全 文 ：·1202· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月
研究，是目前先进的细胞形态、功能研究手段[1⋯。
本实验所采用的荧光探针为Ao，它可以对活
细胞进行染色。AO染料具有可以被可见光激发，及
激光淬灭率低的特点。LSCM利用AO渗透到细胞
内部，有选择性地与活细胞的不同成分结合，图像中
DNA为绿色荧光，RNA为红色荧光，计算机对获
得的细胞荧光强度进行分析，不仅能得到较光学显
微镜分辨率高的细胞形态的组分分布的清晰图像，
而且可动态观察细胞内代谢的变化。可以处理活的
标本，不会对标本造成物理化学性质的破坏。
通过激光束对样品进行扫描建立的共聚焦图
像[1]，不仅显示出不同切面DNA和RNA分布和比
值的变化，而且更直观地显示细胞受损后DNA和
RNA的变化。更接近细胞的生活状态。本实验结果
表明小鼠sc龙葵碱剂量达到37．50mg／kg时，S。。。
和H：：小鼠肿瘤细胞RNA水平明显降低，DNA水
平明显增高，表明肿瘤细胞内DNA转录形成RNA
的代谢受到抑制，这也意味着肿瘤细胞内基因产
物——蛋白质的合成受阻，从而抑制肿瘤细胞的生
长。给药组RNA和DNA的比值与阴性对照组比
较差异显著(P<0．01)，证明37．50、18．75mg／kg
龙葵碱对S。。。和H：：小鼠肿瘤细胞DNA和RNA的
代谢有逆转作用。
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西红花酸对体外蛋白质非酶糖基化的抑制作用
王雅娟，钱之玉+，沈祥春
(中国药科大学药理教研室，江苏南京210009)
摘要：目的研究西红花酸对体外蛋白质非酶糖基化的影响。方法 以牛血清白蛋白(BSA)质量浓度、葡萄糖
质量浓度及温孵时间为3因素，采用3因素4水平正交设计，通过方差分析寻找体外非酶糖基化的最适反应体系，
以此最适体系观察西红花酸对非酶糖基化的影响。结果糖基化蛋白产量与BSA质量浓度、葡萄糖质量浓度、温
孵时间呈正相关；方差分析结果提示，5g／LBSA、4．5mg／mL葡萄糖及14d的温孵时间为蛋白质体外非酶糖基化
的最佳条件；荧光值测定和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGEs)均表明西红花酸对体外蛋白质非酶糖基化具有显
著的抑制作用。结论西红花酸对体外蛋白质的非酶糖基化具有明显的抑制作用；这可能是西红花酸具有广泛的
心血管药理活性及改善胰岛素抵抗的重要机制之～。
关键词：西红花酸；非酶糖基化；正交设计；聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGEs)
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)08—1202—04
收稿日期：2005—01—31
作者简介：王雅娟(1980)，女，安徽合肥人，中国药科大学硕士研究生，主要研究方向为生化药理与中药新药研发。
*通讯作者钱之玉Tel：(025)83271322
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月·1203·
Inhibitionofcrocetinonnonenzymaticglucosylationofproteininvitro
WANGYa—juan，QIANZhi—yu，SHENXiang—chun
(DepartmentofPharmacology，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210009，China)
Keywords：crocetin；nonenzymaticglucos l on；orthogonaldesign；SDS—PAGEs
蛋白质非酶糖基化是目前公认的糖尿病并发症
的主要发病机制之一，也是组织器官老化的重要病
理基础[1]，蛋白质非酶糖基化过程与多元醇通路激
活、氧化应激及蛋白激酶C(PKC)激活相互影响、
相互制约，且都与自由基的产生有极大关系[2’3]。许
多具有活血化瘀作用的中药对非酶糖基化都有抑制
作用[4]，并且非酶糖基化过程与氧化应激具有一定
的关系[5]。西红花是鸢尾科植物西红花Crocus
sativusL．的干燥柱头，具有活血化瘀的功效。西红
花酸为其主要有效成分之一，是多不饱和脂肪酸的
类胡萝卜素类物质，具有明显的抗氧化、清除自由基
作用，对心血管系统具有广泛的药理活性[6~8]；本研
究小组发现西红花酸对多个模型的糖尿病胰岛素具
有明显的改善作用[9]。结合中医药改善胰岛素抵抗
的研究热点，本实验采用体外非酶糖基化体系，研究
西红花酸改善胰岛素抵抗的可能机制。
1材料与方法
1．1 药品与试剂：西红花酸(本实验室精制，HPLC
法测其质量分数>90％)；小牛血清白蛋白(BSA，
Sigma公司)；叠氮钠(NaN。)和磷酸钠缓冲液
(PBS，pH7．4)为南京试剂一厂生产；葡萄糖为惠
兴生化试剂有限公司产品；其余试剂均为市售分析
纯。
1．2蛋白质非酶糖基化：在PBS中加入BSA，使其
