全 文 ：·药理实验与临床观察·
青心酮对肺动脉内皮细胞及红细胞生物力学特性的影响
黄云峰 1 ,叶笃筠 2 ,吴　萍 2 ,吴泽志 3
( 1. 武警湖北总队医院 麻醉科 ,湖北 武汉　 430061; 2. 华中科技大学同济医学院 病理生理学教研室 ,湖北 武汉　 430073;
3. 重庆大学生物工程研究院 ,重庆　 400000)
摘　要: 目的　观察青心酮对红细胞及肺血管内皮细胞生物力学特性的影响。方法　体外培养肺动脉内皮细胞 ,分
对照组及青心酮大、中、小剂量处理内皮细胞 ,用微管吸吮技术观察细胞的变形过程。结果　与未用药组比较 ,在加
用青心酮 30 min后 ,中、大剂量组内皮细胞弹性系数 K 1和 K 2增大 ,粘性系数 _ 变化不大 ;红细胞表观变形指数和
最大变形值也明显增加。结论　青心酮可以增加肺血管内皮弹性 ,并使红细胞变形能力明显增强 ,这可能是青心酮
改善血液循环的生物力学机制。
关键词: 青心酮 ;微管吸吮 ;内皮细胞 ;红细胞
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 07 0623 03
Effect of DHAP on biomechanic properties of pulmonary
artery endothelial cells and erythrocytes
HUANG Yun-feng
1 , YE Du-jun
2 , WU Ping
2 , WU Ze-zhi
3
( 1. Depar tment of Anesth esiolog y, Hospital of Hubei Genera l Team of Armed Police T roop, Wuhan 430061, China;
2. Depa rtment o f Pa thophy siolog y , Tong ji Medical Co lleg e of Hua zhong Univ ersity o f Science and Tech no lo gy ,
Wuhan 430073, China; 3. Institute of Bio eng ineering , Chongqing Univ er sity , Chongqing 400000, China )
Abstract: Object　 To observ e the ef fects of 3, 4-dihydroxyacetophenol ( DHAP) on biomechanic prop-
erties o f cultured pulmonary artery endo thelial cells and isola ted ery th rocy tes. Methods　 Cul tured in vit ro
pulmonary artery endoth elial cell s w ere t rea ted w ith large-, middle-and small-doses of DHAP, and a con-
trol g roup was set up. The defo rmation process was observ ed using micropipet te aspiration tech nique. Re-
sults　 Compa red wi th the contro l group, the elastic coefficiency K 1 and K 2 o f endothelial cells in la rg e-and
middle-dose g roups increased significantly , while the v iscosi ty coefficiency changed insigni ficantly in 30
min of giving DHAP. The apparent defo rmation index and maximum deforma tion value of ery th ro cy tes a l-
so increased ma rkedly. Conclusion　 DHAP can increase pulmona ry blood vessel endothelial elastici ty and
ery throcy te deformability obviously, thus improving the blood ci rculation.
