全 文 ：·药理实验与临床观察·
重组水蛭素体内抗凝活性的实验研究
吕　莉 1 ,李欣燕 1 ,韩国柱 1 ,汪和睦 2
( 1. 大连医科大学 药理教研室 ,辽宁 大连　 116027; 2. 南开大学 生物物理教研室 ,天津　 300072)
摘　要: 目的　研究重组水蛭素的抗凝活性 ,为水蛭素新药开发提供实验依据。 方法　家兔 iv重组水蛭素前及后
心脏采血 ,应用血凝仪测定凝血酶时间 ( T T)、凝血酶原时间 ( PT )和活化的部分凝血活酶时间 ( APTT ) ,并考察
其抗凝活性的量效和时效关系。结果　重组水蛭素能明显延长 TT和 APTT ,且呈剂量依赖性 ,但在所试剂量范围
内对 PT无明显影响 ;其延长 T T和 APTT的作用随时间而下降 ,作用持续时间约 60 min。 结论　重组水蛭素具
有明显抗凝作用 ,明显强于现有抗凝药肝素 ,且其作用强度与同剂量德国产基因重组水蛭素 Refludan相同。
关键词: 水蛭素 ;基因重组水蛭素 ;抗凝 ;凝血酶时间 ;凝血酶原时间 ;活化的部分凝血活酶时间
中图分类号: R286. 32　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 06 0520 03
Experimental studies on in vivo anticoagulant activity of recombinant hirudin in rabbits
LU Li1 , L I Xin-yan1 , HAN Guo-zhu1 , WANG He-mu2
( 1. Depar tment of Pha rmaco lo gy , Da lian Univ er sity o f Medical Sciences, Da lian Liaoning , 116027, China;
2. Depar tment of Biophy sics, Nankai Unive rsity , Tianjin 300072, China )
Abstract: Object　 To study the anticoagulant activi ty of recombinant hi rudin ( rH) made in China and
to provide the experimental basis fo r the development of hirudin. Methods　 Thrombin time ( TT ) , pro-
thrombin time ( PT) and activa ted pa rtial thromboplastin time ( APT T) w ere determined by coagulometer
fo r rabbi t blo od samples collected befo re and af ter iv rH. The percent of leng thening above coagulation
time parameters w as calculated and used to investig ate the dose-and time-ef fect relationship of rH. Results
The TT and APT T w ere pro longed remarkably by rh , w hi le PT no t wi thin the test range, in a dose-
dependent manner, and the action duration w as about 60 min. Conclusion　 Domestic rH ( N -Ile1-Thr2-r-
hirudin) has obv ious antico agulant ef fects. Its po tency is much higher than hepa rin, and identical to that
o f Refludan (N -Leu1-r-hirudin) , which was an autho rized rH product made in Germany.
Key words: hi rudin; recombinant hi rudin ( rH) ; anti thrombo tic effect; th rombin time ( TT ) ; pro-
