全 文 ：竹节参总皂苷对血管痴呆大鼠递质氨基酸及自由基代谢的影响
赵　晖　王　蕾　张秋霞　章红英　(首都医科大学中医药学院 ,北京　100069)
　　〔摘　要〕　目的　观察竹节参总皂苷(TSPJ)对血管性痴呆大鼠学习记忆功能和递质氨基酸 、自由基代谢的影响。方法　双侧颈总动脉结扎制
备血管性痴呆大鼠模型;Moris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力;ELISA法测定海马组织谷氨酸(Glu)及 γ-氨基丁酸(GABA)的含量;生化方法检
测海马组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的含量。 结果　TSPJ可明显改善血管性痴呆大鼠学习记忆功
能 ,提高海马组织 GABA含量 ,降低 Glu/GABA的比值 ,并可增加海马组织抗氧化酶 GSH-Px、SOD活性 ,降低 MDA含量。 结论　TSPJ改善血管性痴
呆大鼠学习记忆能力与调节脑 Glu和 GABA含量 ,改善自由基代谢有关。
〔关键词〕　竹节参总皂苷;血管性痴呆;抗氧化酶;谷氨酸;γ-氨基丁酸
〔中图分类号〕　R277.7　　〔文献标识码〕　A　　〔文章编号〕　1005-9202(2010)21-3096-03
EffectofPanaxJaponicusontransmitteraminoacidsandfreeradicalmetabolisminvasculardementiarat
ZHAOHui, WANGLei, ZHANGQiu-Xia, etal.
ColegeofTraditionalChineseMedicine, CapitalUniversityofMedicalSciences, Beijing100013, China
【Abstract】　Objective　ToobservetheefectsoftotalsaponinsofPanaxJaponicus(TSPJ)onthecapacityoflearningandmemory,
transmiteraminoacidsandfreeradicalmetabolisminratswithvasculardementia(VD).Methods　VDmodelsweresubjectedtobilateral
commoncarotidarteriesligation.LearningandmemoryabilityofanimalwereevaluatedbyMorriswatermazemethod.TheELISAmethodwas
usedtomeasurethelevelsofGluandGammaaminobutyricacid(GABA)inhippocampus, andthecontentsofglutathionperoxidase(GSH-
Px), superoxidedismutase(SOD)andmalondialdehyde(MDA)wereestimatedwithbiochemistrytechnology.Results　TSPJcouldimprove
thecapacityoflearningandmemoryofVDrats, increasethecontentoftheGABAinhippocampus, anddecreasetheratioofGluand
GABA.Meanwhile, treatmentwithTSPJcouldsignificantlyimprovetheactivitiesofGSH-Px, SODandreducethecontentsofMDAinhippo-
campus.Conclusions　TSPJcanimprovetheabilityoflearningandmemoryofVDrats, whichmayberelatedtotheadjustmentofthecon-
tentofGluandGABAandameliorationthemetabolismoffreeoxygenradicalinbrain.