终质量浓度分别为5、2．5、2、1g／L[1⋯，葡萄糖终质
量浓度分别为4．5、1．5、0．5、0．1mg／mL[1“，并加入
终浓度为3mmol／LNaN。防腐，温孵时间分别为7、
14、21和28d，按3因素4水平正交表(表1)设计进
行16组试验，每组设3个复孔，放人37C孵箱温
孵，分别于7、14、21、28d取标本，测定糖化白蛋白。
表1因素水平
Table1 Factorsandlevels
水平
因素
ABSA9／(g·L一1)B葡萄糖p／(mg·mL_1)C温孵时19／d
1．3药物干预试验：在PBS中加入5g／LBSA、
4．5mg／mL葡萄糖，并加入NaN。防腐，再加入西红
花酸使其终浓度分别1×10一、5×10、1×10-7
mol／L；阳性对照组加入葛根素(1mg／mL)；另设
空白对照，即：①不加西红花酸的完整糖基化系统
(模型组)；②加西红花酸但不含BSA(无蛋白组)；
③加西红花酸但不含葡萄糖(无糖组)。每组设5个
复孔，糖基化和各对照体系均在37‘C恒温、密封条
件下反应。14d后，测定各管的糖化白蛋白的荧光
值(结果以z土S表示，组间比较采用t检验)。取各
组溶液5肛L，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—
PAGEs)。
1．4 糖化白蛋白的测定：采用荧光微孔检测仪
(SPECTRAMAXXS，美国MD公司)测定各管荧
光值。各参数分别为激发波长370nm，发射波长
440nm，灵敏度2，增益5[1⋯，缝宽8～10mm[12。。
2 结果
2．1 BSA质量浓度、葡萄糖质量浓度、温孵时间对
蛋白质体外非酶糖基化的影响：3因素4水平正交
设计结果及方差分析见表2和3。从实验结果的R
值可以看出，各因素对结果影响由大到小的次序是
(BSA质量浓度)>c(温孵时间)>B(葡萄糖质
量浓度)，B和C因素对结果影响无显著性。可以看
出，若增加BSA和葡萄糖质量浓度，尤其是BSA质
量浓度，糖化白蛋白的量将增加更明显。温孵时间对
结果未见明显影响，为节省时间，并参照文献报
道[9’1⋯，确定5g／LBSA、4．5mg／mL葡萄糖及温
孵时间14d为蛋白质体外非酶糖基化的最佳条件。
2．2药物对蛋白质体外非酶糖基化的干预作用
2．2．1糖基化终产物(AGEs)荧光值测定：西红
花酸对体外非酶糖基化体系的荧光值具有明显的降
低作用(P花酸对蛋白质体外非酶糖基化具有明显的抑制作
用，和葛根素组相当。结果见表4。
2．2．2AGEs的SDS—PAGEs图谱测定：结果见图
1。模型组相对分子质量66000的蛋白条带扩散增
粗，而各给药组有明显改善。
3讨论
蛋白质的非酶糖基化是体内的葡萄糖、果糖及
6～磷酸葡萄糖等酮糖与体内多种蛋白质，尤其是长
寿命蛋白质(如胶原蛋白、基质蛋白等)发生非酶
催化的糖基化作用，首先生成Schiff碱，继而发生
万方数据
·1204· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月
表2 L。。(45)正交试验安排和结果(n一3)
Table2 DesignandresultsofL16(45)
orthogonaltest(捍一3)
方差来源离差平方和自由度 方差 F值 |P
表4西红花酸对体外蛋白质非酶糖基化的
作用(；±s，n一5)
Table4 Effectofcrocetinonnonenzymaticglycosylation
ofproteininvitro(；±s，万一5)
与无糖组比较：。P<0．05一P<0．01
与模型组比较：AAp<0．01
。P<0·05。+P△△P<0．01VSmodelgroup
重排生成Amadori产物，再降解成为a一酮醛复合
物，它比单糖更容易与蛋白质反应，经Mailard反应
生成棕褐色、具有荧光性的糖基化终末产物
一li6000
+-66000
—45000
—35000
—25000
—28400
—14400
1～3一西红花酸(1×10一、5×10～、1×10mol／I一)组
4一无药组(模型组)5-西红花酸(1×10“tool／L)无蛋白组
6一西红花酸(1×10—6mol／L)无糖组7一无蛋白组8一无糖组
9一葛根素(1mg／mL)组10一Marker
1--3一crocetin(1×10—6，5×10—7，and1×10—7tool／L)groups
4一no—druggroup(modelgroup)5一crocetin(1×10
6 mol／L)
withoutproteingroup6一crocetin(1×10
6 mol／L)without
glucosegroup7-no——proteingroup8-no—-glucosegr up
9一puerarin(1mg／mL)group10一Marker
图1 SDS—PAGEs图谱
Fig．1EleetrophoretogramofSDS—PAGEs
(AGEs)[33。AGEs在组织中形成和沉积后，引起组
织的老化和功能衰退，在晶状体表现为白内障；在结
缔组织表现为组织弹性降低、硬度增加，血管基底膜
的糖基化则与老年性血管病变和糖尿病微血管病变
