全 文 ：·药材与资源·
铁皮石斛原球茎液体悬浮培养的研究
宋经元, 郭顺星3 , 肖培根Ξ
(中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所, 北京　100094)
摘　要: 目的　研究铁皮石斛D end robium cand id um 原球茎液体悬浮培养的可行性以及接种量和培养液体积对原
球茎生长的影响。方法　利用完全随机实验设计和正交试验设计研究不同基本培养基、接种量和培养液体积对原
球茎生长的影响。结果　无论鲜重还是干重, 铁皮石斛原球茎在液体培养基上均极显著好于固体培养基 (P <
01001)。不同基本培养基对铁皮石斛原球茎生长影响的研究表明, 培养天数为 30 d 时, 对于鲜重: 672V 极显著好于
B 5 (P < 0101) ,B 5 极显著好于 1ö2M S (P < 0101) , 1ö2M S 显著好于M S (P < 0105) ; 对于干重: 672V 与B 5 没有显著
性差异 (P > 0105) ,B 5 极显著好于 1ö2 M S (P < 0101) , 1ö2M S 极显著好于M S (P < 0101)。接种量和培养液体积
对原球茎生长影响的研究表明, 接种量影响最大, 体积其次, 互作最小, 若不考虑互作, 对于鲜重和干重, 最佳处理
为: 接种量 61194 gö瓶+ 培养液体积 150 mL ö瓶或 100 mL ö瓶; 对于干重, 若考虑互作, 接种量为 61194 gö瓶时, 应
选培养液体积 150 mL ö瓶或 100 mL ö瓶, 接种量为 31102 gö瓶时, 应选培养液体积 150 mL ö瓶或 100 mL ö瓶, 接种
量为 11693 gö瓶时, 应选 150 mL ö瓶或 50 mL ö瓶。结论　液体悬浮培养对铁皮石斛原球茎的生长有利, 获得了最佳
基本培养基、接种量和培养液体积的最佳搭配方案, 表明通过液体悬浮培养生产铁皮石斛原球茎具有较好的开发
应用前景。
关键词: 铁皮石斛; 原球茎; 液体悬浮培养
中图分类号: R 282102　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 09 1042 05
Suspen sion culture of protocorm in D end robium cand idum
SON G J ing2yuan, GUO Shun2x ing, X IAO Pei2gen
( Inst itu te of M edicinal P lan t D evelopm ent, Ch inese A cadem y of M edical Sciences
and Pek ing U nion M edical Co llege, Beijing 100094, Ch ina)
Abstract: Object 　 To study the feasib ility of su spen sion cu ltu re of p ro toco rm in D end robium
cand id um W all1 ex L indl1 and effect of inocu lum and m edium vo lum e on the grow th of p ro toco rm 1
M ethods　Effect of fou r basic m edia M S, 1ö2 M S, 672V , and B 5, inocu lum and m edium vo lum e on the
grow th of p ro toco rm w ere studied by comp letely random experim en ta l design and o rthogonal test design1
Results　T he grow th of D 1 cand id um p ro toco rm s in liqu id m edium w as m arkedly bet ter than that in so lid
m edium (P < 01001) 1 Among fou r basic m edia M S, 1ö2M S, 672V , and B 5 fo r 30 d, the 672V m edium w as
bet ter than B 5 (P < 0101) , B 5 bet ter than 1ö2 M S (P < 0101) , 1ö2 M S bet ter than M S (P < 0105) fo r the