【Keywords】　TotalsaponinsofPanaxJaponicus(TSPJ);Vasculardementia;Antioxidantenzyme;Glutamate(Glu);Gammaami-
nobutyricacid(GABA)
基金项目:北京市优秀人材资助项目(20051D0501823)
第一作者:赵　晖(1973-),女 ,博士 ,副教授 ,硕士生导师 ,主要从事心
脑血管疾病的基础研究。
　　五加科植物竹节参(PanaxJaponicusC.AMeyer)主产于云
南 、四川 、陕西等地 , 是土苗医药的当家药物 ,具有活血化瘀 ,消
肿止痛 , 滋补强壮等多种功效。 清代 《本草纲目拾遗》称其为
“血症良药”。竹节参总皂苷(TotalSaponinsofPanaxjaponicus,
TSPJ)是竹节参根茎中提取的主要有效活性部位 , 其主要成分
包括竹节人参皂甙(chikusetsu-sapnin)Ⅲ 、Ⅳ、Ⅴ , 人参皂甙
(ginsenoside)Rd、Re、Rg1、Rg2及三七皂甙 R2(notoginsenoside
R2)。研究表明 , TSPJ有阻抑脑缺血损伤的作用 〔1 , 2〕。本研究
在前期研究基础上 , 根据竹节参的药效学特点 , 利用血管性痴
呆大鼠 , 研究 TSPJ对其学习记忆功能的影响 , 并从递质氨基
酸 、自由基代谢与认识障碍的关系角度探讨其作用环节。
1　材料与方法
1.1　实验动物　SD雄性大鼠 ,清洁级 , 体重(180 ～ 200)g,由
北京维通利华实验动物技术有限公司提供 , 合格证号:scxkc
(京)72000-0001。实验条件下自然饮食 , 适应环境 3 d后进行
实验。
1.2　药品及试剂　TSPJ由首都医科大学中医药学院中药化
学实验室提供 , 为淡黄色粉末 , 临用前以生理盐水稀释至所需
浓度;阳性对照药尼麦角林片 , 海南赞邦制药有限公司 , 批号
20070408, 临用前用生理盐水配至所需浓度。 大鼠谷氨酸
(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)酶联免疫检测试剂盒为美国 Adlit-
teramDiagnosticlaboratories公司产品;谷胱甘肽过氧化物酶
(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二
醛(MDA)及总蛋白测试盒由南京建成生物工程研究所提供。
1.3　实验仪器　UV-1700分光光度计 , 日本岛津;Biofuge15R
低温离心机 , 德国 Heraeussepatech;JA-1003电子分析天平 , 上
海精科天平厂;DY89-1匀浆器型号 , 宁波新芝生物科技股份有
限公司;02810202水浴锅 ,天津市中环实验电炉有限公司;WH-
861涡旋混匀器 , 北京科尔德科贸有限公司;MultiskanMK3型
酶标仪 , 芬兰 ThermoBioAnalysisCompany;Morris水迷宫 , 中国
医学科学院药物研究所。
1.4　血管性痴呆模型制备及分组　按参考文献 〔3〕 ,实验大鼠
麻醉后 , 仰卧固定 , 颈正中去毛消毒后 , 颈正中切口 , 分离双侧
颈总动脉 , 双重丝线结扎双侧颈总动脉 , 缝合伤口。假手术组
仅游离双侧颈总动脉 ,各组大鼠同条件饲养。 87只雄性 SD大
鼠按体重将实验动物随机分为 6组 , 即假手术组 、模型组 、阳性
药组(尼麦角林片7 mg/kg)、TSPJ组(200、100、50mg/kg),假手
术组为 12只动物 ,其他 5组每组 15只动物。造模后 24h开始
给药 , 1次 /d, 连续给药 55 d后进行学习记忆检测。实验中除
·3096· 中国老年学杂志 2010年 11月第 30卷
假手术组外其他各组均有动物缺失。
1.5　学习记忆功能的测定　利用 Moris水迷宫检测 ,测试前
将平台放置在第Ⅲ象限正中距池壁 22 cm处 , 水深 30 cm(即水
面高出平台表面 1 cm,使大鼠不能见到平台),水温控制在20 ～
