全 文 ：丹参病毒病病原鉴定研究
丁远杰 1 ,吴志明 2 ,谢晓亮 2* ,朱水芳 3 ,温春秀 2 ,高必达 1
( 1. 湖南农业大学植物保护学院 ,湖南 长沙　 410128;　 2. 河北省农业科学院 药用植物研究中心 ,河北 石家庄　 050051;　
3. 国家质检总局植物检疫所 ,北京　 100029)
摘　要: 目的　鉴定我国中草药丹参病毒病的病原及其种类。 方法　从自然感染引起花叶、矮化、褪绿和斑驳的丹
参植株上分离病毒病原 ,进行生物学接种、电镜观察、双抗体夹心酶联免疫吸附测定、逆转录聚合酶链式反应及基
因克隆和序列分析。 结果　通过指示植物症状、电镜下病毒粒体形状和血清学反应发现病毒分离物与黄瓜花叶病
毒有较近的亲缘关系 ,初步将该病毒分离物鉴定为黄瓜花叶病毒。 通过逆转录聚合酶链式反应及基因克隆和序列
分析 ,证明该病毒分离物为一个黄瓜花叶病毒新株系。结论　感染丹参的病毒病原为黄瓜花叶病毒 ,这是首次在我
国中草药丹参上发现黄瓜花叶病毒。
关键词: 丹参 ;黄瓜花叶病毒 ;电镜观察 ;双抗体夹心酶联免疫吸附测定 ;逆转录聚合酶链式反应 ;基因克隆 ;序列分析
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 12 1136 04
Identification of pathogen from Danshen virus diseases in China
DIN G Yuan-jie
1
, WU Zhi-ming
2
, XIE Xiao-liang
2
, ZHU Shui-fang
3
, WEN Chun-xiu
2
, GAO Bi-dai
1
( 1. Co llege o f Plant Pr o tection, Hunan Ag ricultur e Univ e rsity , Chang sha 410128, China; 2. Herba l M edicine
Research Center , Hebei Academy o f Ag riculture and Fo restr y Science, Shijiazh uang 050051, China;
3. Institute of Animal and Plant Quarantine, AQSIO , Beijing 100029, China)
Abstract: Object　 To identify the vi rus disease pathogens and i ts species f rom Danshen ( Salvia milt-
orrhiza Bge. ) w hich is an impor tant kind of Chinese t radi tional and h erbal drug s in China. Methods　 The
virus pa thogens w ere isolated f rom naturally infected Danshen w ith symptoms of mosaic, stunting , chloro-
sis and mo t tle, and the isolates w ere identified by bio logical ino culation, elect ron microscope observ ation,
double-antibody sandw ich-enzyme-linked immunosorbent assay ( DAS-ELISA) , rev erse t ranscriptase-poly-
merase chain reaction ( RT-PCR) detection and gene cloning and sequence analy sis. Results　 By the in-
dicativ e plant symptoms, vi rus particles size in elect ron microscope and serological reactions, the vi rus iso-
late w as found to be very similar to cucumber mosaic cucumovirus ( CMV) and it w as identified a s CMV
primarily. RT-PCR detection, gene cloning and sequence analysis demonst rated tha t the isola te w as a new
CMV isola te. Conclusion　 The virus disease pathogen infecting Danshen w as CMV, this is the fi rst re-
porting o f a new CMV isolate f rom Danshen in China.