grow th of p ro toco rm in fresh w eigh t; w h ile there is no m askedly difference betw een 672V and B 5 (P >
0105) , B 5 w as m uch bet ter than 1ö2 M S (P < 0101) , and 1ö2 M S w as m uch bet ter than M S (P < 0101) in
dry w eigh t1 Effect of inocu lum on the grow th of p ro toco rm w as the mo st, and effect of m edium vo lum e the
second, w h ile the in teract ion betw een inocu lum and m edium vo lum e w as the least1 T he resu lts ind ica ted
that the trea tm en t ( inocu lum 61194 göf lask and 150 mL o r 100 mL liqu id m edium in 250 mL flask) w as the
best fo r the grow th of p ro toco rm , w hen the in teract ion betw een inocu lum and m edium vo lum e w as no t
con sidered1 If the in teract ion betw een them w as con sidered, t rea tm en ts ( inocu lum 61194 göf lask and 150
mL o r 100 mL liqu id m edium in 250 mL flask, inocu lum 31102 göf lask and 150 mL o r 100 mL liqu id
·2401· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 9 期 2004 年 9 月
Ξ 收稿日期: 2004204210
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30170023) ; 国家杰出青年科学基金项目 (30325047) ; 全国高等学校优秀博士学位论文作者专项
基金资助项目 (199950) ; 北京市科技新星计划资助项目 (2003A 61)
作者简介: 宋经元, 男, 博士。T el: (010) 628296193 通讯作者　T el: (010) 62829619　E2m ail: sxguo2006@yahoo. com. cn
m edium in 250 mL flask, inocu lum 11693 göf lask and 150 mL o r 50 mL liqid m edium in 250 mL flask )
w ere the best fo r the increase of dry w eigh t of p ro toco rm , respect ively1 Conclusion 　T he grow th of D 1
cand id um p ro toco rm in liqu id m edium is bet ter than that in so lid m edium 1 Fu rthermo re, the best basic
m edium and the best arrangem en t in pairs betw een inocu lum and m edium vo lum e are ob ta ined1 D 1
cand id um is a rare m edicinal p lan t, the p robab le w ay fo r p roducing p ro toco rm s of D 1 cand id um is p rovided
by the above study1
Key words: D end robium cand id um W all1 ex L indl1; p ro toco rm ; su spen sion cu ltu re
