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黑穗醋栗多糖抗氧化及抑制非酶糖基化活性的研究



全 文 :黑穗醋栗多糖抗氧化及抑制非酶糖基化活性的研究
于泽源1,任中杰1,徐雅琴2,李兴国1
( 1.东北农业大学园艺学院,哈尔滨 150030;2.东北农业大学理学院,哈尔滨 150030)
摘 要:从清除超氧阴离子自由基、清除羟自由基、清除DPPH自由基 3个方面研究黑穗醋栗多糖体外抗
氧化活性,VC作对比,并通过NBT还原试验、二羰基化合物测定试验、非酶糖基化终产物荧光性测定试验,
分别测定黑穗醋栗多糖对糖基化的干预作用,以明确黑穗醋栗多糖体外抗氧化作用及抑制非酶糖基化能力。当
黑穗醋栗多糖浓度为 1.0 mg·mL-1时,对DPPH清除率为 46.20%,对OH·,O2-·的清除能力较强,其 IC50分别为
0.976和 0.3931 mg·mL-1,对非酶糖基化反应 3个阶段的抑制率分别为 34.78%、30.80%和 43.14%。结果表明黑穗
醋栗多糖具有抗氧化活性,且抗氧化能力随浓度的增加而增强,呈量效关系,同时也表现出一定的抑制非酶糖
基化的活性。
关键词:黑穗醋栗;多糖;抗氧化性;非酶糖基化反应
中图分类号:S663.2 文献标志码:A 文章编号:1005-9369(2012)10-0073-06
Study on antioxidant and anti-non-enzymatic glycation activity of
black current polysaccharides/YU Zeyuan1, REN Zhongjie1, XU Yaqin2, LI Xingguo1
(1. School of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. School of Science,
Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)
Abstract: The polysaccharides antioxidant activity in vitro were measured by the fenton method,the
pyrogallol self-oxidation method and DPPH reduction method,and VC for reference. The inhibitory effect of
polysaccharides on the three periods of non-enzymatic glycation reaction were investigated by NBT reductive
assay, measurement of dicarbonyl compounds and the fluorescence of advanced glycation end products. The
antioxidant activities of black current polysaccharides in vitro and the inhibitory effect of polysaccharides on
non-enzymatic glycation activity were investigated in this study. When the concentration was 1.0 mg·mL-1, the
scavenging rate of DPPH radical reached 46.20%, the removal oxdative activity of the OH·, O2-·were IC50 0.976
and 0.3931 mg·mL-1, respectively. The three stages of non-enzymatic glycosylation reaction inhibition rate was
34.78%, 30.80%, and 43.14%. The results showed that the antioxidant activities of polysaccharides increased with
收稿日期:2012-05-06
基金项目:农益性行业(农业)科研专项(201103037);东北农业大学博士启动基金
作者简介:于泽源(1961-),男,教授,博士,博士生导师,研究方向为果树生理和贮藏加工。E-mail: yzy@neau. edu. cn
Journal of Northeast Agricultural University
东 北 农 业 大 学 学 报第43卷 第10期 43(10): 73~78
