全 文 ：绞股蓝总皂苷对血管性痴呆大鼠海马一氧化氮合酶及核酸的保护作用
齐　刚 ,张　莉 ,吴光亮 ,熊　杰 ,李积胜
(武警医学院 中心实验室 ,天津　 300162)
摘　要: 目的　观察绞股蓝总皂苷 ( GP) 对血管性痴呆 ( VD) 大鼠海马神经元型一氧化氮合酶 ( nNOS)及核酸的
保护作用。方法　采用改良的 Pulsinelli 4-血管阻断 ( 4-VO )方法建立大鼠 VD模型 ,用免疫组化法研究 GP对大
鼠海马 nNOS的表达的影响 ,并用吖啶橙染色法进行 GP对 V D大鼠海马的 DN A和 RN A保护作用的研究。结果
与正常对照组比较 , V D大鼠海马 CA1区和 CA3区 nNOS阳性神经元数目明显减少 ,而 DN A和 RN A吖啶橙染色
后的荧光强度 (反映 DNA和 RNA含量 )明显减弱 , GP 200 mg /kg ig给药组海马各亚区的 nNOS阳性神经元神
经细胞数比 VD模型组明显增多。DN A和 RN A吖啶橙染色后的荧光强度强于 VD模型组 ,与正常对照组相似。结
论　 GP可明显增强 VD大鼠海马 nNOS阳性神经元的表达 ,并对 DN A和 RN A有保护作用。
关键词: 绞股蓝总皂苷 ; 血管性痴呆 ; 一氧化氮合酶 ; 核酸
中图分类号: R286. 10　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 07 0630 03
Protective effect of gypenos ides on expression of neuronal nitric oxide
synthase and nucleic acid in hippocampus of vascular dementia rat
Q I Gang , ZHANG Li , WU Guang-liang , XION G Jie, LI Ji-sheng
( Centra l Labor ato ry of Medical Co lleg e of Chinese People s A rmed Po lice For ces, Tianjin 300162, China)
Abstract: Object　 To observe the protectiv e ef fect o f g ypenosides ( GP) on the expression of neuronal
ni teic o xide synthase ( nNO S) and the nucleic acid o f hippocampus in vascular dementia ( VD) o f rats.
Methods　 Modified Pulsinelli s 4-vessel occlusion ( 4-VO) method was used to establish the models of V D
in rats. The immunohistochemical method and acridine o range ( AO) staining method w ere used to investi-
ga te the expression of nNOS and the DN A and RN A contents in dif ferent hippocampus subfields in V D
ra ts. Results　 The number o f nN OS posi tive neurons decreased significantly and the fluorescent intensi ty
( reflecting DN A and RN A contents) o f the DN A and RN A aba ted ma rkedly in the area s of hippocampus of
V D g roup compa red w ith the normal control group. In the g roup of ig GP ( 200 mg /kg ) , the number of
nNO S positiv e neurons increased significant ly and the f luorescent intensi ty of the DN A and RN A enhanced
markedly compared w ith the model g roup and w as the same as the control g roup. Conclusion　 It is show n
that the expression of nNOS could be increased significantly and the injury of nucleic acid decreased in hip-
pocampus of V D rats by GP.