Key words: Danshen ( Salvia mil torrhiz a Bge. ) ; cucumber mosaic cucumovirus ( CMV) ; elect ron mi-
croscope observa tion; DAS-ELISAA; RT-PCR; gene cloning; sequence analy sis
　　丹参 Salv ia miltorrhiza Bge. 为唇形科鼠尾草
属多年生草本植物 ,以根入药 ,别名有红根、大红袍、
血参根等 ,是我国一种常用大宗中草药 ,也是国际上
开发的热门药材 ,主要用于治疗心血管系统疾病。近
年来在河北安国、山东等地发现 ,丹参上有一种病害
引起丹参退化 ,该病田间发病率高 ,有些田块高达
60%～ 80% ,表现为花叶、斑驳、卷叶、黄花、矮化等
典型症状 ,感病植株的根系细小 ,药用成分含量降
低 ,严重影响了丹参的产量和质量。为此对本病进行
了初步研究 ,在发病组织中没有发现真菌及细菌病
原 ,判断为病毒病原的可能性较大。我们根据世界上
已经报道的侵染唇形科植物的病毒种类 ,采用指示
植物、 DAS-ELISA、电镜观察及 RT-PCR分子检测
等进行了系统研究 ,发现了黄瓜花叶病毒和此病害
相关 ,并且可能为一新株系。
1　材料与方法
·1136· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 12期 2003年 12月
收稿日期: 2003-04-18基金项目:河北省科技攻关项目资助 ( 03220111)
* 通讯作者　 Tel: ( 0311) 765129　 E-mai l: w uzhiming71@ hotmai l. com
1. 1　材料:丹参退化病株经国家质检总局动植物检
疫所朱水芳博士鉴定 ,采自河北省农林科学院药用
植物研究中心实验基地 ,现保存在 - 70℃冰箱。主
要实验仪器 Labsystems Dragon Welscan MK 3酶
联检测仪 ,日立 H- 7500透射电镜 , Cradient cycler
PCR仪 ,安莱中国凝胶成像系统 , DU 640核酸蛋白
分析仪。
1. 2　试剂: CMV DAS-ELISA检测试剂盒购于
Agdia公司 , PCR引物由北京赛百盛基因技术有限
公司合成 , P1互补引物: 5′tagcagaactg ccaactca-
cg t 3′, P2同 源 引 物: 5′tcg cgcat tcaaat tcgag t t3′,
RN A提取试剂盒购于上海生工生物工程技术服务
有限公司 , pfuDN A聚合酶购于北京鼎国生物技术
发展中心 , M -MLV逆转录酶 , DN A片断回收试剂
盒采用 Promega公司产品 , pMD 18-T V ector购于
宝生物工程 (大连 )有限公司 ,大肠杆菌 ( E. coli )
DH5α由国家动植物检疫实验所保存。
1. 3　方法
1. 3. 1　生物学接种:按常规汁液摩擦接种法 ,将丹
参带病毒的叶片汁液接种到白肋烟、三生烟、心叶
烟、苋色黎 4种指示植物上 , 3次重复 ,然后罩上防
虫网培养 , 30 d后观察病毒症状反应。
1. 3. 2　电镜观察检测:黄瓜花叶病毒的提纯采用裴
美云等的方法 ,稍作修改 [1 ]。 复染采用 2%醋酸铀 ,
然后进行电镜观察 ,拍照。
1. 3. 3　 DAS-ELISA检测 CMV DAS-ELISA检测
过程按照其说明书进行 ,酶联仪上信号检测选用临
界值进行 ,滤光片选用 405 nm。
1. 3. 4　 RT-PCR检测:具体方法见文献 [2 ]。
RNA的提取:按照 RNA提取试剂盒提供的方
法 ,从具典型症状的病叶中提取总 RN A。
cDN A第一链的合成:在 Eppendirf管中加入 1
μL模板 RNA, 1μL引物 primel ( 20μmol) ,无菌重
蒸水 9μL,置于 90℃水浴 3 min,放冰上 5 min,加
入 1μL Rnasin ( 20 U) , 2μL DTT( 0. 1 mol) , 4μL
5× first st rand buffer ( 0. 25 mol /L Tris· Cl pH
8. 2, 25 mmol /L MgCI2 , 0. 25 mol /L KCl, 0. 25 mg