thrombin time ( PT) ; activa ted par tial thromboplastin time ( APT T)
　　水蛭素 ( hi rudin)是活血化瘀中药水蛭的唾液
腺分泌的一种由 65个氨基酸组成的酸性多肽 ,是
高度特异的凝血酶抑制剂 [1, 2 ]。对多种血栓疾病如静
脉血栓、弥散性血管内凝血、脑栓塞、血栓静脉炎及
冠状动脉血栓都有预防和治疗效果 ,特别是对外科
手术后及栓塞治疗后的再栓塞有重要的预防和治疗
效果 [ 3～ 5]。目前国内外采用基因重组技术研制水蛭
素取得了令人瞩目的进展。 国内有关单位采用甲基
营养型汉逊酵母真核表达系统研制出的重组水蛭素
( r-hirudin, rH) 为国内外首创 ,与天然水蛭素 Ⅰ
型 (N -端为 Val1-Val2 )不同之处除 rH-63位酪氨酸
脱硫酸基外 ,N末端 -为 N -Ile1 -Thr2型 ,与欧美等国
研制的重组水蛭素在 N末端的 1, 2位有所不同。本
文研究了此种 rH对家兔凝血时间参数的影响 ,旨
在了解 rH的体内抗凝活性 ,为水蛭素新药开发提
供实验依据。
1　材料
1. 1　药物:重组水蛭素 ( r-hirudin, rH) ,大连高新
生 物 制 药 公 司 研 制 , 批 号 990501; 肝 素 钠
( heparin) ,上海生物化学制品厂产品 ,批号 870516;
·520· 中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2002年第 33卷第 6期
收稿日期: 2002-01-03
基金项目:国家“九五”科技攻关计划资金资助 ( 96-C02-01-05A)
作者简介:吕莉 ( 1972-) ,天津市人 ,第四军医大学附属吉林军医学院药理教研室 ,助教 ,从事药理教学与研究 ,现为大连医科大学在读硕
士研究生 ,发表论文 3篇。
* 通讯作者　 E-mai l: h gzhmy3@ mail. dlpt t. ln. cn
Refludan (注射用 r-DN A Lepirudin,即 N -Leu1-
Thr
2
-r-hirudin) ,德国 Hoechst公司的重组水蛭素
产品 ,批号 97035004。
1. 2　试剂: 凝血酶 ,天津血液研究所产品 ,批号
9810;凝血活酶 ,美国 Behring 公司产品 ,批号
T PC-426;活化的部分凝血活酶试剂 ,美国 IL公司
产品 ,批号 N 1075650;枸橼酸钠 ,浙江杭州萧山化
学试剂厂产品 ,批号 910527。
1. 3　动物:大耳白兔 ,雄性 ,体重 2. 0～ 2. 5 kg ,由
大连医科大学动物中心提供 (合格证号:辽实动字第
022号 )。
1. 4　仪器: CA-100型血凝分析仪 ,日本 Sysmax医
用电子仪器有限公司。
2　方法
2. 1　量效关系: 家兔 36只 ,随机均分 6组: rH
100, 50, 25和 12. 5μg /kg 组 ,阳性对照药肝素 50
μg /kg组以及强度对比药 Refludan 50μg /kg组。家
兔经耳缘 iv 药物前及后 5 min自心脏取血 1. 2
m L,以 3. 8% 枸橼酸钠抗凝 ( 9∶ 1) ,混合后以
1 500 r /min离心 5 min,分取血浆 ,应用血凝仪按
文献 [6, 7 ]方法测定凝血酶时间 ( Thrombin Clot
Time, T T)、凝血酶原时间 ( Pro thrombin Time,
PT)和活化的部分凝血活酶时间 ( Activa ted Pa r-
tial Thromboplastin Time, APTT)。T T测定中 ,如
超过 120 s或不凝则按 120 s计 [6 ]。比较给药前后各
血凝时间参数的变化 ,从而了解 rH的抗凝作用。
2. 2　时效关系: 家兔 12只 ,随机均分 2组: 给药组
iv国产 rH 50μg /kg ,对照组 iv等容量生理盐水。家
兔经耳缘 iv 药物前和后 5, 15, 30, 60, 120及 240
min 分别自心脏采血 ,同上法测定 TT、 PT 和
APT T。
3　结果
3. 1　量效关系:如表 1所示。家兔 iv上述 4种不同
剂量的国产 rH后除 PT 无明显变化外 , T T 和
APT T均明显延长 ,并呈明显剂量依赖关系。 剂量
由高到低 T T 延长分别为 857. 70%、 435. 61% 、
32. 35% ( P < 0. 01)和 16. 65% ( P> 0. 05) , APT T