有关。低密度脂蛋白(LDL)的糖基化修饰与高血
脂症、糖尿病心血管并发症有密切关系。在糖尿病患
者，糖基化的速度与正常人相比大大加快，与糖尿病
微血管并发症密切相关[13|。AGEs还可通过与内皮
细胞、单核巨噬细胞等细胞膜上的特异性受体结合
而引起细胞因子、激素、氧自由基等可溶性信号物质
的改变，导致多种蛋白质基因表达水平的改变[13I，
对机体造成极大的伤害。
本实验研究了BSA质量浓度、葡萄糖质量浓度
及温孵时间对体外蛋白质非酶糖基化的影响，根据
3因素4水平正交设计表设计16组实验，并将实验
结果进行统计学处理，选出了最适条件，结果与有关
报道一致[3’1川。
本室研究发现，西红花酸对心血管系统具有广
泛的药理活性，对氧化低密度脂蛋白(ox—LDL)及
其他各种氧化应激所致的损伤具有明显的保护作
用[1“。也有报道，西红花酸具有与蛋白结合，从而保
护蛋白质避免氧化的作用[15|。本研究发现西红花酸
可以明显降低体外蛋白质非酶糖基化系统的荧光
值，SDS—PAGEs结果也表明西红花酸各用药组糖
化蛋白明显减少，提示其可能对体外的非酶糖基化
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月·1205·
反应具有抑制作用。非酶糖基化作用与心血管系统
疾病相关密切，因此推测西红花酸对非酶糖基化反
应的抑制作用可能是其具有广泛心血管药理活性的
原因之一。但西红花酸对于体内的非酶糖基化的影
响及细胞水平的作用，以及其作用机制等D6,17]还有
待进一步探索。
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湖北贝母生物碱单体的镇咳、祛痰和平喘作用
张勇慧1，阮汉利1，皮慧芳1，蔡金艳1，曾凡波1，赵薇2，吴继洲p
(1．华中科技大学同济药学院，湖北武汉430030；2．武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉430071)
湖北贝母FritillariahupehensisHsiaoetK．C．
Hsia收载于《中国药典))2000年版一部中，是仅次于
浙贝母的第二大贝母主流品种。在药理研究方面，熊
玮等[13初步研究表明其乙醇提取物对多种平滑肌有
明显松弛作用，对豚鼠有平喘作用，能提高小鼠耐受
常压缺氧能力，其总生物碱对平滑肌的作用、对猫血
压及心肌的作用与阿托品相似。本课题组通过系统
的镇咳、祛痰、平喘药效学筛选，发现湖北贝母呼吸
系统的药效学活性部位在总生物碱，并对其提取工
艺进行了优化。本实验研究湖北贝母中各生物碱单
体在等剂量条件下的镇咳、祛痰、平喘活性，期望能
够寻找到一种天然、高效、低毒的镇咳、祛痰、平喘
药物。
1材料与仪器
1．1动物：昆明种小鼠，雌雄各半，体重(20±2)
g；豚鼠，体重150～220g，均由本校实验动物中心
提供。
1．2仪器：402型超声雾化器，超声波清洗器。
1．3药物：湖北贝母生物碱单体鄂贝甲素、鄂贝乙
素、浙贝甲素、浙贝乙素、湖贝甲素苷、湖贝甲素、鄂
贝新均由吴继洲教授提供，均为色谱纯。湖北贝母总
生物碱(总碱)系从湖北贝母中采用常规溶剂法直
接提取，生药材中的质量分数为0．49％，主要成分
为浙贝乙素、湖贝甲素等11种生物碱单体。采用等
收稿日期：2004一10—24
基金项目：湖北省科技厅重大社会发展基金资助项目(972P1102)
作者简介：张勇慧，男，博士，副教授，主要从事天然活性成分及中药新药开发研究。
*通讯作者吴继洲Tel：(027)83692739
万方数据
西红花酸对体外蛋白质非酶糖基化的抑制作用
作者： 王雅娟， 钱之玉， 沈祥春， WANG Ya-juan， QIAN Zhi-yu， SHEN Xiang-chun
作者单位： 中国药科大学,药理教研室,江苏,南京,210009
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(8)
被引用次数： 10次

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6.王建梅.向敏.吴萍萍 熊果酸对蛋白质体外非酶糖基化反应的影响[期刊论文]-中国现代医学杂志 2011(2)
7.邓远雄.何丽华.万思婷.陈波.谢青季.陈玉霜.赵冰清.陈蓉 黄连解毒汤对体内外晚期糖基化终产物形成的影响
[期刊论文]-中草药 2011(1)
8.邓远雄.何丽华.万思婷.陈波.谢青季.陈玉霜.赵冰清.陈蓉 黄连解毒汤对体内外晚期糖基化终产物形成的影响
[期刊论文]-中草药 2011(1)
9.宋丽雅.来吉祥.信璨.魏少敏.董银卯.何聪芬 抑制非酶糖基化反应体外实验方法的建立及应用[期刊论文]-日用
化学工业 2012(3)
10.彭立伟.来吉祥.何聪芬.董银卯 非酶糖基化与皮肤衰老的研究进展[期刊论文]-中国老年学杂志 2010(20)
11.刘东博.潘明佳.张艳军.陈常青 西红花酸主要药理作用及其机制研究进展[期刊论文]-中草药 2007(12)


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