2012年10月 Oct. 2012
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方果树, 2010(3): 1-3.
黑穗醋栗(Ribes nigrum L.)又称黑豆果、黑加
仑,系虎耳草科茶藨子属一种多年生小灌木,其
果实营养丰富,富含多糖、有机酸、维生素、黄
酮、矿物质、氨基酸、脂肪酸等营养成分 [1-2]。多
糖是指由10个或10个以上单糖聚合而成的一类生
物大分子。研究发现多糖不仅具有抗癌、抗炎、
抗病毒、抗衰老等多方面药理活性,加之多糖本
身低毒、来源广泛,已成为近年来的研究热点。
黑穗醋栗多糖具有一定抗氧化作用,可改善血
液循环、降血压、阻遏血栓形成、延缓衰老、
保护视力和神经系统,能很好地预防心脏病和
癌症等多种疾病 [3]。国内对黑穗醋栗抗氧化活性
方面的报道较少。在非酶促条件下,蛋白质游离
氨基与还原糖的羰基经过一系列反应可以产生稳
定的糖基化终产物 AGEs(Advanced glycosylation
end products)。非酶糖基化及AGEs与衰老过程中
发生的多种组织器官衰退,以及多种老年疾病的
发生有密切联系,对人体造成严重危害[4-5]。研究
表明,玄参、丹参、番泻叶、柴胡、麻黄等中药
类多糖对非酶糖基化有不同程度的抑制作用 [6-7]。
石榴、仙人掌、黄精多糖等多糖类物质对蛋白
质非酶糖基化过程也有一定的抑制作用 [8-10]。但
至今尚未有关于黑穗醋栗多糖抑制非酶糖基化的
报道。
本文研究黑穗醋栗多糖的抗氧化性以及非酶
糖基化反应中Amodori产物形成阶段、二羰基化合
物形成阶段和终产物AGEs形成阶段的抑制作用,
旨在为合理利用黑穗醋栗植物资源,进一步开发
黑穗醋栗保健效用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品与主要试剂
黑穗醋栗(黑丰)采于东北农业大学园艺实验
站;牛血清蛋白(购自华美生物工程公司);1,1-
二苯基苦基苯肼(DPPH)(购自 Sigma公司);NBT
(氯化硝基四氮唑兰)及其他试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器
T6新悦-可见分光光度计(北京普析通用仪器
有限责任公司),TU-1901双光束紫外可见分光光
度计(北京普析通用仪器有限责任公司),JY92-2D
超声波细胞粉碎机(宁波新芒生物科技),隔水式电
热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂),荧光/
磷光发光光度计LS45(美国PerkinElmer)。
1.2 方法
1.2.1 黑穗醋栗粗多糖的提取
称100 g黑穗醋栗果实,按液料比1􀏑20加入去
离子水,在功率400 W下超声法提取25 min,得到
多糖提取液进行离心,抽虑,浓缩;用80%乙醇沉
淀,沉淀真空干燥,得固体黑穗醋栗多糖,样品呈
灰白色。
1.2.2 抗氧化活性研究方法
1.2.2.1 羟基自由基(·OH)清除
参照Fenton反应建立反应体系[11],在 5个试管
中分别加入 2 mL浓度为 0.20、0.40、0.60、0.80和
1.00 mg·mL-1的多糖提取液,8 mmol·L-1 FeSO4 2
mL,8 mmol·L-1水杨酸-乙醇 2 mL,加 8.8 mmol·L-1
H2O2 2 mL启动反应,37 ℃反应 30 min,在 510 nm
下测定各浓度的吸光度 A1。以 2 mL蒸馏水代替
2 mL H2O2溶液作空白调零,以2 mL蒸馏水代替多糖
溶液测定吸光值A0。以VC作阳性对照,计算清除率。
·OH清除率(%)= A0 - AtA0 ×100%。
1.2.2.2 超氧阴离子自由基(O2-·)清除
采用邻苯三酚自氧化法 [12],略有改动。取 pH
8.2的 50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲溶液 5 mL,加 4.7
mL H2O,混匀后 25 ℃水浴保温 30 min。然后加入
3 mmol·L-1的25 ℃预热的邻苯三酚0.3 mL,迅速混
匀后于320 nm处每隔30 s记录一次吸光度(A0),持
续 5 min,计算每分钟吸光度的增加值(V0)。配置
不同浓度的黑穗醋栗多糖溶液(0.2、 0.4、 0.6、
0.8、1.0 mg·mL-1),各取2 mL于试管中,试验方法
同上。计算每分钟吸光度的增加值(Vt)。以VC作
阳性对照,按照公式计算清除率。
东 北 农 业 大 学 学 报·74· 第43卷
the increase of concentration, in a concentration effect manner, meanwhile, it showed certain inhibitory effects of
