全 文 ：丽江山慈菇 RAPD 遗传变异初探
王海英1, 虞　泓1, 3Ξ , 李南高2, 何显静1, 张金渝1, 周利杰1
(11 云南大学生命科学院 生态遗传学实验室, 云南 昆明　650091; 21 云南英茂生物技术实验室,
云南 昆明　650106; 31 昆明制药集团股份有限公司, 云南 昆明　650100)
摘　要: 目的　研究丽江山慈菇 Ip h ig en ia ind ica 遗传变异及遗传结构。方法　采用 RA PD 技术, 对产自云南的 3
个居群进行 DNA 指纹检测。结果　筛选出 20 个随机引物, 对 3 居群扩增共产生 120 条DNA 片段, 在 012～ 3 kb,
其中 71 条谱带具有遗传多态性, 约占 59117% , 平均每个引物扩增的DNA 带数是 3155。Shannon index 在丽江玉
龙雪山居群 (Ca) 为 01199 4, 大理宾川鸡足山居群 (Cb) 为 01200 7, 丽江永胜片角镇居群 (Cc) 为 01254 8; 居群
平均水平为 01218 3, 物种水平为 01288 6。N ei’s genetic iden tity 在 Ca 和 Cb 居群间为 01930 9; 在 Ca 和 Cc 居群
间为 01932 7; 在 Cb 和 Cc 居群间为 01946 6。居群间基因分化系数 G st为 01204 4。结论　RA PD 分析可为丽江山
慈菇保护对策和措施的制定, 遗传育种和 GA P 种植方法及标准的制定, 提供理论依据和基础资料。
关键词: 丽江山慈菇; RA PD; 遗传多态性
中图分类号: R 282171013　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 05 0685 04
Prel im inary ana lysis on genetic var ia tion of Ip h igen ia ind ica by RAPD
W AN G H ai2ying1, YU Hong1, 3, L I N an2gao 2, H E X ian2jing1, ZHAN G J in2yu1, ZHOU L i2jie1
(11L abo rato ry of Eco logica Genetica, Co llege of L ife Science, Yunnan U niversity, Kum ing 650091, Ch ina;
2. Immo l L abo rato ry of B io techno logy of Yunnan, Kunm ing 650106, Ch ina;
3. Kunm ing Pharm aceu tical Co rpo ration, Kunm ing 650100, Ch ina)
Abstract: Object　To study on the genet ic d iversity and genet ic st ructu re of Ip h ig en ia ind ica Kun th.
M ethods　R andom amp lif ied po lymo rph ic DNA (RA PD ) w as app lied to detect DNA fingerp rin ts of th ree
popu la t ion s of I. ind ica from Yunnan P rovince. Results　Tw en ty p rim ers w ere screened, and a to ta l of
120 DNA fragm en ts w ere amp lif ied ranging from 0. 2—3 kb, among w h ich 71 (59. 17% ) w ere po lymo r2
ph ic. T he average num ber of DNA band p roduced by each p rim er w as 3. 55. T he Shannon index w as
0. 199 4 in Ca popu la t ion, 0. 200 7 in Cb popu la t ion, 0. 254 8 in Cc popu la t ion, respect ively; the average
value of popu la t ion s w as 0. 218 3. T he Shannon index w as 0. 288 6 in species. N ei’s genet ic iden t ity w as 0.
930 9 betw een Ca and Cb, 0. 932 7 betw een Ca and Cc, 0. 946 6 betw een Cb and Cc. G st w ith in popu la t ion
w as 0. 204 4. Conclusion　Fo r the estab lishm en t of p ro tect ive tact ic and m easu re, and of the standard of
good agricu ltu re p ract ice (GA P ) grow th and heredity b reeding, RA PD analysis p rovides I. ind ica w ith
theo ret ica l foundat ion and basal data.