　　铁皮石斛 D end robium cand id um W all1 ex
L indl1 主要分布在我国云南、贵州、广西、台湾等地,
年平均气温 12～ 18 ℃, 相对湿度在 60%～ 75% , 林
间透光度在 60% 左右, 在无霜多雾, 年降雨量在
1 100～ 1 500 mm 的常绿阔叶林中附生于树干上,
以及少数上述环境的石灰岩上。野生铁皮石斛种子
通过风媒或虫媒传播成活率极低, 种子从萌发到进
入商品阶段需 5～ 7 a 才能采收。铁皮石斛特殊的生
活环境和自身繁殖极为困难, 造成其产量低、生长区
域小。铁皮石斛具有增强免疫力、抗肿瘤、保护嗓音
的作用, 预测铁皮石斛将成为 21 世纪高级护嗓保健
饮品[1 ]。但铁皮石斛野生资源极其有限, 已被列为濒
危物种, 解决其资源满足市场需求是当务之急。
　　在铁皮石斛组织培养的研究中, 以铁皮石斛原
球茎为材料研究试管苗分化及壮苗培养有较多报
道[2～ 7 ], 主要是为了快速繁殖铁皮石斛试管苗, 为铁
皮石斛的栽培研究提供材料, 也用于铁皮石斛离体
开花的研究[8, 9 ]。在研究真菌对铁皮石斛生长的作用
时[10 ] , 笔者发现在琼脂培养基上不接真菌时, 铁皮
石斛原球茎生长良好, 在其试管苗继代培养增殖的
过程中, 铁皮石斛原球茎生长十分旺盛, 通过细胞工
程技术生产铁皮石斛原球茎也是解决铁皮石斛资源
紧缺、栽培困难等问题的有效途径, 因此, 本实验研
究不同培养基对铁皮石斛原球茎生长的作用, 以获
得适于原球茎生长的合适基本培养基。筛选获得适
当的基本培养基, 有利于进一步研究其他因素如接
种量与培养液体积等对铁皮石斛原球茎生长的作
用, 为通过液体培养大量生产铁皮石斛原球茎打下
基础。
1　材料与方法
111　植物材料: 铁皮石斛 D end robium cand id um
W all1 ex L indl1 来源于广西药用植物园, 由本所郭
顺星研究员鉴定, 铁皮石斛原球茎继代于固体培养
基 1ö2 M S (大量元素减半) + 30 göL 蔗糖+ 200
göL 马铃薯提取汁上。
112　培养基: 1ö2 M S (大量元素减半) + 30 göL 蔗
糖+ 200 göL 马铃薯提取汁, pH 518, 固体培养基另
加琼脂粉 7 göL , 液体培养基不加琼脂粉。B 5、672V、
M S 培养基均附加 200 göL 马铃薯提取汁和 30 göL
蔗糖, 为液体培养基, pH 518。研究接种量与培养液
体积对铁皮石斛原球茎生长的影响时, 采用的培养液
为 672V 培养液〔KNO 3 1 600 m göL , (N H ) 4SO 4 300
m göL 〕+ 30 göL 蔗糖+ 200 göL 马铃薯提取汁。
113　方法
11311　不同培养基对铁皮石斛原球茎生长的影响:
1ö2 M S (大量元素减半) + 30 göL 蔗糖+ 200 göL
马铃薯提取汁液体培养基、固体培养基各重复 10
次, 采用 250 mL 三角瓶, 每瓶加 50 mL 培养基, 平
均接种量 2 410 m gö瓶鲜重, 培养 30 d 收获, 用吸水
纸吸干培养物表面水分, 称取鲜重, 晾晒干, 称干重,
计算增殖倍数。比较液体培养基和固体培养基对铁
皮石斛原球茎生长的作用是否有显著性差异。完全
随机实验设计, 二者按成组数据处理, 用 t 检验 (两
尾检验)。M S、1ö2 M S、672V、B 5 4 种培养液各重复
10 次, 采用 250 mL 三角瓶, 每瓶加 50 mL 培养基,
平均接种量 2 122 m gö瓶鲜重, 培养 30 d 收获, 用吸
水纸吸干培养物表面水分, 称取鲜重, 晾晒干, 称干
重, 完全随机实验设计, 采用方差分析和 q 检验比较
不同培养液对铁皮石斛原球茎生长的作用。统计分
析见参考文献[11, 12 ]。培养条件: (24±1) ℃, 漫射光
下, 摇床转速 120 röm in。
11312　接种量与培养液体积对铁皮石斛原球茎生
长的影响: 利用正交实验设计研究接种量 (A ) 与培
养液体积 (B ) 对原球茎生长的影响, 每因素取 3 个
水平 (考虑交互作用) , 见表 1。选L 9 (34)正交表安排
实验, 因为考虑没有空列作误差估计, 应作重复试
验。为避免系统误差, 做 1～ 9 号签两份, 当实验计划
编订后, 用抽签办法确定实验顺序, 根据表 1, 将数
据代入即为实验方案, 见表 2。采用 250 mL 三角瓶,
培养条件: (24±1) ℃, 漫射光下, 摇床转速 120 rö