Key words: 3, 4-dihydroxyacetopheno l ( DHAP) ; micropipet te aspiration; endo thelial cells; ery thro-
cyte
　　青心酮又名 3, 4-二羟基苯乙酮 ( DHAP) ,是从
中药秃毛冬青叶中提取的一种有效成分 ,临床上已
将其用于妊高症 ( PIH)、胎儿宫内发育迟缓
( IU GR)及慢性阻塞性肺疾患 ( CO PD)等的治疗 ,
用于改善血液循环取得了良好疗效 [ 1～ 3]。其作用机
制较复杂 ,如促使 PGI2的合成 ,抑制血小板聚集 ,增
加内皮细胞延迟整流钾电流等 [ 4, 5 ]。但青心酮对血管
和红细胞生物力学特性的直接影响尚无文献报道。
生物力学因素在心血管病症发生发展中的作用
日益为人们所重视。 其中剪切力对血管的作用最受
关注 ,目前认为剪切力是与心血管疾病最相关的血
流动力学因素 [6 ]。 而血管内皮细胞 (V EC)及血液
细胞对剪切力的反应十分复杂 ,其粘弹性、变形性等
生物力学特性可以影响其对剪切力的反应。那么 ,一
些改善血液循环的药物如 DHAP能否通过调节血
管内皮细胞或红细胞对剪切力的响应起作用 ,值得
探讨。本实验应用微管吸吮技术 ,观察了 DHAP对
血管内皮细胞和红细胞的生物力学特性的影响 ,旨
·624· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
收稿日期: 2001-12-12
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( No. 30070929)
作者简介:黄云峰 ( 1974-) ,男 ,主治医师 ,硕士学位 , 2000年毕业于华中理工大学同济医学院 , 2000年 7月在武汉武警总医院麻醉科工
作至今。
在从生物力学角度探索活血化瘀中药的作用机制。
1　材料与方法
1. 1　材料: 2周龄雄性 Wista r大鼠 (第三军医大学
实验动物中心 ) ,体重 80～ 100 g , DHAP (北京制药
工业研究所 ) , DM EM (高糖 , Hyclone ) , FB ( Hy-
clone) ,胰蛋白酶 ( GIBCO) ,胶原酶 ( GIBCO) , PBS
Hands液 (自配 )。 倒置显微镜 ( Axiov er 35, Zeiss
Co. ) ,微管拉制器 ( P97, Sut ter Instrument Co. ) ,
CO2培养箱。
1. 2　肺动脉内皮细胞培养:按文献 [4 ]方法取大鼠肺
动脉中段 ,用酶消化法获取内皮细胞进行培养 ,待细
胞长满瓶底后进行传代。
1. 3　微管吸吮操作:将约 0. 5 m L细胞悬液注入一
特定的圆形小室内 ,置于倒置显微镜载物台上。微管
与显微操作器相连并通过它连接于压力控制和记录
系统。利用显微操作器控制微管尖部靠近细胞表面 ,
使细胞的一小部分吸入微管。细胞在微管内变形过
程由图像处理仪记录 ,并通过回放所记录的图像测
量细胞的变形值。
1. 4　内皮细胞粘弹性模型和红细胞变形性分析:参
照 Sung [6 ]等的方法 ,采用标准线性固体模型即 Ke-
lin模型分析内皮细胞粘弹特性。该模型用本构方程
表示为 σij′+ μ/K 2σij′= eij′+ eij′μ( 1+ K 1+ K 2 )。K 1和
K 2代表瞬间产生与负荷成正比的变形 ,主要反映细
胞的初始变形程度 ,_ 代表任一瞬间产生与负荷成
正比的变形速度 ,反映了细胞变形对时间的依赖性。
本实验以 K 1 / (K 1+ K 2 )作为衡量细胞弹性指标 ,以
_ (K 1+ K 2 ) /K 1× K 2作为细胞蠕动时间 ,以此分析
内皮细胞粘弹性变化。 将红细胞吸吮实验数据按文
献 [6 ]进行归一化处理后 ,定义了一个表观变形指数
(appa rent defo rmability index , ADI) ,即单位负压
下被吸入管内的红细胞长度与微管内径之比 ,以
ADI表示红细胞通过微管的能力。 用最大变形
( Dmax )反映其变形性。
1. 5　给药方法:将传代 3～ 4次的 PAEC用胰蛋白
酶消化后 ,用 DMEM培养液清洗吹打分离后随机
分成对照组、 DHAP小剂量 ( 1. 32× 10- 5 mol /L )、
中剂量 ( 1. 32× 10- 4 mo l /L ) 和大剂量 ( 6. 60×
10- 4 mo l /L) 4组。抽取大鼠血液 ,抗凝离心分离出
红细胞后 ,再用等渗液稀释至 1 500 /mL,按上述方
法分组和给药 ,给药后温育 30 min后行微管吸吮。
2　结果
2. 1　 DHAP对培养 PAEC粘弹特性的影响:肺血
管内皮细胞于 2 940 N /m2的阶跃负压作用下 ,在微
管内变形经历了一个初始快速响应和其后稳定增加