Key words: Ip h ig en ia ind ica Kun th; RA PD; genet ic varia t ion
　　丽江山慈菇 Ip h ig en ia ind ica Kun th ( 2n =
22) [1 ]属百合科 (L iliaceae) 的山慈菇属 ( Ip h ig en ia
Kun th ) , 在中国仅分布单属单种, 主产于云南中部
至西北部、四川西南部, 贵州西部和西藏等省区也有
分布, 生于 1 000～ 3 000 m 松林下或山坡草地, 酸
性砂壤, 红壤[2 ]。云南省主要分布于昆明、曲靖、玉
溪、楚雄、大理、丽江、保山、鹤庆、宾川。丽江山慈菇具
有较高的药用价值, 全株为提取秋水仙碱 (co lch icine)
的原料, 秋水仙碱对肝癌、乳腺癌、食道癌、皮肤癌、
淋巴肉瘤均有抑制作用; 鳞茎入药, 有毒, 民间用于
散寒平喘, 止咳化痰, 拔毒消肿, 软坚散结[3 ]。
据调查, 丽江山慈菇在云南原分布于滇东、滇中
至滇西北的一些地区, 近年来由于人为的过度采挖
和生境不断遭到破坏, 滇中的丽江山慈菇居群急剧
减少, 处于灭绝的边缘, 滇西北的自然居群也有缩小
趋势。据此现状, 对丽江山慈菇物种种质资源及多样
性的保护已迫在眉睫。但一直以来, 丽江山慈菇遗传
多样性以及遗传结构等方面的研究报道极少, 缺乏
·586·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 6 期 2004 年 6 月
Ξ 收稿日期: 2003211220
基金项目: 昆明制药集团资助项目; 云南大学省级生物技术人才培养基地资助项目
作者简介: 王海英 (1978—) , 女, 湖南怀化人, 在读硕士研究生, 研究方向为植物遗传与进化。3 通讯作者　T el: (0871) 7392184　Fax: (0871) 7392576　E2m ail: fisher@public. km. yn. cn
开展丽江山慈菇引种驯化、遗传育种以及保护生物
学等工作的遗传基础资料。RA PD 是研究居群遗传
多样性快速、简便、有效的方法, 本实验对丽江山慈
姑进行 RA PD 分子标记, 旨在揭示丽江山慈菇的遗
传变异和遗传结构, 为丽江山慈菇的保护生物学、遗
传育种、GA P 种植以及合理开发利用丽江山慈菇药
材资源提供可利用的基础资料。
1　材料与方法
111　植物材料: 材料引种至云南昆明官渡区小哨乡
白汉场英茂生物实验室基地 (海拔 2 100 m )。材料
来源见表 1。
表 1　丽江山慈菇三居群的来源
Tabale 1　Or ig in of three population s of I. ind ica
编号 来　源 海拔öm 样品数ö株 生长环境
1 丽江玉龙雪山 (Ca) 2 593 20 松林边缘, 山坡草地
2 大理宾川鸡足山 (Cb) 2 360 20 松林边缘, 山坡草地
3 丽江永胜片角镇 (Cc) 2 245 20 松林边缘, 山坡草地
112　方法
11211　总 DNA 提取: 采用改良后的 CTAB 法[4, 5 ]
提取基因组DNA , 每株取 013～ 015 g 新鲜叶片。
总DNA 用含 015 ΛgömL 溴化乙锭 (eth id ium
b rom ide, EB ) 的 1% 琼脂糖凝胶 (agaro segel) 电
泳检测, 用 25, 50, 75, 100 ng 的 ΚDNA 作为标定标
准。模板 DNA 工作浓度平衡为 10 ngöΛL。
11212　RA PD 扩增反应及检测: 从 3 个居群中各取
2 份DNA 样品进行预备实验, 共选出 20 个能获得
清晰条带, 反应稳定的随机引物, 引物序列见表 2。
表 2　RAPD 引物序号与序列
Table 2　RAPD pr imers and the ir sequences
引　物 序列 5’～ 3’ 引　物 序列 5’～ 3’
O PA 08 GT GA CGTA GG O PF08 GGGA TA TCGG
O PA 11 CAA TCGCCGT O PF14 T GCT GCA GGT
O PA 15 T TCCGAA CCC O PG12 CA GCTCA CGA
O PB05 T GCGCCCT TC O PG13 CTCTCCGCCA
O PB08 GTCCA CA CGG O PP01 GTA GCA CTCC
O PB18 CCA CA GCA GT O PP02 TCGGCA CGCA
O PB20 GGA CCCT TA C O PP03 CT GA TA CGCC
O PD 11 A GCGCCA T T G O PT 01 GGGCCA CTCA