m in。培养 30 d 收获, 用吸水纸吸干培养物表面水
分, 称取鲜重, 晾晒干, 称干重, 计算极差R 及 K 值,
·3401·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 9 期 2004 年 9 月
确定主要因子列及最佳组合, 并进行方差分析和 q
检验。正交实验设计与统计分析见参考文献[13 ]。
2　结果
211　液体和固体培养基对铁皮石斛原球茎生长的
作用: 1ö2 M S (大量元素减半) + 200 göL 马铃薯提
取汁培养基 (液体和固体) 对铁皮石斛生长的作用
为: 固体培养基上原球茎较绿, 芽分化明显, 有些根
生长较长; 液体培养基中原球茎以黄色为主, 略带绿
色, 芽分化不明显, 未见根生长。收获时鲜重、干重、
增殖速率见表 3。结果表明, 无论鲜重还是干重, 铁
皮石斛原球茎在液体培养基上均极显著好于固体培
养基。
表 1　因素水平表
Table 1　Factors and levels
水　平
因　　素
A 接种量ö(g·瓶- 1) B 体积ömL
1 2 50
2 4 100
3 6 150
表 2　L 9 (34)正交试验
Table 2　Result of L 9 (34) orthogonal test
处理
编号
A B
收获鲜重ö(g·瓶- 1)É Ê 收获干重ö(g·瓶- 1)É Ê
1 1 1 91329 81561 11109 11025
2 2 2 141615 171253 11533 11869
3 3 3 361533 271175 31394 21867
4 2 3 161722 171189 11638 11919
5 3 1 221547 251885 11457 11476
6 1 2 101254 71700 11190 01941
7 3 2 331526 331096 21960 21826
8 1 3 91242 121204 01951 11377
9 2 1 141647 141494 11467 11368
表 3　液体和固体培养基对铁皮石斛原球茎生长的作用
Table 3　Effect of l iquid and sol id media on
growth of D 1 cand idum protocorm
培养基
平均收获量ö(m g·瓶- 1)
鲜重 干重
干鲜比ö% 鲜重增殖速率3ö(m g·d- 1·瓶- 1)
液体 (n1= 10) 11 600±7293 3 1 071±703 3 912 306
固体 (n2= 9) 7 520±923　 553±50　 714 170
　　3 增殖速率= (收获鲜重- 接种量) ö培养天数 (30 d)
　　3 3 与固体培养基上的相比: P < 01001
　 　 3 V elocity of p ro liferation = ( harvest fresh w eigh t -
inocu lum ) ö30 d
　　　3 3 P < 01001 vs treatm en t on so lid m edium
212　不同基本培养基对铁皮石斛原球茎生长的作
用: 铁皮石斛原球茎在 4 种液体培养基中均生长良
好, 分化较少, 672V 和B 5 对原球茎增重更为有利,
1ö2 M S 和M S 略差 (图 1)。计算结果及统计分析表
明, 培养天数为 30 d 时, 对于鲜重: 672V 极显著好
于 B 5 (P < 0101) , B 5 极显著好于 1ö2 M S (P <
0101) , 1ö2 M S 显著好于M S (P < 0105) ; 对于干
重: 672V 与B 5 没有显著性差异 (P > 0105) , B 5 极显
著好于 1ö2 M S (P < 0101) , 1ö2 M S 极显著好于
M S (P < 0101)。因此, 确定 672V 培养液为今后研
究的基本培养基, 进一步研究接种量与培养液体积
对铁皮石斛原球茎生长的作用。
A 2干重　B2鲜重
A 2dry w eigh t　B2fresh w eigh t
图 1　不同基本培养基对铁皮石斛原球茎生长的作用
F ig1 1　Effect of basic media on growth
of D 1 cand idum protocorm
213　接种量与培养液体积对铁皮石斛原球茎生长
的作用: 收获时所有处理的原球茎生长良好, 绿色或
黄白色, 组织块较致密。接种量为 61194 gö瓶时, 不
同培养液体积收获时各处理的鲜重和干重见表 2,É、Ê 为 2 个重复。不同接种量与培养液体积对铁皮