BSA) 1μL dN TP ( 10 mmol /L )、 1μL M-MLV逆
转录酶 ( 200 U /μL) , 42℃水浴 60 min。
PCR扩增: 将下列组份依次加入 0. 5 mL Ep-
pendirf管中 ,无菌重蒸水 ( 40μL)、 10× PCR buf fer
( 5μL)、 cDN A模板 ( 1μL)、引物 prime 1( 1μL)、引
物 prime 2( 1μL)、 dN TP( 10 mmol /L)、 1μL( 3 U)
pfuDN A聚合酶 ,在 PCR仪上按以下条件扩增: 94
℃变性 3 min后 , 94℃ 40 s, 56℃ 60 s, 72℃ 60 s,
共进行 35个循环 ,循环结束后 72℃保温 10 min。
电泳分析: 灌制 1. 2%琼脂糖凝胶 ,取 8μL
PCR产物加 1μL凝胶加样缓冲液 ( 6× loading-
buf fer )混匀后点样 ,以 3～ 5 V /cm的电压在 T AE
( 0. 04 mol /L Tris-乙酸 0. 001 mo l /L ED TA)电泳 ,
直至溴酚兰迁移至 2 /3处时结束电泳 ,溴乙锭 ( 0. 5
μg /μL)染色 20 min,在凝胶成像系统成像。
克隆及测序: 将 PCR条带切胶 ,用 DNA片断
回收试剂盒回收目的片断 ,克隆至 pMD18-T Vec-
to r上 ,转化大肠杆菌 ( E. col i ) DH5α感受态 ,转移
100μL菌液涂布于 LB固体培养基 , 37℃过夜 ,挑
取白色菌落于 LB液体培养基 , 37℃振荡培养至
OD值到 0. 4～ 0. 6,从此菌液中用碱裂解法提取质
粒 ,并命名为 pMDCMV,将此质粒于上海基康生物
有限公司完成序列测定。
1. 3. 5　同源性分析:将所测序列输入 GenBank,在
网上进行 BLAST,分析丹参分离物的序列与已经
报道的序列的相似性。
2　结果与分析
2. 1　生物学鉴定:我们在河北、山东等地对丹参进
行了实地系统调查 ,观测到田间典型病毒症状的病
叶及丹参植株 ,表现了典型的花叶、植株矮化及叶片
褪绿黄化畸形等症。在供试的集中植物摩擦接种后 ,
在白肋烟 (N icotiana tabacum-white burley. )表现
系统花叶、褪绿斑、三生烟 (N . tabacum-Samsun)植
株表现局部枯斑、卷叶、矮化系统症状 ,这与国际上
黄瓜花叶病毒敏感植物的报道较一致。 在心叶烟
( N . glutinosa )上未表现症状。苋色黎 (Chenopodi-
um . amaranticola )症状不明显。
2. 2　电镜观察:电镜放大倍数为 30 000倍 , V表示
视野中的病毒粒子 (紧靠于 V字左边 ) ,观测到的粒
子经测量比较 ,其直径约为 29～ 30 nm (图 1) ,与
CMV病毒球形粒子相近 ,电镜视野中未见线状及
杆状病毒。
2. 3　 DAS-ELISA检测:利用 CMV抗血清进行了
DAS-ELISA检测 (表 1) ,在检测的 15个丹参样品
中 , 10个为样品阳性。 1～ 3表示酶联板列数 , A～ H
表示酶联板的行数 ,共 24个孔。 B1, B2, B3孔表示
空白对照 ,实验过程中不加入二抗 ( Alk Phos En-
zyme Conjuga te)抗体 ; C1, C2, C3孔表示阴性对照 ,
实验过程中抗原采用健康烟草叶片研磨液 , H1,
H2, H3表示阳性对照 ,实验过程中抗原采用试剂盒
阳性研磨液 ;其余 15个孔 ,实验过程中抗原采用田
·1137·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 12期 2003年 12月
图 1　提纯病毒粒体形态电镜观察 ( 1∶ 30 000)
Fig. 1　 Electron micrograp of purif ied virus
particles ( 1∶ 30 000)
表 1　 CMV DAS-ELISA检测结果
Table 1　 Results of CMV DAS-ELISA detect ion
A B C D E F G H
1 + - - - + + - +
2 + - - + + - + +
3 - - - + + + - +
间采集的丹参叶片 ,其他各个步骤相同。数据处理过