的时间过程 ,测得对照组和 DHAP不同剂量组
PAEC弹性系数 K 1、 K 2和粘性系数 _ 值 (见表 1) ,
DHAP小剂量组与对照组无显著差异。
表 1　 DHAP对肺血管内皮细胞粘弹特性
的影响 ( n= 120, x± s )
组　别 剂　量
( mol /L)
K 1
( dyn /cm2 )
K 2
(d yn /cm2)
_
( dyn. s /cm2)
对　照 　 - 492. 03± 116. 51 363. 76± 98. 51 196. 35± 126. 48
DHAP 1. 32× 10- 5 524. 31± 113. 70 360. 35± 127. 73 203. 29± 78. 99
1. 32× 10- 4 543. 94± 69. 11* 427. 13± 113. 31* 150. 08± 39. 15*
6. 60× 10- 4 509. 92± 229. 19* * 560. 14± 144. 43* * 185. 59± 74. 71
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
2. 2　 DHAP对红细胞变形性的影响: 在微管内 ,大
鼠红细胞于 98～ 196 Pa的负压作用下 ,首先经历
200～ 300 ms的快速变形 ,然后 ,呈缓慢稳定增加历
程 ,测得正常对照和 DHAP不同剂量组红细胞
ADI和 Dmax ,见表 2。
表 2　 DHAP对大鼠红细胞变形性的影响 (n= 120, x± s )
组　别 剂　量 ( mol /L) ADI Dmax (μm)
对　照 　 - 0. 88± 0. 15 0. 77± 0. 14
DHAP 1. 32× 10- 5 1. 08± 0. 21 1. 17± 0. 15*
1. 32× 10- 4 1. 68± 0. 21* 1. 91± 0. 32*
6. 60× 10- 4 4. 56± 0. 86 5. 36± 1. 01* *
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
3　讨论
血液的流动对 V EC施加各种物理力 ,如剪切
力、周期性牵拉力及血液静水压力等。细胞生物力学
研究结果表明 ,剪切力对 V EC的生物学效应产生
影响尤为明显 ,有人认为剪切力是与心血管疾病最
相关的血流动力学因素 [6 ]。另一方面 ,血管内的红细
胞的变形能力对维持血管中的正常流态 ,保证微循
环灌注 ,以及器官、组织氧和营养物质的供应是十分
必要的 [ 7]。因而 ,研究活血化瘀中药对 V EC和 RBC
的生物力学的影响 ,以阐明其药理作用机制具有重
要的理论和实用价值。
微管吸吮技术被认为是一种评价单个细胞变形
的重要手段 [5 ]。 本研究发现 ,在一定负压的作用下 ,
DHAP使 PAEC粘弹系数 K 1、 K 2呈剂量依赖性增
加 ,而粘性系数 _ 变化不大。根据 Kelvin模型推导 ,
K 1与细胞的最大变形成反比 , K 1越大 ,其最大变形
越小 ,细胞的刚性和弹性阻力越大 ;而 K 1+ K 2与细
胞的初始变形成反比 , K 1+ K 2越大 ,其初始变形越
小 ,刚性也越大。这提示 DHAP使肺动脉 EC之弹
性响应降低。 DHAP增加 V EC刚性 ,降低细胞的最
大变形能力 ,这有利于减少血流对 V EC的损伤作
用。而 DHAP降低 V EC弹性响应能力 ,这使 V EC
在心血管周期收缩运动中 ,对相同血流流动、压力产
生的剪切应变变小和缓和。这种剪切应变的变化可
以缓冲血液流动剪切力对血管壁的损害 ,维护血液
的正常灌注。
与 DHAP对 V EC上述生物力学特性影响不
·625·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
同 , DHAP明显增加红细胞的 ADI和 Dmax ,表明
DHAP能增加红细胞变形性 ,这有利于红细胞通过
毛细血管 ,减少细胞间的叠连 ,降低血液粘度 ,疏通
微循环 ,从而活血化瘀。这一现象与以往临床观察发
现 DHAP能改善 IUGR患者血液流变学的结果相
吻合 [1 ]。 总之 ,本结果表明 , DHAP改善微循环的作
用 ,不仅与其增强 V EC刚性和降低其弹性 ,加强其
屏障作用有关 ,同时也与 DHAP增加红细胞变形性
有关。本实验将生物力学概念引入血液流变学相关研
究 ,从细胞变形性、粘弹性变化的角度分析了活血化
瘀中药的可能作用机制 ,具有重要的理论和实用价
值 ,也是血液流变学活性药物筛选的一种实用方法。
参考文献:
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Am J Physiol , 1994, 266: c628-636.
