结果约为 HPLC 法所得结果的 10倍。该结果
验证了上述推断。
　　《卫生部药品标准》中药成方制剂第 13 册采用
沉淀重量法对益母草片中的水苏碱进行控制,应用
该方法进行测定时样品定量符合要求,但比色法或
HPLC 法测定结果较该方法低。将沉淀重量法中所
得沉淀溶于丙酮发现很多不溶物,可见,沉淀不全是
生物碱的雷氏盐沉淀, 其准确性值得进一步探讨。
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　　板蓝根为十字花科植物菘蓝 I sati s indigotica
Fo rt . 的干燥根, 性寒、味苦,具有清热解毒、凉血利
咽的功效。板蓝根颗粒在《中国药典》2005版上以靛
玉红为鉴定标准。但事实上现有的水煮醇沉的制剂
工艺对脂溶性成分靛玉红的提取率极低。药理实验
证明, 靛蓝、靛玉红并非其清热解毒的药效成分,故
选靛玉红作为板蓝根及其制剂的质控指标已不适
合。为了从整体上控制板蓝根颗粒的质量, 同时进一
步来控制原料质量及生产工艺的稳定性, 本实验采
用高效液相色谱法建立了板蓝根颗粒的 HPLC 指
纹图谱分析方法,为进一步全面控制板蓝根颗粒的
质量提供了依据。
1　实验材料
　　岛津 LC—VP 系列高效液相色谱仪 (日本岛
津) , SPD—M10Avp ( PDA )检测器 LC—10AT vp
串联双柱塞泵, SIL—10Advp 自动进样器, Class—
VP 工作站; BS2000S 电子天平(赛多利斯) ; KQ—
250型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
　　甲醇(色谱级) , Millipore 超纯水, 磷酸(分析
纯)。板蓝根颗粒由江西汇仁制药厂提供。
2　方法与结果
2. 1　色谱条件: 色谱柱: Hyper sil C18柱( 250 mm×
4. 6 mm, 5 Lm) ;流动相: 甲醇( A) -0. 4%磷酸水溶
液( B) ,梯度洗脱程序: 0～30 min, 100% B, 30～50
m in, A-B ( 30∶70) , 50～70 min, A-B ( 35∶65) ,
70～80 min, A-B ( 60∶40) , 80 m in 以后, A -B
( 80∶20) ; 体积流量: 0. 7 mL/ m in; 检测波长: 219
nm ;柱温: 25 ℃; 进样体积: 5 LL。
2. 2　供试品溶液的制备:取本品研碎, 过六号筛, 称
取粉末约 5. 0 g ,精密称定, 精密量取 80 mL 氯仿,
水浴中索氏提取 3 h, 取氯仿提取液, 70 ℃挥干, 残
渣加甲醇溶解于 2 mL 量瓶中,即得。
2. 3　方法学考察
2. 3. 1　精密度试验:取同一份板蓝根颗粒供试品溶
液, 连续进样 6次,按上述色谱条件测定,各色谱峰
相对保留时间的 RSD< 0. 2%, 各色谱峰相对峰面
积的 RSD< 1. 5% ,表明仪器系统精密度良好。
2. 3. 2　重现性试验: 取同一批板蓝根颗粒 (批号
0305120) ,按供试品的制备方法制备 6份,按上述色
谱条件依次检测,结果显示,各色谱峰相对保留时间
的 RSD< 0. 5%,主要共有峰面积的 RSD< 3%。
2. 3. 3　稳定性试验:取同一份板蓝根颗粒供试品溶
液,按上述色谱条件,分别在 0、1、2、4、8、16、24 h 检
测,各色谱峰的相对保留时间的 RSD< 0. 5% ,主要
·72· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 37 卷第 1 期 2006年 1月
X 收稿日期: 2005-05-16