Key words: g ypenosides; v ascular dementia ( V D) ; nit ric oxide synthase ( NOS) ; nucleic acid
　　老年痴呆 ( Alzheimer s disease, AD) 是一种
慢性的大脑退行性病变 ,可分为 3种 ,即老年性痴
呆 ( AD) ,血管性痴呆 (v ascula r dementia , V D)和
二者并存的混合性痴呆 [1 ] ,伴随着人口老龄化 , AD
的发病率逐渐增高。而 VD则是由于各种类型的脑
血管病所致的认知功能选择性和可逆性损害的综合
征 ,鉴于 VD由脑缺血引发 ,而脑缺血可导致 nNO S
神经元的变化 ,并诱发以神经元 DNA早期降解为
特征的神经元凋亡 ,本实验进行了绞股蓝皂苷
(g ypenosides, GP) 对 VD导致的海马 nNOS阳性
神经元和 DNA, RN A损伤的保护作用的研究 ,旨
在进一步揭示 GP防治 VD的作用机制 ,以期为治
疗 VD药物的开发提供理论依据。
1　材料
1. 1　动物: Wista r大鼠 ,雄性 ,体重 240～ 260 g ,天
津市医学实验动物中心提供 (天津市医动字第 006
号 ,编号 2000-014)。
1. 2　药品与试剂:绞股蓝总皂苷 (含量> 90% ) ,华
光实业有限公司提供 ; nNO S抗体 , Santa Cruz产
品 ; ABC, Vector公司 ; DAB和吖啶橙 , Sigma公司
出品 ;其他试剂均为市售分析纯。
1. 3　仪器:恒冷箱冰冻切片机 ,英国 Brigh t公司出
·630· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
收稿日期: 2002-10-30作者简介:齐　刚 ( 1962— ) ,男 ,辽宁人 ,教授 ,硕士学位 ,主要从事心脑血管药理学研究。 E-mail: qgang@ eyou. com
品 ; UIII荧光显微镜 ,日本 Nikon公司出品。
2　方法
2. 1　 VD大鼠模型制备 [2 ]: 取大鼠 30只随机分 3
组。VD模型组 ip戊巴比妥钠 40 mg /kg麻醉固定 ,
切开颈部皮肤 ,分离椎旁肌 ,暴露第一颈椎翼状孔 ,
电灼烧凝固双侧翼小孔内的锥动脉 ,造成永久性闭
塞 , 24 h后 ,乙醚浅麻醉 ,切开腹侧颈中皮肤 ,分离
双侧颈总动脉 ,用动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉
5 min,缺血共 3次 ,每次间隔 1 h。 术后饲养 4周。
进行灌注固定并取材切片。 GP 200 mg /kg给药组
ig给药 1周后 ,按照 VD模型制备方法进行手术 ,
术后饲养 4周并观察。伪手术对照组:行同样手术
但不灼烧锥动脉 ,不夹闭颈总动脉 ,术后饲养 4周。
2. 2　组织取材:取上述各组大鼠 , ip戊巴比妥钠 40
mg /kg麻醉固定后 ,于 30～ 40 min内 ,从左心室快
速依次灌注生理盐水 100～ 150 mL, 4% 多聚甲醛
500 mL ( 4℃ )。迅速取脑 ,置 4℃同样的固定液中
固定 7～ 9 h后 ,移入 20% 蔗糖溶液中浸泡 12 h以
上 ,以恒冷箱冰冻切片机切片 (片厚 50μm)。
2. 3　免疫组化染色 [ 3]:切片移入 Tri ton-H2O2中 ( 37
℃ ) , 30 min后取出用 PBS漂洗 ,再用 3% 正常血
清封闭 30 min,然后加 nNOS抗体 ( 1∶ 100) 4℃
孵育 72 h。漂洗后加二抗孵育 60 min,漂洗后 ABC
( Avidin-Biotin-Peroxidase Complex , 1∶ 200)液孵
育 60 min,用 0. 05% DAB-0. 01% H2O2显色 ,镜下
控制反应强度 ,裱片、脱水、透明、封片。另取切片用
pH 7. 4的 0. 01 mol /L PBS接片 ,进行吖啶橙染
色 [4 ] ,荧光显微镜下观察结果并拍照。
2. 4　 nNO S阳性神经元计数: 每组选取对应断面的
海马脑片 15张 ,分别计数 CA1 , CA3区内所有
nNO S阳性神经元。
2. 5　统计学分析:用 SAS 6. 12软件包进行 t检验。
3　结果
3. 1　对照组海马结构内 nNOS阳性神经元的形态
和分布及 DNA和 RNA染色结果:对照组大鼠海马
CA1区和 CA3区均有 nNOS阳性神经元分布。染色
较深 ,神经纤维较长。CA1区 nNO S阳性神经元散在
分布于锥体层、腔隙分子层和辐射层 ,细胞多为圆
形、椭圆形的中小细胞 ,偶有梭形、锥形细胞 (见封
3,图 1-a1)。 CA3区阳性细胞较多 ,为中小型细胞 ,均
为深蓝色 (见封 3,图 1-b1)。荧光显微镜下 ,对照组
海马 CA1区及 CA3区 DNA和 RNA呈橙黄色 ,均
匀分布于海马锥体细胞层 (见封 3,图 2-c1, d1)。
3. 2　 VD组海马结构内 nNOS阳性神经元的形态
和分布及 DNA和 RNA染色结果: V D组海马结构
内 nNOS阳性神经元亦可见于 CA1区及 CA3区 ,其
细胞形态和分布模式与对照组无显著差别 ,但