O PD 13 GGGGT GA CGA O PT 17 CCAA CGTCGT
O PF02 GA GGA TCCCT O PR 20 A CGGCAA GGA
　　反应体系总体积为 25 ΛL : 10×buffer, 1 U
T aqDNA 酶 (P rom ega ) , 012 mmo löL dN T P, 33
ngöΛL 随机引物 (上海 Sangon 合成, Operon 公司
10 碱基随机寡核苷酸引物) , 2 mmo löL M gC l2, 20
ng 模板, 去离子水。对照加入除模板 DNA 外的以
上各成分, 用去离子水代替总DNA。
PCR 扩 增 程 序: 使 用 美 国 PE 公 司 的
PE9700PCR 仪。本实验采用英茂生物技术实验室
DNA 室改进的 TD 2dow n 程序进行 RA PD 扩增,
经过大量的优化工作, 具有带型清晰, 稳定的特点。
扩增产物用含 015 ΛgömL EB 的 2% 琼脂糖凝胶电
泳, 电泳缓冲液为 1×TA E, 电压为 85 V , 90～ 120
m in 后, 使用 Kodak Im age Sta t ion 440CF凝胶成像
系统对 RA PD 谱带进行凝胶成像。图 1 为引物
S128 对丽江玉龙雪山、大理宾川鸡足山、丽江永胜
片角镇居群各 20 个个体进行 PCR 扩增所产生的
RA PD 指纹图谱。
M 2DNA L adder
图 1　RAPD 引物 S128 对丽江山慈姑 3 个居群
(Ca , Cb, Cc) 扩增的 D NA 指纹图谱
F ig. 1 D NA f ingerpr in ts of three population s of I. ind ica
(Ca, Cb, and Cc) by using RAPD pr imer S128
11213　数据统计分析: RA PD 是显性标记, 属于同
一位点的产物按扩增阳性 (1) , 扩增阴性 (0) 和缺失
(1) 记录电泳带谱, 形成 RA PD 表型数据矩阵用于
进一步分析。使用 PO PGEN E 软件, 统计多态条带
比率 (PPB ) , 计算扩增产物的 Shannon info rm at ion
index, N ei’s genet ic iden t ity, genet ic d istance,
effect ive num ber of A lleles, 以及 Gst 等。
2　结果和分析
211　遗传多样性: 在丽江山慈菇 3 个居群中, 20 个
·686· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 6 期 2004 年 6 月
RA PD 引物共扩增 120 条重复性高的清晰条带, 相
对分子质量在 200～ 3 000, 平均每个引物可扩增出
6 条带; 其中有 71 条为多态, 多态比率 (PPB ) 为
59117% , 平均每个 RA PD 引物可获得 3155 个多态
条带。片角镇居群多态位最强, 为 41167% ; 3 居群
的平均多态位 36195% 明显低于物种的多态位
59117% (表 3) , 多态位主要分布在物种水平。Shan2
non info rm at ion index 在 Ca 居群为 01199 4< Cb
居群 01200 7< Cc 居群 01254 8, Cc 居群遗传多样
性较丰富, 3 居群平均水平 01128 3 (表 4)。
表 3　RAPD 遗传多态性
Table 3　Genetic var ia tion of RAPD
居　群　　 样本数 总条带
多态
条带
PPB1)多态
条带比率ö%
丽江玉龙雪山 (Ca) 20 120 41100 34117
大理宾川鸡足山 (Cb) 20 120 42100 35100
丽江永胜片角镇 (Cc) 20 120 50100 41167
平均值 20 120 44130 36195
物种 60 120 71100 59117
　　1) Percen tage of po lymo rph ic bands (PPB)
表 4　丽江山慈菇遗传多样性
Table 4　Genetic d iversity of I. ind ica
居　群 na1) ne2) h3) I4)
丽江玉龙雪山 (Ca) 1. 341 7 1. 231 9 0. 135 6 0. 199 4
大理宾川鸡足山 (Cb) 1. 350 0 1. 238 1 0. 136 9 0. 200 7
丽江永胜片角镇 (Cc) 1. 416 7 1. 323 2 0. 176 9 0. 254 8
平均值 1. 369 3 1. 284 4 0. 147 8 0. 218 3