石斛原球茎鲜重、干重影响的极差分析、方差分析及
多重比较 (q 检验) 的结果为: 对鲜重进行极差分析:
R A öR e = 1611, R B öR e = 311, R A ×B öR e = 212; 对干重
进行极差分析, 结果 R A öR e = 1117, R B öR e = 519,
R A ×B öR e= 412。对鲜重和干重多重比较 (q 检验) 的
结果见表4～ 6。
　　无论是鲜重还是干重, 极差分析的结果为: 接种
量为主要影响因素, 培养液体积为第 2 主要影响因
素, 二者存在一定程度的互作, 但互作的影响不如接
种量与培养液体积的影响大。故不考虑互作最有利
于鲜重、干重增加的处理组合为: 接种量 61194
gö瓶+ 培养液体积 150 mL ö瓶或 100 mL ö瓶 (即
A 3B 3 或A 3B 2)。若考虑交互作用, 各接种量对应的
最佳处理为: 对于鲜重, A 1B 1、A 2B 1、A 3B 2; 对于干
重, A 1B 1、A 2B 1、A 3B 3。无论鲜重、干重, 除接种量为
61194 gö瓶与实际情况相符外, 其他与实际情况均
不相符, 因此表明不应考虑交互作用。
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表 4　接种量和培养液体积影响铁皮石斛原球茎鲜重的 q 检验 (n= 3)
Table 4　Effect of d ifferen t inocula and medium volumes on fresh we ight of D 1 cand idum protocorm by q test (n= 3)
水
平
因　　素
接种量ö
(g·瓶- 1)
鲜重ö
(g·瓶- 1)
P < 0105 P < 0101 体积ö(mL ·
瓶- 1)
鲜重ö
(g·瓶- 1)
P < 0105 P < 0101
1 61194 291794 a A 150 191844 a A
2 31102 151820 b B 100 191407 a A
3 11693 91548 c C 50 151911 b A
表 5　接种量和培养液体积影响铁皮石斛原球茎干重的 q 检验 (n= 3)
Table 5　Effect of d ifferen t inocula and medium volumes on dry we ight of D 1 cand idum protocorm by q test (n= 3)
水
平
因　　素
接种量ö
(g·瓶- 1)
干重ö
(g·瓶- 1)
P < 0105 P < 0101 体积ö(mL ·
瓶- 1)
干重ö
(g·瓶- 1)
P < 0105 P < 0101
1 61194 21497 a A 150 21024 a A
2 31102 11632 b B 100 11887 a A
3 11693 11099 c C 50 11317 b B
表 6　接种量与培养液体积互作影响铁皮石斛
原球茎干重的 q 检验 (n= 3)
Table 6　Effect of in teraction between inocula and medium
volumes on dry we ight of D 1 cand idum
protocorm by q test (n= 3)
处理
编号
接种量ö(g·瓶- 1) 体积ö(mL ·瓶- 1) 干重ö(g·瓶- 1) P < 0105 P < 0101
3 61194 150 31131 a A
7 61194 100 21893 a A
4 31102 150 11779 b B
2 31102 100 11701 b B
5 61194 50 11467 b B
9 31102 50 11418 b B
8 11693 150 11164 b B
1 11693 50 11067 b B
6 11693 100 11066 b B
　　方差分析的结果为: 对于鲜重, 接种量的影响极
显著 (F 值远大于 F 0101) , 体积的影响显著, 互作不
显著, 故不考虑互作。最佳处理为: 接种量 61194 gö
瓶+ 培养液体积 150 或 100 mL ö瓶 (即 A 3B 3 或
A 3B 2)。对于干重, 接种量的影响极显著 (F 值远大于
F 0101 ) , 体积的影响极显著 (F 值远大于 F 0101) , 互作
极显著 (F > F 0101) , 但接种量影响最大, 体积其次,