21℃之间 ,室温 25℃。实验时要求各种实验条件保持不变。实
验分为 2部分:①隐藏平台获得实验:用于测试大鼠对水迷宫
学习和记忆的获取能力。实验历时 5 d,每天分上下午两段 ,每
段训练 4次 , 记录大鼠在 90 s内成功进驻平台(大鼠找到平台
并滞留其上 5 s为成功进驻)所需时间(即逃避潜伏期)。如在
90 s内大鼠不能成功进驻平台 , 逃避潜伏期为 90 s, 实验者将
其引上平台并令其停留 10 s, 引导其学习与记忆。每只动物共
计训练 20次。计算每天各组 4次逃避潜伏期的平均值。 ②空
间搜索实验:用于测量动物对平台空间位置准确记忆 ,即记忆
保持能力。隐藏平台获得实验结束后(第 6天)撤除平台 , 在站
台的相邻象限将大鼠面向池壁放入水中 , 以原平台所在的象限
(第Ⅲ象限)作为目标区 , 记录30 s时限内各组大鼠在原平台象
限游泳时间与总游泳时间的比值 (tP/tT)和各组大鼠准确穿过
原平台所在位置的次数(穿环次数)。
1.6　海马组织匀浆的制备　每组取 8只大鼠 , 断头处死 , 迅速
在冰盒中分离海马组织 , 称重后放入预冰的生理盐水中 , 冰浴
制成 20%的组织匀浆 , 3 000 r/min, 离心 10 min, 取上清 ,
-20℃冰箱冻存备用。
1.7　抗氧化酶活性 、MDA及总蛋白含量测定　按试剂盒说明
书测定海马组织 GSH-Px、SOD、CAT、MDA, 考马斯亮蓝法测定
蛋白质的含量。
1.8　Glu及 GABAELISA法测定　按试剂盒说明书测定 , 将
20%脑组织匀浆 100 μl分别加入到预先已用 Glu、GABA单克
隆抗体包被的酶标板上;将反应板充分混匀后置 37℃孵育反应
60 min;用洗涤液将反应板充分洗涤 5次 , 每次静置 10 s;每孔
加辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin抗体工作液 100 μl, 将反
应板置 37℃温箱 60min;洗板;每孔加入邻苯二胺(OPD)底物
工作液 100 μl, 置 37℃暗处反应 10 min;每孔加入 1滴终止液
(2 mol/L硫酸)混匀;在酶标仪上 450 nm处测各孔吸光值。
1.9　统计学方法　采用 SPSS10.0统计学软件进行 , 方差分析
以 LSD法进行组间的两两比较。
2　结　果
2.1　TSPJ对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响
2.1.1　隐藏平台获得实验　模型组大鼠搜寻隐藏平台的逃避
潜伏期较假手术组明显延长 , 特别是在第 2、 3、4天训练时段 ,
逃避潜伏期和假手术组相比 , 差异显著(P<0.01, P<0.05);
在第 3天训练时段 , TSPJ(200 mg/kg)和阳性药组寻找隐藏平
台的时间明显比模型组大鼠减少(P<0.05);TSPJ各剂量组和
阳性药组第 4天寻找平台的逃避潜伏期均比模型组明显缩短
(P<0.01);经过训练 , 第 5天各组动物寻找平台的逃避潜伏期
趋于稳定 , 未见明显差异 ,见表 1。
表 1　各组大鼠搜寻隐藏平台的逃避潜伏期比较(x±s)
组别 n 逃避潜伏期(s)d1　　　　　　　　　　d2　　　　　　　　　　d3　　　　　　　　　　d4　　　　　　　　　　d5
假手术组 12 52.31±13.57 30.24±11.70 18.50±9.46 13.73±2.43 13.97±3.12
模型组 9 62.79±10.58 48.75±28.761) 36.22±20.182) 30.26±8.182) 19.49±10.68
TSPJ 11 59.11±19.37 44.24±17.72 24.10±11.913) 16.46±3.904) 14.84±5.45
TSPJ 11 58.81±13.65 43.71±21.31 28.97±11.91 19.19±7.344) 19.57±10.45
TSPJ 9 59.28±12.15 45.01±14.58 27.94±13.21 20.14±5.124) 17.64±6.14