程中 ,临界值方程等于 2* N ( N表示阴性对照数据 ,
大于 2* N的数据用“+ ”表示阳性结果 ,小于 2* N
的数据用“ - ”表示阴性结果 )。
2. 4　 RT-PCR检测: 根据 CMV的外壳蛋白基因
( CP)的序列 ,由 prime 1和 prime 2扩增出 409 bp
的 CMV衣壳蛋白部分片断 (图 2) ,与预期扩增大小
一致。第 2泳道产物由提纯病毒合算进行 RT-PCR
得到 ,第 3泳道产物扩增 LB平板上的白色菌落得
到 ,第 4泳道产物则由扩增 pMDCMV得到。
2. 5　 PCR产物序列分析: 将克隆载体 pMDCMV
进行序列分析 ,结果表明 ,所克隆的 DNA片段的长
度为 409 bp(图 2)。 下划线所标示的序列依次为
prime 2的同源和 prime 1的互补序列。 CMV衣壳
1-标准分子量 ( Marker) ,由上至下依次是 1 000, 750, 500, 300,
200, 100 bp　 2～ 5-CMV外壳蛋白基因部分片断 RT-PCR产物
6-空白对照
1-Ladder DNA M ark er, si ze f rom upper to dow n are: 1 000,
750, 500, 300, 200, 100 bp　 2- 5-CMV coat p ro tein g ene par-
tial f ragmen t RT-PCR p rod ucts　 6-blank cont rol
图 2　 CMV CP基因部分片段的 RT-PCR产物
Fig. 2 RT-PCR products of CMV CP
gene partial fragment
蛋白基因的完整编码区位于 RNA 3上 ,全长 657
bp,编码一条 218个氨基酸的蛋白多肽链 ,在 CMV
的系统侵染中有重要作用 ,但与病毒基因组 RNA
的复制无关 [3 ]。所克隆的 409 bp的核苷酸中 ,前 345
bp的核苷酸序列 (从第一个核苷酸到用* 标示的第
344个核苷酸止 )为编码衣壳蛋白的 C端的 114个
氨基酸的序列 ;后 64 bp核苷酸序列为非编码区。在
GenBank中用 BLAST进行同源性比较分析 ,与登
录号为 AF127977基因序列 ( Cucumber mosaic
v irus strain K 3a pro tein and coat protein genes,
complete cds,黄瓜花叶病毒 K株系 )的同源性最为
接近 ,达到 98% ,说明我们分离的丹参病毒分离物
确实为 CMV的一个株系 ,记为 CMV-Dan。见图 3。
3　讨论
TCGCGCAT TCAAA TTCGAGT T AATCCTT TGCCGAAAT T TGAT TCT ACCGTGT GGGTGACAGT CCGT AAAGT TCCTGCCT
CCTCGGACT TGTCCGTCGCCGCCATCT CTGCTAT GTT TGCGGACGGAGCCTCACCGGT ACTGGT TT ATCAGT ATGCT GC
A TCCGGAGTCCAAGCCAACAATAAACTGT TGTGT GATCTT TCGGCGATGCGCGCTGAT AT AGGCGACATGCGT AAGTAC
GCCGT ACTCG TGTA TTCAAAAGACGATGCACTCGAGACGGATGAGCT AGTACTTCATGT CGACATCGAGCACCAACGCA
TTCCCACAT CTGGGGTGCTCCCAGT TT GA* ATCCGTGT TT CCCAGAACCCTCCCTCCAGT CCT GAGGCGGGA ACGT GAG
TTGGCAGT TCTGCT A
图 3　黄瓜花叶病毒丹参株系的部分外壳蛋白基因序列
Fig. 3　Nucleotide sequence of partial coat protein gene of CMV-Danshen
　　丹参在引种栽培中常发生叶枯病 ( Septoria
sp. )、白绢病 (齐整小核菌 , Sclerotium rolf sii ) ,菌核
病 (唐菖蒲核盘菌 , Sclerotinia gladiol i )、根腐病 (木
贼镰孢 , Fusarium equiseti )、紫纹羽病 (紫卷提子菌 ,
Helicobasidium mompa )、根结线虫病 (南方根结线