polysaccharides on the non-enzymatic glycation.
Key words: black current; polysaccharides; antioxidant activity; non-enzymatic glycation reaction
O2-·清除率(%)= V0 - VtV0 ×100%。
1.2.2.3 DPPH自由基清除试验[13]
取不同浓度黑穗醋栗多糖溶液(0.2、 0.4、
0.6、0.8、1.0 mg·mL-1)各 2 mL于试管中,加入 0.3
mmol·L-1 DPPH 2 mL,避光反应30 min,于517 nm
波长处测定吸光度(Ai);再取上述多糖液2 mL,加
入 2 mL无水乙醇,反应 30 min测吸光度(Aj);取
2 mL DPPH,加入 2 mL无水乙醇,反应 30 min测
吸光度(A0)。以VC做阳性对照,按照下式计算清
除率。
清除率(%)= æèç
ö
ø÷1 -
Ai - Aj
A0 ×100%
1.2.3 糖基化活性研究[14]
1.2.3.1 体外非酶糖基化体系的建立
在无菌条件下,向无菌细胞培养瓶中加入用
0.2 μm除菌膜除菌后的 20.00 g·L-1牛血清白蛋白
溶液和 0.50 mol·L-1葡萄糖溶液各 5 mL,加入含
1%叠氮钠的 0.20 mol·L-1 pH 7.4的磷酸盐缓冲液
10.00 mL,建立完整糖基化体系对照组 a,同时设
立不加多糖溶液和不加葡萄糖溶液的对照组b;加
多糖溶液不含蛋白的对照组 c;加多糖溶液不加葡
萄糖溶液的对照组d。设置溶液中多糖终浓度分别
为 0.05、0.1、0.15、0.20 mg·mL-1的干预组,在
37 ℃恒温培养箱内培养 14 d。分别于第 0、2、4、
6、8、10、12、14天取样进行试验。
1.2.3.2 NBT还原试验
取 0.5 mL糖基化物质和 0.3 mmol·L-1 NBT 2.0
mL在 100 mmol·L-1 pH 10.35碳酸钠缓冲溶液 2.5
mL,于室温孵化 20 min,530 nm处测定吸光度。
用碳酸钠缓冲溶液代替糖基化物质作空白,计算抑
制率(IR)。
IR(%)= æèç
ö
ø÷1 -
药物A-对照c A-对照d A
对照a A-对照b A ×100%
1.2.3.3 二羰基化合物含量测定
取糖基化体系溶液0.4 mL与0.2 mL 500 mmol·L-1
吉拉德-T储备液和 3.4 mL pH 2.9甲酸钠溶液在室
温下孵化 1 h,294 nm处测定吸光度,以甲酸钠溶
液代替糖基化物质为空白。以乙二醛标准曲线计算
二羰基化合物含量,计算抑制率(IR)。
1.2.3.4 糖基化终产物荧光强度的测定
取出0.5 mL培养液,稀释至10 mL,测定糖基
化终产物在激发波长 370 nm,发射波长 440 nm处
的荧光值 F,计算对非酶糖基化的抑制率(IR)。
IR(%)= æèç
ö
ø÷1 -
药物F-对照cF-对照dF
对照aF-对照bF ×100%1.2.4 数据处理分析
所有试验数据均以 3次结果的平均数±标准误
(mean±SD)表示。并用 SPSS 10.0软件进行差异显
著性分析,P<0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 多糖对羟自由基的清除能力
由图 1可知,多糖和VC对羟自由基清除能力
都随浓度增加而逐渐增强,VC对羟自由基清除率
高于多糖。黑穗醋栗多糖与VC的各浓度之间的清
除率差异显著(P<0.05,n=5),黑穗醋栗多糖 IC50=
0.976 mg·mL-1,VC的 IC50=0.501 mg·mL-1。
2.2 多糖对超氧阴离子(O2-·)自由基清除能力
由图2可知,黑穗醋栗多糖对O2-·自由基清除
率随浓度增加而上升,当浓度为 1.0 mg·mL-1时,
清除率是71.85%。VC的浓度为0.2 mg·mL-1时,清
除率已高达 89.69%,随浓度增加清除率变化不
大,逐渐趋于平衡。黑穗醋栗多糖的 IC50=0.3931
mg·mL-1,VC的 IC50=0.111 mg·mL-1。黑穗醋栗多糖
对O2-·自由基清除能力虽略低于VC,但仍表现出
较强的抗氧化能力,且各浓度间的清除率差异显著
(P<0.05,n=5)。
2.3 黑穗醋栗多糖对DPPH自由基清除能力
由图 3 可知,黑穗醋栗多糖浓度在 0.2~0.6
mg·mL-1时对DPPH自由基的清除能力逐渐增强但低
于VC,当浓度为0.8 mg·mL-1时清除率39.31%略高
于VC的抑制率 36.87%,当浓度为 1.0 mg·mL-1时,
图1 对羟自由基的清除能力
Fig. 1 Scavenging ability of hydroxyl radicals