尼麦角林 10 60.90±12.95 36.63±16.31 20.64±6.483) 16.03±3.624) 14.70±5.73
　与假手术组比较:1)P<0.05, 2)P<0.01;与模型组比较:3)P<0.05, 4)P<0.01;下表同
2.1.2　空间搜索实验　经过 5d搜寻隐藏平台的游泳训练 , 各
组动物均对平台在水迷宫的空间位置形成了较强的记忆 ,再次
被放入迷宫中时 , 会在原平台所在范围附近有目的地寻找平
台。实验结果显示 , 虽然各组大鼠在原平台象限游泳时间与总
游泳时间的比值 (tP/tT)没有明显差异。但模型组大鼠准确穿
越原平台所在位置的次数明显比假手术组减少(P<0.01);阳
性药和 TSPJ各剂量组大鼠准确穿越原平台所在位置的次数比
模型组均有不同程度的提高 , 特别是 TSPJ(200、 100 mg/kg)和
模型组差异明显(P<0.01, P<0.05),见表 2。
2.2　TSPJ对血管性痴呆大鼠海马 GABA和 Glu的影响 　
ELISA检测结果显示 , 模型大鼠海马组织 Glu含量和假手术组
没有明显差异 , GABA含量显著降低(P<0.01), GLU和 GABA
比值明显增高(P<0.01);TSPJ治疗组大鼠海马 Glu含量与模
型组相比略有降低趋势 , GABA明显比模型组增高 , 特别是
TSPJ(200、100 mg/kg)与模型组相比差异显著(P<0.05);TSPJ
各剂量组 Glu和 GABA比值均明显低于模型组(P<0.01, P<
0.05),见表 3。
表 2　TSPJ对血管性痴呆大鼠空间探索能力的影响(x±s)
组别 n tP/tT(%) 穿环次数
假手术组 12 0.260±0.062 2.17±1.34
模型组 9 0.211±0.056 0.67±0.502)
TSPJ 11 0.242±0.065 1.55±0.693)
TSPJ 11 0.258±0.067 1.73±0.794)
TSPJ 9 0.276±0.055 1.44±0.73
尼麦角林 10 0.262±0.074 1.70±0.673)
·3097·赵　晖等　竹节参总皂苷对血管痴呆大鼠递质氨基酸及自由基代谢的影响　第 21期
表 3　TSPJ对血管性痴呆大鼠海马 Glu、
GABA的影响(x±s, n=8)
组别 Glu(ng/mgprot)
GABA
(ng/mgprot) Glu/GABA
假手术组 997.73±293.11 12.65±2.32 82.32±30.31
模型组 1 242.489±325.58 8.01±1.642) 167.50±75.912)
TSPJ 1 003.98±213.55 11.27±2.803) 96.04±38.184)
TSPJ 1 136.18±194.13 10.86±2.093) 107.41±24.904)
TSPJ 1 097.31±404.93 9.67±2.47 114.52±31.933)
尼麦角林 1 157.06±392.88 11.53±2.834) 102.26±27.354)
2.3　TSPJ对血管性痴呆大鼠海马抗氧化酶活性及 MDA的影
响　和假手术组比较 , 模型大鼠海马组织抗氧化酶 SOD、GSH-
Px含量显著降低(P<0.05), MDA含量明显升高(P<0.01);
TSPJ各剂量组海马 MDA均明显降低 ,和模型组相比 , 差异显著
(P<0.01, P<0.05), TSPJ200, 100 mg/kg治疗组大鼠海马抗
氧化酶 SOD、GSH-Px较模型组显著提高(P<0.01), TSPJ
50 mg/kg治疗组大鼠 SOD升高明显(P<0.05), GSH-Px与模型
组相比没有统计学差异 ,见表 4。
表 4　TSPJ对血管性痴呆大鼠海马抗氧化酶及
MDA的影响(x±s, n=8)
组别 SOD(U/mgprot)
GSH-Px
(U/mgprot)
MDA
(nmol/mgprot)
假手术组 108.47±9.71 13.64±2.61 3.71±0.72