互作最小, 故不考虑互作, 最佳处理为: 接种量
61194 gö瓶+ 培养液体积 150 mL ö瓶或 100 mL ö瓶
(即 A 3B 3 或 A 3B 2 )。若考虑交互作用, 接种量为
61194 gö瓶时, 应选培养液体积 150 mL ö瓶或 100
mL ö瓶 (即A 3B 3 或A 3B 2) ; 接种量为 31102 gö瓶时,
应选培养液体积 150 或 100 mL ö瓶 (即 A 2B 3 或
A 2B 2) , 也可考虑 50 mL ö瓶 (即 A 2B 1 ) ; 接种量为
11693 gö瓶时, 应选 150 或 50 mL ö瓶培养液体积
(即A 1B 3 或A 1B 1) , 与实际情况完全一致, 与不考虑
交互作用时也不矛盾, 只是增加了新的处理组合备
用, 在实际情况中可根据接种量大小予以选用。
　　综上所述, 方差分析与极差分析的结果基本一
致, 只是在方差分析中影响干重的因素分析得更为
清楚明了, 将变异来源中各因素的作用进一步量化,
各处理平均值的差异大小 (显著性)一目了然。在实
际工作中可根据最大限度降低成本获得最大收益的
原则, 选择最合适的处理组合。
3　讨论
　　张治国等[7 ]报道在固体培养基上 6 种基本培养
基 (1ö2 M S、M S、N 6、B 5、KC、VW ) 对原球茎增殖的
影响明显不同, 从原球茎鲜重看, B 5 培养基极显著
好于其他几种培养基, 但从原球茎的生长发育看,B 5
培养基的原球茎色绿, 且有部分分化,N 6 和 KC 培
养基上的原球茎色黄, 体积小于 1ö2 M S、VW 培养
基上的原球茎体积最小, 色黄而不鲜, 1ö2 M S 和
M S 培养基上生长的原球茎虽然鲜重差于N 6、B 5、
KC 等 3 种培养基, 但原球茎色淡黄, 体积大, 无分
化, 因此 1ö2 M S 培养基作为原球茎增殖的基本培
养基是适宜的。
　　本研究的结果表明, 培养周期为 30 d 时, 无论
鲜重还是干重, 液体培养基均明显优于固体培养基
(P < 01001) , 且干鲜比、增殖速率等指标, 液体悬浮
培养均具有明显的优势。此外, 本研究的培养周期
30 d 比张治国等[7 ]报道的培养周期缩短 15 d, 这对
加快生产周期是非常有利的。通过植物组织培养进
行人参、紫草等药用植物的工业化生产已经初步获
得成功, 并产生了可观的经济效益和良好的社会效
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益。尚未见以工业化生产铁皮石斛原球茎及其有效
成分为目的的研究报道, 但已经有人看到此类研究
的巨大前景[14 ]。徐红等[15 ]发现石斛属 5 种生药及培
养组织物的氯仿和甲醇提取物具有明显的清除活性
氧的 能 力, 比 正 常 对 照 (V c ) 要 高, 来 自 D 1
g ra tiosissim um R chb1f1 生药的氯仿提取物和来自
铁皮石斛的组织培养物具有最好的清除活性氧的能
力, 表明石斛属植物是清除活性氧的良好的天然药
物。高建平等[16 ]报道铁皮石斛组织培养物原球茎有
升高环磷酰胺模型小鼠外周血白细胞数, 增加模型
鼠胸腺或脾脏指数, 增强巨噬细胞的吞噬功能, 促进
模型鼠体内淋巴细胞转化的作用。口服给生药
54156 gökg, 小鼠仍能耐受。上述作用与原药材相
似, 表明铁皮石斛组织培养物原球茎与原药材均具
有提高免疫功能的作用, 两者作用强度相似, 最大耐
受量相当于人临床用药量的 227 倍。所以液体悬浮
培养对铁皮石斛原球茎生长有利, 表明通过液体悬
浮培养生产铁皮石斛原球茎具有较好的前景。笔者
将继续报道铁皮石斛原球茎生长和有效成分的积累
的影响因素的研究。
　　接种量与培养液体积的研究对实际工作具有较
大的指导意义, 在放大培养时, 可以予以参考。在细
胞培养的研究中此类工作尚未见报道。笔者认为主
要原因在于接种量难以控制, 比如, 本研究的实验方
案计划接种量为 2 和 4 gö瓶, 而实际接种量为
11693 和 31102 gö瓶, 二者有一定差距, 这也是试验
误差的最大来源。当接种量为 61194 gö瓶, 培养液体
积为 100 mL ö瓶时, 从原球茎的生长状态看, 接种量
还可以继续加大。
References:
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·6401· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 9 期 2004 年 9 月