虫 , Melaidogyne hapla )、菟丝子病 (中国菟丝子 ,
Cuscuta chinensis )等真菌为主的病害。 但是国内外
至今未见丹参病毒病原病害的报道 ,已经报道的唇
形科病毒病害有串红上的 CMV [4 ] ,湿地鼠尾草上的
CMV
[ 5]等。我们从田间采集具有典型症状的丹参病
叶及植株 ,进行了病毒检测 ,首次检测到了 CMV的
存在 ,为栽培丹参提纯复壮、种苗的无毒化生产 ,以
·1138· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 12期 2003年 12月
及监测田间 CMV的发病情况打下基础。
CMV为雀麦花叶病毒科 ( Bromoviridae)黄瓜
花叶病毒属 (Cucumovirus )的典型成员 ,为单链正义
RNA病毒 [6 ] ,其基因组由 3个正链的 RNA分子组
成 ,按相对分子质量由大到小的顺序分别命名为
RNA1, RN A2, RN A3。它具有很广的寄主范围 ,可
以侵染 1 000多种双子叶和单子叶植物 [7 ] , CMV的
分布是世界性的 ,能通过蚜虫以非持久性的方式 ,机
械接种或带毒种子进行传播 ,是农作物以及重要经
济作物上危害最大的病毒之一。 在实践中 CMV的
检测主要是应用酶联检测 ,已经能检测到亚组 ,接种
鉴定 ,电镜检测 ,核酸杂交 , RT-PCR检测都有报
道 [8, 9 ]。依照血清学数据、衣壳蛋白的多肽图谱、核酸
杂交以及核苷酸序列的相似性将 CMV分成了亚组
Ⅰ 和亚组Ⅱ ,我们依照 MARILYN [10 ]提供的方法进
一步分析后 ,将其命名为黄瓜花叶病毒丹参分离物 ,
并归入 IB亚组。因只对此分离物的外壳蛋白基因进
行了部分克隆 ,所以若要进行更进一步的确认 ,还需
重新设计引物 ,进行全序列的克隆分析。
致谢: 中国农业大学生物学院农业生物技术重
点实验室牛胜乌博士、植物保护学院蔡祝南教授在
电镜观察时给予指导。
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RP-HPLC法测定寻骨风中马兜铃酸 A的含量
刘　超 ,陈　蕴 ,赵小磊 ,龚立雄 ,王　林
(河南省中药研究所 ,河南 郑州　 450004)
　　寻骨风为马兜铃科植物绵毛马兜铃 Aris-
tolochia moll issima Hance的全草。寻骨风药材收载
于河南省药材标准 [1 ] ,马兜铃酸 A为其有效活性成
分 [2 ] ,具有抗癌、抗感染、抗早孕及增强吞噬细胞的
活性等药理作用 ,其对肝、肾的毒性剂量为有效剂量
的 1 000倍 [3～ 5 ]。近年来马兜铃酸引起的肾损害“马
兜铃酸肾病” ( AAN )已日益受到临床重视并对用药
情况进行了调查 [ 6 ]。目前马兜铃酸 A的测定方法多
为 HPLC法 ,涉及的药材有青木香、马兜铃及关木
通 [7～ 11 ]等 ,但有关寻骨风中马兜铃酸 A的定量分析
未见报道 ,所以 ,本实验对药材的马兜铃酸 A含量
进行测定研究。
1　仪器、试药及样品
Waters液相色谱仪 , 481紫外检测器 , 510泵
(美国 ) , Echrom 98色谱工作站 (大连依利特 )。色谱
纯甲醇 (上海陆忠 ) ;水为乐百氏纯净水 (广东乐百
氏 ,规格 550 mL,批号: 20020406) ;马兜铃酸 A对
照品 (中国药品生物制品检定所 ,批号: 746- 9002) ;
其他试剂均为分析纯。寻骨风药材购自郑州市及禹
州药市。 由本所药材研究室安维教授鉴定。
2　方法与结果
2. 1　色谱条件: ODS C18色谱柱 ( 4. 6 mm× 200
mm , 5μm) (大连化学物理研究所 ) ;流动相为甲醇-
水-醋酸 ( 65∶ 35∶ 1) ;流速 1. 0 mL /min;柱温 25
·1139·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 12期 2003年 12月
收稿日期: 2003-03-18作者简介:刘　超 ( 1962- ) ,河南郑州人 ,工程师 , 1988年毕业于河南中医学院 ,研究方向为中药新药研制及质量标准研究。
Tel: ( 0371) 6323448　 Fax: ( 0371) 6323880　 E-mail: l c621023@ sina. com