全 文 ：也轻于模型 + NS 组 ,提示 VnA 减轻脑缺血性损伤
与其阻断血管内皮细胞与白细胞的黏附 ,抑制中性
白细胞的浸润 ,减轻缺血脑组织的炎症反应有关。
NO 作为多功能生物效应分子 ,不仅参与细胞
的各种生理活动 ,而且在许多病理过程中也发挥了
重要作用。合成 NO 的一氧化氮合酶 (NOS) 存在
于脑组织细胞中。缺血早期主要表达结构型一氧化
氮合酶 cNOS [ cNOS 包括神经元型一氧化氮合酶
(nNOS) 和内皮型一氧化氮合酶 (eNOS) 。已有研
究表明 NO 在局灶性脑缺血病理过程中具有双重
作用[9 ] ,来自 eNOS 的 NO 通过保持局部脑血流起
到有益作用 ,而 nNOS 激活后产生过量 NO 有神经
毒性。正常情况下 ,含 nNOS 的阳性细胞散在于脑
实质及脑血管表面 ,该种神经元约占全脑神经细胞
的 2 % 左右[10 ] 。本研究显示 ,脑缺血2再灌注 24 h
时 ,nNOS 大量表达于缺血区神经元而未缺血区却
较少表达亦证实了其毒性作用。许多研究已证实选
择性 nNOS 抑制剂可减轻缺血性脑损伤。本实验
目的之一是观察 VnA 脑保护作用是否有抑制
nNOS 机制参与 ,结果显示给药组与模型 + NS 组相
比未见有显著性差异。
脑缺血的病理过程中有诸多因素参与 ,VnA 的
脑保护作用具体作用于哪些环节有待进一步研究。
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川芎嗪及其衍生物抗凝血活性的研究
夏承建 ,王 　松 Ξ ,朱鹤孙
(北京理工大学 材料研究中心 ,北京 　100081)
　　川芎嗪即四甲基吡嗪 ( tet ramethyl pyrazine ,
TMPZ) ,是从伞形科藻本属植物川芎 L igusticum
chuanxiong Hort . 的根茎中提取分离的生物碱单
体 ,是川芎的主要有效成分 ,现已可人工合成[1 ] 。
临床上 TMPZ 主要用于治疗闭塞性脑血管疾病 ,如
脑血栓、脑动脉栓塞等。实验研究表明其具有降压、
抗肿瘤、扩张血管、抑制血小板聚集作用 ,并对已聚
集的血小板有解聚作用[2 ,3 ] 。本实验通过测定活化
部分凝血激酶时间 (APTT) 、凝血酶 (凝固) 时间
( TT) 以及凝血酶原时间 ( PT) 3 种指标作为评价
标准 ,初步研究 TMPZ、川芎嗪212氮氧化物 ( TMP2
ZO) 、22羟甲基23 ,5 ,62三甲基吡嗪 ( TMPZ2OH) 、3 , 5 ,62三甲基吡嗪222甲酸 ( TMPZ2COOH) 、川芎嗪21 ,42双氮氧化物 ( TMPZO2) 5 种化合物的抗凝血活性。1 　材料111 　试剂 :川芎嗪 ( TMPZ) ,购自百灵威公司 ;磷酸川芎嗪 ,购自北京市燕京制药厂 ,白色结晶性粉末 ,批号 020401。30 % 双氧水 ,购自天津市东方化工厂。采自健康人体的冰冻血浆 ,购自北京北太平庄血站。凝血酶、部分凝血活酶、凝血活酶、氯化钙溶液 ,均购自上海医科大学华山医院技协生物试剂公司。其余试剂均购自北京化学试剂公司 ,且均为分析纯。
·119·中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
Ξ 收稿日期 :2003212218
基金项目 :国家重点基础研究“973”项目 ( G1999064705)
作者简介 :夏承建 (1978 —) ,男 ,山东威海人 ,北京理工大学材料研究中心 2001 级硕士研究生 ,主要从事抗凝血材料的研究。
Tel : (010) 68949661 (O) 　(010) 68943346 ( H) 　E2mail : xchengjian @163. com3 通讯作者　Tel : (010) 68949661 　E2mail : wangsong @bit . edu. cn
112 　仪器 :半自动四通道凝血仪 (美国 Coag2A2
Mate XM) ,旋转蒸发仪 (上海申生科技有限公司) ,
X —4 数字显示显微测定熔点仪 (北京泰克仪器有
限公司) ,PHS —3C 型精密 p H 计 (上海精密科学仪
器有限公司) ,PE683 型红外分光光度计。
113 　TMPZ 衍生物的合成 :参照文献方法[4 ]分别
制备 TMPZO ,熔点为 102～105 ℃,其红外谱图的
特征吸收为 1 300～1 305 cm - 1 ,与文献相符[5 ] ;
TMPZ2OH 熔点为 72～77 ℃,其红外谱图的特征吸
收为 1 452、3 258 cm - 1 ; TMPZ2COOH ,熔点为 112
～117 ℃,其红外谱图的特征吸收为 1 720、3 436
cm
- 1
,与文献相符[4 ] ; TMPZO2 ,熔点为 246 ℃,其
红外谱图的特征吸收为 1 525 cm - 1 , 与文献相