槲皮素对重组人蛋白激酶 CK2全酶的抑制作用及其动力学分析
刘新光 ,梁念慈
(广东医学院生物化学与分子生物学研究所 ,广东 湛江　 524023)
摘　要: 目的　观察槲皮素对重组人蛋白激酶 CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制。 方法　利用基因工程克
隆、表达和纯化获得重组人蛋白激酶 CK2α和 β 亚基 ,在体外等摩尔数混合构成有最大生物活性的重组 CK2全
酶 ,在不同条件下测定 CK2的活性。 CK2活性通过测定转移到 CK2底物上的 [γ-32 P ] AT P的 [32 P ]放射活度来
检测。 结果　重组人蛋白激酶 CK2是一种 Ca2+ 、 cAMP和 cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶 ,与天然 CK2的
性质一致。槲皮素对重组人 CK2全酶具有很强的抑制作用 , IC50为 522 nmol /L,抑制作用大于 CK2已知抑制剂
DRB和 A3。 槲皮素对重组人蛋白激酶 CK2的动力学研究表明:它与 ATP和酪蛋白分别呈竞争性和非竞争性抑
制作用。 结论　槲皮素是 CK2有效抑制剂 ,该抑制作用可能是槲皮素抗肿瘤作用又一分子机制 ,为今后筛选更有
效的 CK2抑制剂提供了一种较为简便的筛选方法。
关键词: 蛋白激酶 CK2;重组蛋白 ;全酶 ;槲皮素 ; IC50;酶动力学
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 07 0626 04
Inhibitory effect of quercetin on recombinant human protein kinase CK2
holoenzyme and its kinetics analysis
LIU Xin-guang , LIAN G Nian-ci
( Institute of Bio chemistry & Mo lecula r Bio lo gy , Guangdong M edical Colleg e, Zhanjiang 524023, China )
Abstract: Object　 To study the direct ef fect of quercetin on recombinant human protein kinase CK2
holo enzyme and its kinetics. Methods　 Recombinant human pro tein kinase CK2α and β subunits w ere
cloned and expressed by gene engineering , and w ere purified. The tw o subunits w ere mixed a t the same
molar ratio , thus reconsti tuting CK2 ho loenzyme, w hich display ed the maximum bioactivi ty. The CK2 ac-
tivi ty was assayed by detecting incorporation of 32 P of [γ-32 P] A TP into the subst rate in the va rious condi-
·626· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
收稿日期: 2001-10-08
基金项目:广东省自然科学基金 ( 011766) ;广东医学院标志性成果扶持项目
作者简介:刘新光 ( 1964-) ,男 ,江西九江人 ,博士 ,副教授 ,硕士生导师 ,现任广东医学院医学检验系副主任 ,生化教研室主任。 1999年毕
业于中山医科大学生物化学与分子生物学专业 ,获医学博士学位。 主要研究方向是肿瘤生化 ,蛋白激酶的分子生物学与生化
药理学 ,目前负责省、厅、市和学院级科研项目 7项 ,以第一作者发表科研论文 26篇 ,获湛江市科技进步一等奖 1项 (第一完
成人 )。 Tel: ( 0759) 2388582,个人主页 h t tp: / /hom e. gdmc. edu. cn / jyx /jian /person /lx g. htm E-mail: xig liu@ gdmc. edu. cn