nNOS阳性神经元数明显减少 ( P < 0. 05) ,见表 1,
反应强度变弱 ,神经纤维变短 (见封 3,图 1-a2,
b2)。 VD组海马 CA1区及 CA3区 DNA和 RNA荧
光反应强度 (反映 DNA和 RNA含量 )明显减低
(见封 3,图 2-c2, d2)。
3. 3　 GP组海马结构内 nNO S阳性神经元的形态
和分布及 DNA和 RNA染色结果: GP组海马结构
内 nNOS阳性神经元的形态、分布、反应强度和神
经纤维长度与对照组基本相同 (见封 3,图 1-a3,
b3,而神经细胞数比 VD组明显增多 ( P < 0. 001) ,
见表 1。 GP ( 200 mg /kg ) 组海马 CA1区 , CA3区的
DNA和 RNA荧光反应强度较 VD组明显增强
(见封 3,图 2-c3, d3) ,与对照组反应强度和分布模
式基本相同。
3. 4　海马结构内 nNO S阳性神经元变化:对照组、
VD组及 GP组海马各亚区 nNO S阳性神经元数量
的变化 ,见表 1。
表 1　海马各亚区 nNOS阳性神经元
数目的变化 ( x± s , n= 15)
Table 1　 Numeral changes of nNOS-positive neurons
in h ippocampus subfields (x± s , n= 15)
组别 剂量 / ( mg· kg- 1 ) C A1 CA3
对照 - 　 24. 73± 5. 72 　 37. 13± 5. 10
模型 - 20. 47± 4. 22* 25. 47± 3. 52*
GP 200 30. 00± 3. 63△ 38. 00± 5. 00△
　　与对照组比较: * P < 0. 05;　与模型组比较: △ P < 0. 001
　　 * P < 0. 05 vs cont rol group; △ P < 0. 001 vs model g rou p
4　讨论
　　一氧化氮 ( N O)在中枢神经系统中起信使和
递质样作用 ,适量的 NO通过激活腺苷酸环化酶 ,
使环磷酸腺苷增加 ,扩张血管并抑制血小板黏附聚
集 ,调节脑血流 ,对神经元具有保护作用 , NO S阳性
神经元能抵御某些神经毒素的毒害作用 [5, 6 ]。但脑内
NO的过量释放对其周围神经元又有毒性作用 [7, 8 ] ,
NO引起的神经毒性主要通过产生大量 · OH及
NO2· ,造成蛋白质、核酸、脂质膜损伤 [9 ]。观察生成
NO的专一合成酶 NO S可间接了解 NO在组织中
的分布。 缺血导致的海马区神经元的坏死发生于血
供恢复的 2～ 3 d,即“迟发性神经元坏死 ( delayed
neuronal death, DN D)” [10 ] , NO S阳性神经元在缺
血过程中有先升高后下降的变化过程 ,认为在早期
海马内 NOS的大量表达及由此引起的 NO合成和
·631·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
释放增多是造成 DND现象的一个重要原因 [11 ]。随
着缺血时间的延长 ,可能有诱导型一氧化氮合酶
( iN OS) 的激活 ,从而产生大量具有神经毒性作用
的 NO,在海马迟发性神经元凋亡及 VD的形成中
发挥了一定作用。
已有研究表明 , GP对大鼠全脑缺血再灌注损
伤及家兔急性不完全性脑缺血具有保护作用 ,认为
GP对缺血脑组织的保护作用不仅与其抑制自由基
的产生和脂质过氧化有关 ,而且与其对缺血脑组织
的神经细胞膜及微血管的稳定性的保护作用相
关 [12 ]。本研究结果显示 , V D组大鼠在饲养 4周后海
马内 nNOS神经元表达明显减少 ,这可能与缺血早
期 NO S大量表达产生大量具有神经毒性作用的
NO有关。而 GP组海马内 nNOS神经元表达与正
常对照组相似 ,表明 GP可保护海马内 nNOS阳性
神经元免受大量的 NO所导致的 DND。 GP的这一
保护作用可能与其抑制由 NO产生大量 · OH及
NO2· 自由基有关。
脑缺血再灌注损伤不完全是一种被动的神经元
坏死的过程 ,尚伴有细胞凋亡。一般认为海马 CA1
区、 CA3区为脑缺血再灌注的易损区 ,脑缺血再灌注
可导致细胞浆内钙离子增多 ,激活钙 /镁依赖的核酸
内切酶 ,将 DNA切割成大小不一的寡核苷酸片段 ,
即形成 DNA梯 ( DN A laddering ) ,是神经元凋亡
的重要特征之一。 本研究结果显示脑缺血再灌注模
型组海马 CA1区 , CA3区 DNA和 RNA荧光反应强
度明显减低 ,即 DNA及 RNA含量降低。 GP对全
脑缺血再灌注大鼠海马具有保护作用 ,减少了缺血
再灌注对海马 CA1区 , CA3区 DNA和 RNA的影
响。 DNA和 RNA与蛋白质的合成密切相关 ,此作
用的机制及其与 GP抗衰老、改善学习记忆及对
VD保护作用的关系 ,有待于进一步研究。
References:
[1 ]　 Zhang J T. Pathogenes es and th erapeu tic s t rategies of senior
dementia [ J] . Acta Pharma S in (药学学报 ) , 2000, 35: 635-
640.