符[5 ] 。
2 　方法
211 　不同 p H 值溶液的配制 :量取一定量的盐酸溶
液按 10 倍的比例稀释 ,并用 p H 计测试并调节溶液
的 p H 值从 110～1010。
212 　TMPZ 及其衍生物溶液的配制 :将 TMPZ、
TMPZO、TMPZ2OH、TMPZ2COOH , TMPZO2 分别
制成 212 ×10 - 5 mol/ mL (此浓度为 TMPZ 溶液的
饱和浓度) 的溶液。
213 　不同酸根与 TMPZ 所成盐溶液的配制 :将
TMPZ 分别与盐酸、磷酸、硫酸、甲酸以 1∶1 的摩尔
比配成有效浓度为 212 ×10 - 5 mol/ mL 的溶液。
214 　样品溶液的抗凝血活性测定[6 ] :
21411 　APTT 的测定 : 011 mL 血浆加入 011 mL
测试样品溶液 ,预热 (37 ℃) 3 min 后 ,加入 011 mL
部分凝血活酶活化 3 min ,放至测试台加入 011 mL
氯化钙溶液 (30 mmol/ L) ,即可测出 APTT。
21412 　TT 的测定 :0112 mL 血浆加入 0112 mL 测
试样品溶液 ,预热 (37 ℃) 3 min 后 ,放至测试台加
入 0112 mL 凝血酶 ,即可测出 TT。
21413 　PT 的测定 :011 mL 血浆加入 011 mL 测试
样品溶液 ,预热 (37 ℃) 3 min 后 ,放至测试台加入
012 mL 凝血酶原的氯化钠水溶液 ,即可测出 PT。
3 　结果
311 　溶液的 p H 值对血浆凝血时间的影响 :用盐酸
配制不同 p H 值溶液 ,按 214 项方法在半自动四通
道凝血仪上测定 APTT、TT 和 PT ,结果见表 1。以
p H 值为 7 的空白血浆为参比 ,随着溶液酸性的逐渐
增强 ,APTT 缓慢缩短 ,当 p H 值从 310 变为 110
时 ,APTT 又缓慢延长 ,当 p H 值为 110 时 ,测定值
已经超过了设定值 ,所以当溶液的 p H 值在 210～
710 内变化时 ,对 APTT 没有影响。当溶液的碱性
表 1 　pH值对凝血活性的影响 ( x ±s , n = 3)
Table 1 　Effect of pH value on coagulability ( x ±s , n = 3)
p H 值 APTT/ s TT/ s PT/ s
110 > 150 > 200 > 50
210 3918 ±012 1510 ±011 1314 ±012
310 3610 ±015 1514 ±011 1119 ±011
410 3211 ±014 1513 ±013 1115 ±013
510 3319 ±012 1514 ±012 1116 ±012
610 3414 ±012 1618 ±015 1218 ±013
710 (空白) 3414 ±014 1711 ±014 1311 ±010
810 3315 ±016 1518 ±012 1214 ±014
910 3317 ±012 1812 ±011 1214 ±012
1010 > 150 > 200 > 50
逐渐增强时 ,APTT 先是缓慢缩短 ,而后又陡然延
长 ,当 p H 值达到 1010 时 ,APTT 已超过设定值 ,由
此可见 ,当溶液的 p H 值在 210～910 内变化时 ,对
APTT 没有影响。同理可得 ,当溶液的 p H 值在
210～910 内变化时 ,对 PT 和 TT 亦没有影响。
312 　TMPZ 及其衍生物对血浆凝血时间的影响 :
TMPZ 及其衍生物对 APTT、TT 及 PT 的影响结果
见表 2。
表 2 　TMPZ 及其衍生物对 APTT、TT
及 PT 的影响 ( x ±s , n = 3)
Table 2 　Effect of TMPZ and its derivants on APTT,
TT, and PT ( x ±s , n = 3)
样　品　　 APTT/ s TT/ s PT/ s
TMPZ (p H510) 3516 ±016 1710 ±016 1212 ±011
TMPZO (p H510) 3617 ±016 3 1911 ±012 3 3 1214 ±012
TMPZO2 (p H510) 3713 ±014 3 3 1918 ±013 3 3 1113 ±012 3
TMPZ2OH (p H510) 4511 ±018 3 3 2017 ±016 3 3 1116 ±016
TMPZ2COOH (p H310) 11112 ±112 3 3 4815 ±110 3 3 3410 ±115 3 3
空白血浆 3416 ±012 1519 ±015 1212 ±011
　　与空白血浆比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101