物种 1. 591 7 1. 314 9 0. 188 3 0. 288 6
　　1) 平均观察等位基因数; 2) 平均有效等位基因数; 3) 遗传多样
性指数; 4) Shannon 多样性指数
　　1) O bserved num ber of alleles; 2) Effective num ber of alleles;
3) N ei’s (1973) gene diversity; 4) Shannon’s Info rm ation index
212　遗传分化: 丽江山慈菇 3 个居群总的基因多
样性指数 h t 是 01188 3, 居群内多样性指数 h s 是
01149 8, 居群间基因分化系数 G st为 01204 4。Hog2
b ion 和 Peakall 总结了一些物种的 RA PD 分析结
果, 发现异交物种的遗传变异大多分布在居群之内,
居群间的遗传变异通常占 27% 以下[6 ]。丽江山慈菇
有 79156% 的遗传变异来自居群内, 20144% 来自
居群间, 遗传变异主要分布在居群内。
213　遗传关系: 表 5 列出 3 居群的 N ei’s genet ic
iden t ity 以及 genet ic d istance。N ei’s genet ic iden t i2
ty 在 Ca 和 Cb 居群间为 01927 0< Ca 和 Cc 居群
间的 01928 1< Cb 和 Cc 居群间的 01942 0, Cb 和
Cc 居群间的遗传一致度最大, 在U PGM A 聚类分析
中, Cb 和 Cc 居群聚在一起, Ca 居群单独聚为一类。
3　讨论与展望
表 5　丽江山慈菇 3 居群的遗传一致度以及遗传距离
Table 5　Ne i’s genetic iden tity and genetic d istance among
three population s of I. ind ica (Ca , Cb, and Cc)
Ca (pop 1) Cb (pop 2) Cc (pop 3)
Ca - 01927 0 01928 1
Cb 01075 8 - 01942 0
Cc 01074 7 01059 8 -
　　3 N ei’s genetic iden tity (遗传一致度) (above line) and genetic
distance (遗传距离) (below line)
　　对丽江山慈菇 3 居群进行 RA PD 检测分析, 丽
江山慈菇居群间的遗传多样性较丰富。遗传变异主
要来源于居群内个体间。Cb 和 Cc 居群间的遗传一
致度最大, 可认为这两个居群亲缘关系较近。
生物多样性保护的关键之一是保护物种, 更确
切的说是保护物种的遗传多样性或进化潜力。从遗
传学角度, 一个物种的遗传多样性高低与其适应能
力、生存能力和进化潜力密切相关。遗传多样性的降
低可导致其适应能力降低、有害隐性基因表达增加
及经济性状衰退, 最终导致物种退化。丰富的遗传多
样性则意味着较高的适应生存能力, 蕴涵着较大的
进化潜能以及比较丰富的育种和遗传改良能力[7 ]。
与百合科植物比, 川百合的 PPB 为 83133% , 紫斑
百合 PPB 值在 82126%～ 93194% [8 ] , 丽江山慈菇
的物种 PPB 仅为 59117% , 居群平均 PPB 为
36195% , 相对较低。因此, 丽江山慈菇遗传多样性的
保护是关键, RA PD 指纹图谱的建立, 可为保护对
策和措施的制定提供科学依据。
分析云南英茂生物技术实验室药物室提供的 3
居群鳞茎秋水仙碱含量值: 丽江永胜片角镇 (Cc)
居群鳞茎秋水仙碱含量在 01283 7%～ 01573 8% ,
平均含量为 01457 5, 丽江玉龙雪山 (Ca) 居群鳞茎
秋水仙碱含量在 01308 4%～ 01507 9% , 平均含量
为 01385 2% , 大理宾川鸡足山 (Cb) 居群鳞茎秋水
仙碱含量在 01205 3%～ 01555 5% , 平均含量为
01278 65% ; 取 3 居群各 10 个个体鳞茎有效成分含
量值作为变量, 使用 SA S810 统计软件[9 ]进行分析,
所得结果见表 6。
　　对鳞茎秋水仙碱含量值进行聚类分析 , Cb和
表 6　丽江山慈菇鳞茎有效成分的 SAS 分析
Table 6　SAS analysis of effective ingred ien t
in bulbs of I. ind ica
样　本 样本数 变异系数 四分位极差 方差
丽江玉龙雪山 (Ca) 10 19. 063 8 0. 086 6 0. 005 4
大理宾川鸡足山 (Cb) 10 22. 215 4 0. 084 5 0. 008 0