延 长 分 别 为 221. 15% 、 110. 69% 、 66. 03% 和
30. 44% ( P < 0. 01) , PT 延长分别为 0. 55% 、
3. 02%、 - 2. 17% 和 3. 10% ( P> 0. 05)。 肝素、
Ref ludan iv 50μg /kg后 T T、 APT T和 PT分别延
长 37. 35%、 50. 35% ( P < 0. 01)和 - 1. 66% (P>
0. 05) 以及 331. 61%、 106. 74% ( P < 0. 01) 和
- 6. 38% (P> 0. 05)。
表 1　 iv rH对家兔血凝时间参数的影响 ( x± s , n= 6)
组别 剂量
(μg /kg)
T T
给药前
( s)
给药后 5 min
( s)
延长
(% )
PT
给药前
( s )
给药后 5 min
( s )
延长
(% )
APTT
给药前
( s)
给药后 5 min
( s)
延长
(% )
rH 100 12. 53± 2. 01 120. 00± 0. 00* * △ 857. 70 9. 05±1. 53 9. 10± 1. 22 0. 55 35. 98±2. 24 115. 55± 14. 81* * 221. 15
50 11. 15± 1. 42 59. 72± 47. 56* * ▲△△# # 435. 61 9. 27±1. 45 9. 55± 1. 55 3. 02 36. 58±1. 63 80. 73± 6. 13* * ▲# # 110. 69
25 10. 82± 1. 57 14. 32± 1. 92* * 32. 35 8. 28±1. 05 8. 10± 1. 03 - 2. 17 36. 38±2. 42 60. 40± 4. 10* * 66. 03
12. 5 10. 93± 2. 59 12. 75± 3. 08 16. 65 8. 07±1. 15 8. 32± 1. 17 3. 10 34. 17±1. 63 44. 57± 2. 56* * 30. 44
Ref ludan 50 16. 48± 1. 76 71. 13± 39. 07* * △△ 331. 61 8. 47±1. 38 7. 93± 1. 23 - 6. 38 37. 68±5. 52 77. 90± 7. 35* * 106. 74
肝素 50 11. 38± 0. 70 15. 63± 2. 94* * 37. 35 8. 42±0. 65 8. 28± 0. 83 - 1. 66 35. 37±2. 86 53. 18± 4. 46* * 50. 35
　　与给药前相比: * * P < 0. 01;　与 Ref ludan相比: ▲ P> 0. 05;　与肝素相比: # # P < 0. 01;　△ 6只家兔血浆全不凝 ; △△ 6只家兔有 2只
家兔血浆不凝
3. 2　时效关系:如表 2、图 1所示。 家兔 iv rH 50
μg /kg后 5, 15, 30, 60, 120和 240 min TT延长分
别 为 549. 21%、 72. 08% ( P < 0. 01 )、 12. 67%、
14. 06% ( P < 0. 05 ) 和 5. 74%、 6. 24% ( P >
0. 05) ,说明 T T的延长随时间急剧下降 , 60 min后
T T 已接近给药前数值。 APTT 延长分别为
126. 74%、 78. 16%、 45. 66% 、 20. 15% ( P < 0. 01)
和 5. 70% 、 6. 01% ( P> 0. 05)。 APT T最大延长不
及 T T,但呈缓慢平稳下降。与上述两种时间参数不
同 ,药后各时间点 PT均无明显变化 ( P> 0. 05)。生
理盐水组不同时间的 TT、 PT、 APTT与注射生理
盐水前相比均无显著变化 ( P> 0. 05) ,说明如上心
脏采血对上述血凝时间参数无明显影响。
图 1　 rH对家兔 TT、 PT及 APTT影响的时-效曲线
4　讨论
4. 1　本研究表明国产 rH具有明显的抗凝作用 ,和
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肝素一样能显著延长 T T和 APTT,但对 PT无延 长作用 ,说明水蛭素在本实验剂量范围内作用于内
表 2　 iv 50μg /kg rH后不同时间对家兔血凝时间参数的影响 (x± s, n= 6)
组　别 采血时间