　　3 P < 0105 　3 3 P < 0101 vs blank plasma
　　由表 2 数据可知 ,与空白血浆相比 , TMPZ 溶液
对 TT、APTT 及 PT 并没有显著的影响 ,说明 TM2
PZ 溶液并不具有明显的抗凝血活性。
TMPZ 的单氮氧化物及双氮氧化物对 APTT、
TT 的影响强于 TMPZ 溶液 ,总体来说对血浆凝血
时间有一定的影响。虽然 TMPZ 的单氮氧化物和
双氮氧化物的化学结构有些差别 ,但对血浆凝血时
间的影响并无明显的差别 ,这说明 TMPZ 上氮氧化
物的含量多少对血浆凝血时间并没有显著的影响 ,
这与 TMPZ 对血小板的影响不同[7 ] 。不过由于结
构上的差别 ,使得 TMPZ 的氮氧化物凝血时间稍长
于 TMPZ ,由此可以推断出 TMPZ 所衍生出来化合
物的官能团的不同可以影响血浆的凝血时间。
TMPZ2OH 对 APTT、TT 的影响比较明显 ,分
·219· 中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
别比空白血浆延长 11 和 5 s ; TMPZ2COOH 不仅对
APTT、TT 的影响非常显著 ,而且对 PT 的影响也
十分明显 ,凝血时间都大大超过了空白血浆的凝血
时间 ,分别比空白血浆的凝血时间延长 77、33 和 22
s ,可见 TMPZ2COOH 的抗凝血效果非常好。
313 　不同酸根与 TMPZ 所成盐对血浆凝血时间的
影响 :由于 TPMZ 的水溶性比较差 (溶解度约为
319 mg/ mL) ,故临床所用的 TMPZ 类抗栓药多为
TMPZ 的盐酸盐和磷酸盐 ,测定它们对血浆凝血时
间的影响 ,结果见表 3。
表 3 　不同酸根与 TMPZ所成盐的抗凝血活性 ( x ±s , n = 3)
Table 3 　Anticoagulability of salif ication of various
acid radicals and TMPZ ( x ±s , n = 3)
样 　品 APTT/ s TT/ s PT/ s
HCl·TMPZ (p H310) 5116 ±014 3 2113 ±012 3 1419 ±011 3 3
H2SO4·TMPZ (p H210) > 150 3 3 > 200 3 3 > 50 3 3
H3PO4·TMPZ (p H310) > 150 3 3 7813 ±019 3 3 4314 ±012 3 3
HCOOH·TMPZ (p H310) 5819 ±014 3 2019 ±013 3 1717 ±011 3 3
空白血浆 3611 ±011 1411 ±011 1116 ±011
　　与空白血浆比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101
　　3 P < 0105 　3 3 P < 0101 vs blank plasma
　　无论从 TT 值、APTT 值还是 PT 值比较 ,在
TMPZ 摩尔浓度相同的情况下 , TMPZ 的盐酸盐溶
液的抗凝血活性好于 TMPZ 溶液 , TMPZ 的含氧酸
盐溶液的抗凝血活性明显好于盐酸盐。
4 　讨论
　　PT 是研究外源性凝血过程的指标 ,表示血浆
中加入钙离子和组织因子后的血浆凝固时间。
APTT 是研究内源性凝血过程的指标 ,表示血浆中
加入适量的部分凝血活酶 ,使凝血因子得到充分的
表面接触而完全活化 ,在钙离子作用下血浆凝固所
需要的时间。而 TT 则表示在一定量血浆中直接加
入凝血酶后血浆的凝固时间。
本研究表明 TMPZ2OH 具有明显的抗凝血活
性 ,其抗凝血作用主要是影响内源性凝血系统 ,而
TMPZ2COOH 则具有显著的抗凝血活性 ,其抗凝血
作用不仅对内源性凝血系统有影响 ,而且对外源性
凝血系统也有比较明显的影响。TMPZ2OH 与
TMPZ2COOH 仅仅相差一个官能团 ,一个是羟基 ,
一个是羧基 ,而他们的抗凝血活性相差非常大 ,这说
明 TMPZ 的衍生物侧基官能团的不同可以影响其
抗凝血活性 ,而且官能团是羧基的衍生物的抗凝血
活性强于羟基的抗凝血活性 ,其构效关系尚待研究。
本实验结果还表明 TMPZ2COOH 抗凝血活性
强于 TMPZ 的甲酸盐 ,它们的抗凝血活性产生差异
的原因可能为 TMPZ2COOH 羧基与吡嗪环上的氮
发生了某种协同作用 ,而 TMPZ 的甲酸盐所含有的
羧基与 TMPZ 的结合方式不同 ,由此产生了抗凝血
活性的差异。具体的构效关系仍待进一步研究。
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·319·中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月