丽江永胜片角镇 (Cc) 10 17. 494 6 0. 058 0 0. 006 4
·786·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 6 期 2004 年 6 月
Cc 两居群聚在一起, 这与 RA PD 分析中 Cb 居群和
Cc 居群遗传一致度最大且聚为一类相一致; 所进行
的巢式方差分析结果显示鳞茎秋水仙碱含量的变异
有 89124% 存在于居群内个体间, 10175% 存在于
居群间。因此, 在居群内个体间选育高含量单株, 培
养无性系品种, 利用不同地理分布区高含量植株进
行杂交育种, 在 GA P 种植中具有现实的意义。
丽江山慈菇鳞茎秋水仙碱含量在居群内个体间
和居群间的变异程度及其聚类分析, 与其 RA PD 检
测分析的结果有一定的相关性, 丽江山慈菇鳞茎秋
水仙碱含量可作为其遗传变异的一个重要性状,
RA PD 分析结果可为遗传选育高含量单株、高含量
居群以及杂交选育工作的开展提供分子层次的理论
依据。
利用 DNA 片段多态性分子标记技术, 开展丽
江山慈菇居群遗传多样性和遗传结构的分析, 可为
丽江山慈菇的保护、引种驯化、遗传育种、繁育栽培
和 GA P 种植提供理论依据。在构建丽江山慈菇
RA PD 指纹图谱的基础上, 完善其DNA 指纹图谱,
对制定丽江山慈菇保护策略和措施以及 GA P 种植
标准, 有着直接的指导意义。
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柱色谱-紫外分光光度法测定广金钱草中总黄酮的含量
杨美华, 卢兖伟, 匡岩巍Ξ , 孙仲诒, 吴祖泽
(军事医学科学院放射医学研究所, 北京　100850)
摘　要: 目的　建立广金钱草中总黄酮的含量测定方法。方法　选用测定波长 272 nm , 以 62C2葡萄糖282C2木糖洋
芹素 (vicen in22) 为对照品, 采用柱色谱2紫外分光光度法对不同来源的广金钱草进行了总黄酮的含量测定。结果　
vicen in22 在 1018～ 2512 ΛgömL 具有良好的线性关系, 回归方程为 Y = 0. 030 9 X + 0. 016 (r= 0. 999 9) , 平均回收
率为 100182% , R SD 为 1130%。结论　该方法操作简便, 结果准确, 重复性好, 可用于广金钱草的质量控制。
关键词: 广金钱草; vicen in22; 总黄酮; 含量测定; 柱色谱2紫外分光光度法
中图分类号: R 28216　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 06 0688 03
Quan tita tive determ ina tion of tota l f lavono ids in D esm od ium s ty racif olium
by column chroma togram -UV spectrophotom etry
YAN G M ei2hua, LU Yan2w ei, KUAN G Yan2w ei, SUN Zhong2yi, W U Zu2ze
(Beijing Inst itu te of R adiat ion M edicine, A cadem y of M ilitary M idical Sciences, Beijing 100850, Ch ina)
Key words: D esm od ium sty racif olium (O sbeck) M err. ; vicen in22; to ta l f lavono ids; quan t ita t ive de2
term inat ion; co lum n ch rom atogram 2UV spectropho tom atry
　　广金钱草为常用中药, 来源于豆科山蚂蝗属植
物 金 钱 草 D esm od ium sty racif olium (O sbeck )
M err. 的干燥地上部分, 收载于《中华人民共和国药
典》2000 年版一部[1 ]。具有清热除湿, 利尿通淋之功
·886· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 6 期 2004 年 6 月
Ξ 收稿日期: 2003209215
作者简介: 杨美华 (1964—) , 女, 博士, 研究方向为生药分子鉴定、生药分析及新药研究开发。T el: (010) 62899730 (O )
E2m ail: yangm eihua15@ho tm ail. com3 河南中医学院 中药系 97 级毕业生