[2 ]　 Xu D Y, You G X, Miao J T, et al . An exp erimental s tudy
of th e ni tric oxide m ech anism in acu te cereb ral i sch emia and
du ring th e process of vas cular dementia formation [ J ]. Chin
J Ger iatr (中华老年医学杂志 ) , 1999, 18: 240-243.
[3 ]　 Kato H, Kogure K, Liu Y, et al . Ind uct ion N ADPH-di-
aph oras e activi ty in th e h yppocampus in rat model of cerebral
ischemia and isch emia tolerance [ J] . Brain Res , 1994, 652:
71-75.
[4 ]　 Jiang B. Apop tosi s B asis an d Cl inic (细胞凋亡基础与临床 )
[M ] . Bei jing: People Mili tary Surgeon Publis hing House,
1999.
[5 ]　 Bred t D S, Snyder S H. Ni t ric oxide: a ph ysiologic mes sen-
ger molecule [ J ]. Annu Rev B iochem , 1994, 63: 175-178.
[6 ]　 Bred t D S, Snyder S H. Ni t ric oxide: a nov el neuronal mes-
senger [ J ]. Neu ron , 1992, 8: 3-5.
[7 ]　 Vincen t S R. Ni t ric oxide: a radical neu ro transmi t ter in the
cent ral sys tem [ J]. Prog Neurobiol , 1994, 42: 129-131.
[8 ]　 Benzing W C, M ufs on E J. Increase number of N ADPH-d-
posi tive neurons wi thin the su bstaintia innominata in
Alzh eimer s dis ease [ J] . B rain Res , 1995, 670: 351-353.
[9 ]　 Beckman J S, Beckman T W , Ch en J, et al . Apparen t h y-
droxyl radical production by perox yni t ri t e inplicat ions for en-
dothelial in jury f rom ni tric oxide and su peroxide [J ]. Proc
Nat l Acad Sci U SA, 1990, 87: 1620-1624.
[10 ]　 Kirino T. Delayed neuronal death in the g erbil h ippocampus
follow ing ischemia [ J] . B rain Res, 1982, 239: 57-69.
[11 ]　 Xie M, Gu Y M, Yao Z B. Changes of N ADPH-diapho rase
act ivi ty in rat hip pocam pus follow ing transient cereb ral is-
ch emia [ J] . Chin J Neu roanat (神经解剖学杂志 ) , 1998,
14: 8-12.
[12 ]　 Wang Z Y, Qiu P L. Pro tectiv e ef fect of gyp enosid es on
acu te incom plete cereb ral i sch emia in rab bi t s [ J] . Chin J
Pharmaco To xico (中国药理学与毒理学杂志 ) , 1992, 6:
204-206.
槲皮素对阿尔茨海默病大鼠学习
记忆影响及与海马细胞凋亡关系的研究
李永金 1 ,顾振纶 2 ,陈月芳 3 ,周文轩 4 ,郭次仪 4
( 1. 江苏大学医学院 药理教研室 ,江苏 镇江　 212001; 2. 苏州大学医学院 药理教研室、苏州中药研究所 ,江苏 苏州　
215007; 3. 江苏大学医学院 机能实验室 ,江苏 镇江　 212001; 4. 香港保健协会 ,香港 )
摘　要:目的　观察槲皮素 ( Que) 对阿尔茨海默病 ( Alzheime r s desease, AD)模型大鼠学习记忆影响并探讨其
与海马细胞凋亡的关系。方法　用立体定位技术对海马 CA1区微量注射喹啉酸 ( QA )造成 AD模型 ; Y形迷宫检测
·632· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
收稿日期: 2002-09-27作者简介:李永金 ( 1968— ) ,男 ,江苏仪征人 ,药理学硕士 ,讲师 ,从事药理学教学科研工作 ,中国药理学会会员 ,江苏省药理学会常务理事 ,主要研究方向为神经药理学。
Tel: ( 0511) 5038157　 E-mai l: l yj3600@ 163. com