( min)
T T
T T ( s) 延长 (% )
PT
PT ( s ) 延长 (% )
APT T　　
APTT ( s) 延长 (% )
生理盐水 药　前 10. 78± 0. 47 -　 9. 8± 1. 57 -　 35. 53± 2. 46 -　
药后 5 11. 68± 0. 75 8. 35 9. 3± 1. 20 - 5. 10 36. 52± 2. 58 2. 79
药后 15 11. 08± 0. 64 2. 78 9. 28± 1. 44 - 5. 31 37. 28± 3. 41 4. 93
药后 30 11. 33± 1. 48 5. 10 9. 10± 1. 14 - 7. 14 36. 08± 4. 27 1. 55
药后 60 11. 17± 1. 58 3. 62 8. 48± 0. 77 - 13. 47 35. 15± 5. 17 - 1. 07
药后 120 11. 25± 1. 66 4. 36 8. 33± 0. 69 - 15. 00 37. 77± 3. 35 6. 30
药后 240 10. 63± 1. 06 - 1. 39 9. 13± 1. 58 - 6. 84 34. 80± 3. 23 - 2. 05
r H 药　前 10. 10± 1. 10 -　 9. 63± 0. 68 -　 34. 93± 2. 67 -　
药后 5 65. 57± 43. 33* * △△ 549. 21 9. 63± 1. 09 0. 00 79. 20± 4. 43* * 126. 74
药后 15 17. 38± 12. 41* * 72. 08 9. 30± 0. 83 - 3. 43 62. 23± 6. 49* * 78. 16
药后 30 11. 38± 1. 41* 12. 67 9. 63± 0. 56 0. 00 50. 88± 3. 79* * 45. 66
药后 60 11. 52± 1. 48* 14. 06 9. 00± 0. 53 - 6. 54 41. 97± 2. 43* * 20. 15
药后 120 10. 68± 0. 79 5. 74 9. 33± 1. 10 - 3. 12 36. 92± 3. 00 5. 70
药后 240 10. 73± 1. 35 6. 24 9. 55± 1. 49 - 0. 83 37. 03± 1. 92 6. 01
　　　　与给药前相比: * P < 0. 05　* * P < 0. 01;　△△ 6只家兔有 2只家兔血浆不凝
源性凝血通路 ,而对外源性凝血通路无作用。这与国
外报道 [7 ]一致。
4. 2　 rH对 T T和 APTT的延长作用明显强于同
剂量 ( 50μg /kg ) 的阳性对照药肝素 ,以 T T计强
10倍以上 ;以 APTT计强约 2倍以上。
4. 3　 rH对 T T的延长持续时间甚短。 TT延长随
时间推移急剧下降 ,至 60 min时已接近药前水平 ,
且量效关系的线性范围较窄 ,个体差异亦较大。当
rH剂量由 12. 5增至 25μg /kg时 , T T值由 12. 75
增至 14. 32 s;但当剂量由 25增至 50μg /kg时 , 6
只家兔中有 2只的血样不凝 ,导致 T T值标准差与
均值接近 ;至 100μg /kg剂量时 ,全部家兔血样均不
凝 ,由量反应转为质反应。与 TT不同 , APTT的延
长较平稳 ,持续时间较长 ,且呈良好的剂量依赖性和
较宽的线性范围 ,个体差异较小。故 rH的临床抗凝
治疗应象肝素一样采用 APT T而不是 T T作为治
疗药物监测的指标 [8 ]。
4. 4　 Ref ludan是德国 Hoechst公司的基因重组水
蛭素产品 Lepirudin的商品名 ,是由 65个氨基酸组
成的多肽 , N 末端为 Leu1-Th r2[ 9] ,已经上市并应用
于临床 ,是国际公认的重组水蛭素权威产品。受试国
产 rH的结构与 Refludan仅在 N -末端第一位氨基
酸有所不同 (前者为 Ile、后者为 Leu) ,但其对 TT
和 APT T 的延长作用与同剂量 Ref ludan一致
(P> 0. 05) ,说明国产 rH与国外权威产品作用强度
相同。另外 ,两种重组水蛭素对 PT均无影响。这些
似乎说明将水蛭素 N -末端第一位氨基酸以 Ile替
换 Leu不致影响水蛭素的抗凝活性。
参考文献:
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