率(
%)
Clea
ranc
era
te
100
80
60
40
20
0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
浓度(mg·mL-1)Concentration








●●
多糖 PolysaccharidesVC


于泽源等:黑穗醋栗多糖抗氧化及抑制非酶糖基化活性的研究第10期 ·75·
2.4.2 二羰基化合物含量测定
由图5和表1可知,在0~10 d内二羰基化合物
含量增加趋势显著,在10~14 d二羰基化合物含量
逐渐趋于平衡,各浓度多糖对二羰基化合物都有
一定的干预作用,随着浓度升高,抑制率升高,
呈现剂量效应依赖关系。多糖浓度为 2.0 mg·mL-1
时抑制二羰基化合物的能力最大,抑制率达
30.80%。
2.4.3 非酶糖基化终产物荧光强度测定
蛋白质糖基化终产物在最大激发波长370 nm,
最大发射波长440 nm处有荧光吸收。通过测定反应
后的荧光强度可以衡量蛋白质非酶糖基化的程度,
从而反映样品抑制作用的强弱。由图6和表1可知,
在0~4 d黑穗醋栗多糖的糖基化体系中AGEs荧光强
度增加缓慢;6~14 d荧光强度有明显增长,在浓度为
0.2 mg·mL-1时,抑制率达43.14%(P<0.05,n=4)。
清除率分别为 46.20%和 44.47%,可见黑穗醋栗多
糖对DPPH自由基的清除能力与VC相近。黑穗醋
栗多糖与VC的各浓度之间的清除率差异显著(P<
0.05,n=5)。
2.4 黑穗醋栗多糖的抗非酶糖基化活性
2.4.1 对Amadori产物生成的影响
在糖基化反应初期,葡萄糖的羰基可以与
蛋白质、核酸、氨基酸等大分子物质的游离氨
基发生作用生成西弗碱,西弗碱经过化学重排,
形成较稳定的酮胺化合物,又称Amadori产物。由
图 4和表 1可知,在 0~8 d内,不同浓度多糖在
糖基化体系中,对 Amadori产物的产生都有一定
抑制作用,且随着多糖浓度增加抑制作用逐渐
增加。8~14 d内变化逐渐趋于平衡。浓度为 0.2
mg·mL-1时,抑制率达34.78%,浓度为0.2 mg·mL-1
时与 0.15 mg·mL-1 之间的清除率具有显著差异
(P<0.05)。
图3 对DPPH自由基清除能力
Fig. 3 Scavenging ability of DPPH radicals


率(
%)
Clea
ranc
era
te
50
40
30
20
10
0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
浓度(mg·mL-1)Concentration






●●●●
多糖 PolysaccharidesVC


图4 对Amadori产物生成的抑制作用
Fig. 4 Inhibitory effects of Amadori product


度(
A)
Abs
orba
nc
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0 0 2 4 6 8 10 12 14
孵化时间(d)Incubation time



●●●


▲ ▲
▲▲

●●●
◆ ◆◆◆

◆◆

■ ■
■ ■
■■■



0.05 mg·mL-10.15 mg·mL-1 ■◆ 0.10 mg·mL
-1
0.20 mg·mL-1
表1 多糖对葡萄糖/BSA体系Amadori产物、二羰基化合物及GAEs形成的抑制作用
Table 1 Inhibitory effects of polysaccharides on the formation of amadori product,
dicarbonyl compounds and GAEs in glucose/BSA system
多糖浓度(mg·mL-1)Concentration
0.05
0.10
0.15
0.20
抑制率(%)Inhibitory rate
NBT还原反应NBT reduction
25.93±0.9
28.06±0.8
30.57±0.9
34.78±1.0
二羰基化合物Dicarbonyl compounds
21.24±1.2
23.53±1.0
26.68±0.7
30.80±1.1
AGEs
33.19±4.2
35.81±3.1
38.54±3.9
43.14±3.5
东 北 农 业 大 学 学 报·76· 第43卷
图2 对O2-·的清除能力
Fig. 2 Scavenging ability of superoxide anion radicals


率(
%)
Clea
ranc
era
te
100
80
60
40
20
0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
浓度(mg·mL-1)Concentration