模型组 77.14±15.041) 7.12±4.261) 7.34±2.172)
TSPJ 121.38±31.074) 16.93±5.594) 5.06±1.134)
TSPJ 134.91±46.184) 23.79±9.824) 4.47±1.424)
TSPJ 109.84±16.493) 12.43±4.87 4.65±1.204)
尼麦角林 115.67±13.7842) 10.07±6.78 5.22±1.654)
3　讨　论
　　大鼠双侧颈总动脉永久性结扎是近年来较常用的一种慢
性低灌注模型 , 双侧颈总动脉结扎早期可造成急性脑缺血 , 动
物通过基底动脉和基底动脉环血流调节以及逐渐形成的侧支
循环来改善和代偿 , 使脑血流量趋于稳定 , 但海马区达不到正
常脑供血水平 , 形成慢性大脑供血不足。 研究表明 , 在低灌注
状态及低代谢状态下认知功能可发生减退 〔4〕 ,我们的实验结果
表明 , 双侧颈总动脉结扎 60 d后空间记忆能力下降 , 隐藏平台
搜索实验的逃避潜伏期延长 , 并在探索实验中定位记忆障碍 ,
穿越平台位置的次数减少 ,说明血管性痴呆大鼠模型的制备是
成功的。慢性低灌注状态下 , 脑组织会产生一系列的损伤级联
反应 , 包括钙稳态失衡 、兴奋性氨基酸的毒性作用 、氧化应激损
伤 、线粒体功能障碍等 , Glu和 GABA作为脑内主要的兴奋性和
抑制性氨基酸递质 , 在大脑皮质 、海马等多个部位的神经元间
既有递质的共存现象 , 又有着复杂的突触间联系 , 二者的比值
反映了一定的功能状态 〔5〕。 Glu过量释放会产生神经毒性。
GABA是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质 , 对 Glu具有
拮抗性 ,能降低神经细胞的兴奋性起到中枢保护作用 , 两者平
衡对维持脑功能至关重要 , 如这个稳态平衡被打破 , 就可能产
生焦虑 、抑郁 、双相情感障碍等精神类疾病 〔6〕。在本次实验中
我们注意到大鼠双侧颈总动脉结扎 60天后 , 学习记忆能力明
显损害 ,海马 Glu含量虽然和假手术组没有统计学差异 , 但 GA-
BA含量显著降低 , Glu和 GABA比值明显增高 , 结果提示慢性
脑缺血引起的学习记忆功能损伤和递质氨基酸的关系不能仅
局限于兴奋性氨基酸蓄积所引起兴奋毒性作用 , 脑缺血后抑制
性神经递质 GABA含量变化及 Glu/GABA的比值失衡与学习
记忆功能缺损关系密切。 TSPJ明显改善拟血管性痴呆大鼠学
习记忆功能 ,治疗组大鼠海马组织 GABA含量增高 , Glu/GABA
的比值降低 ,提示竹节参总皂苷改善学习记忆能力与调节递质
氨基酸 Glu、GABA的比值 ,维持中枢兴奋性与抑制性氨基酸功
能的协调平衡有密切关系。
　　越来越多的证据认为氧应激参与多种神经退行性疾病过
程 ,是导致神经元凋亡和坏死的共同毒理机制 〔7〕。本次实验结
果也表明慢性低灌注血管性痴呆大鼠海马组织脂质过氧化产
物 MDA含量明显增加 ,抗氧化酶 SOD、GSH-Px的含量明显比
假手术组下降。结合行为学测试结果 ,可以推测机体活性氧的
产生过多或 /和机体抗氧化能力下降 , 活性氧的清除不足是导
致慢性低灌注后 , 神经细胞的损伤 , 认知功能下降的主要病理
机制。 TSPJ可提高海马组织抗氧化酶 SOD、GSH-Px活性 , 降低
MDA含量 ,结果表明 TSPJ能够通过抗氧化作用 ,改善血管性痴
呆大鼠的学习记忆能力 , 为 TSPJ的广泛应用提供了新思路。
　　综上所述 , TSPJ提高血管痴呆模型大鼠学习记忆功能与调
节 Glu/GABA的比值 ,维持中枢兴奋性与抑制性氨基酸功能的
协调平衡 ,改善自由基代谢有密切关系。
4　参考文献
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〔2010-02-05收稿　 2010-04-14修回〕
(编辑　李相军 /张　慧)
·3098· 中国老年学杂志 2010年 11月第 30卷