●●●●●


多糖 PolysaccharidesVC
3 讨论与结论
自由基是人体氧化过程中的副产物[15]。自由基
清除剂可直接清除体内过剩自由基,能够有效地防
止或减轻体内自由基所导致的氧化损伤,增强机体
免疫力,延缓衰老 [16]。近 20年来,由于生物学、
化学等学科飞速发展,对多糖及其化合物活性作用
认识加深,已有大量研究表明,一大部分从天然产
物中分离得到的多糖类化合物具有清除自由基、抑
制脂质过氧化作用。现已提取的水果中多种多糖均
有较强的体外抗氧化功能,如李雪花等研究表明,
荔枝粗多糖有清除活性氧自由基的作用[17];孟繁磊
和陈瑞战等研究发现五味子多糖对O-2·和·OH具有
一定的抗氧化能力[18]。
黑穗醋栗多糖在抗氧化试验中,对不同自由基
表现出不同的清除作用,黑穗醋栗多糖与 VC相
比,清除DPPH·的效果最好,当黑穗醋栗多糖浓
度为 1.0 mg·mL-1时,清除率 46.20%高于相同浓度
下VC的清除率44.48%;而对羟自由基和超氧自由
基清除率虽低于 VC,但仍表现出较好的清除能
力,IC50分别为 0.9760和 0.3931 mg·mL-1。说明黑
穗醋栗多糖在体外对活性氧自由基有清除作用,从
而能够清除体内产生的过多自由基,阻断体内自由
基反应链的作用。不是所有碳水化合物都具有抗氧
化活性。多糖抗氧化活性与多糖的结构、分子质量
及单糖种类和连接方式有关[19]。
新疆医科大学王晓燕等对黑加仑多糖进行抗氧
化性研究,初步证明黑加仑多糖具有一定还原能
力,并具有较强的羟自由基清除活力[20]。而本试验
黑穗醋栗多糖清除DPPH·的效果却最好,导致结
论差异的原因可能是由于果实品种不同,因此在下
一步试验中将探讨黑穗醋栗多糖结构和活性的关
系。
蛋白质非酶糖基化是指蛋白质中氨基酸的N
末端氨基或侧链氨基与还原糖的醛基缩合,产生
可逆的 Shiff氏碱中间体,进而形成稳定且可逆的
糖-蛋白复合物,即 Amadori产物。Amadori产物
或 Amadori产物降解的各种高度活性的羰基化合
物,再与其他游离氨基基团反应,并经过一系列
的化学重排和脱水反应,生成不可逆的深度糖基
化终产物AGEs。AGEs不仅可以通过促进蛋白质
发生直接的化学交联作用而影响组织的结构和功
能,还可通过氧化应激造成组织损伤,其在体内
长期累积,可引发一系列病理变化,最终导致动
脉硬化、衰老、糖尿病慢性并发症及老年痴呆等
疾病的发生发展。目前有很多药物通过对非酶糖
基化反应的抑制发挥对糖尿病并发症的治疗作
用。
黑穗醋栗多糖对非酶糖基化反应中 Amadori
产物形成阶段,二羰基化合物形成阶段,AGEs形
成过程均有抑制作用,且随多糖浓度增加而增
强。试验证明,黑穗醋栗多糖在Amadori产物形成
阶段作用明显,在浓度为 0.2 mg·mL-1时,抑制率
为 34.78%。糖基化中期,Amadori 产物通过氧
化、水解反应降解成乙二醛、甲基乙二醛和脱氧
葡萄糖醛酮等二羰基化合物。这些化合物比葡萄
糖更容易与游离氨基发生反应,形成糖基化终产
物 [12]。在浓度为 0.2 mg·mL-1时,两个阶段的抑制
率分别为 30.80%和 43.14%。黑穗醋栗多糖在第三
阶段对AGEs的形成表现出较强的抑制作用,黑穗
醋栗对糖基化过程的抑制作用从而确定。
图6 非酶糖基化终产物荧光强度
Fig. 6 Fluorescence intensity of AGEs




Flu
ores
cen
cei
nten
sity
120
100
80
60
40
20
0 0 2 4 6 8 10 12 14
孵化时间(d)Incubation time


▲ ●



●▲

▲▲▲ ●●●
◆ ◆◆

◆◆◆◆





■■■


0.05 mg·mL-10.15 mg·mL-1 ■◆ 0.10 mg·mL
-1
0.20 mg·mL-1
于泽源等:黑穗醋栗多糖抗氧化及抑制非酶糖基化活性的研究第10期 ·77·
图5 对二羰基化合物产生的抑制作用
Fig. 5 Inhibitory effects of dicarbonyl compounds




量(
μm
ol·m
L-1 )
Gly
oxal
con
tent
100
80
60
40
20
0 0 2 4 6 8 10 12 14
孵化时间(d)Incubation time
▲▲


●●●

▲ ▲

▲▲

●●
◆ ◆◆
◆◆◆



■ ■







0.05 mg·mL-10.15 mg·mL-1 ■◆ 0.10 mg·mL
-1
0.20 mg·mL-1
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东 北 农 业 大 学 学 报·78· 第43卷